專利名稱：一種中國(guó)被毛孢的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物菌種的生產(chǎn)方法，具體是指一種中國(guó)被毛孢新品系的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草是中國(guó)的一種名貴中藥材，野生資源遭到極度采集，隨市場(chǎng)需求日益增大，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)貨源緊缺，且價(jià)格較高，因此，利用從天然冬蟲(chóng)夏草中分離得到的冬蟲(chóng)夏草菌種——中國(guó)被毛孢，通過(guò)深層發(fā)酵培養(yǎng)，將發(fā)酵產(chǎn)物過(guò)濾干燥制成成品，因其質(zhì)量穩(wěn)定， 價(jià)格合理，越來(lái)越受到青睞。以中國(guó)被毛孢為菌種發(fā)酵生產(chǎn)制品(如百令膠囊)，不但有效緩解了冬蟲(chóng)夏草市場(chǎng)供需矛盾，延緩草原環(huán)境惡化，而且使冬蟲(chóng)夏草變得有名但不再昂貴， 能讓更多的老百姓享用得起。但是也存在許多不足，人們使用人工冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵制品后容易上火，少數(shù)產(chǎn)生胃腸道不良反應(yīng)，而天然冬蟲(chóng)夏草性溫平，幾乎很少發(fā)生，所以人工冬蟲(chóng)夏草制品在療效上與天然冬蟲(chóng)夏草存在一定的距離；另外，人工冬蟲(chóng)夏草發(fā)酵廢液的排放對(duì)環(huán)境也造成比較大的污染。解決這些問(wèn)題，一方面需要從優(yōu)良菌種的篩選著手，另一方面從發(fā)酵工藝和提取工藝上進(jìn)行改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提出了一種生產(chǎn)工藝相對(duì)簡(jiǎn)單、操作方便的生產(chǎn)方法。本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的一種中國(guó)被毛孢的生產(chǎn)方法，其特征在于包括下述步驟(1)半固體菌種斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基溶于煮沸的水中，調(diào)節(jié)pH至7. 2，在121°C、滅菌30分鐘，制成斜面培養(yǎng)基； 冷卻后放入28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，確認(rèn)無(wú)雜菌污染后，接入中國(guó)被毛孢菌種，均勻涂布；控制溫度17 19°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30 45天；然后，放入0 4°C冰箱保存；其中斜面培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉1.5%， 麩皮1 5%，葡萄糖2%，KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%,瓊脂1.8%，其余為水；(2)液體菌種搖瓶培養(yǎng)把斜面培養(yǎng)后的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶，在搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 17 19°C，搖床轉(zhuǎn)速100 120rpm，培養(yǎng)8 13天，接入無(wú)菌接種罐內(nèi)，供液體菌種增殖培養(yǎng)接種用；搖瓶菌種培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉1.5%， 麩皮 1 5%，葡萄糖 2% ,KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%，其余為水；(3)液體菌種增殖培養(yǎng)液體菌種增殖培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0. 03 0. 05Mpa，通氣量 1 0.2，罐溫17 19°C，攪拌速度120 140rpm，培養(yǎng)7 12天；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖糖量快速下降，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲稠密，菌絲體體積濃度不低于13%，檢查無(wú)雜菌后，移入發(fā)酵罐；液體菌種增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉 1.5%，麩皮 1 5%，葡萄糖 2% ,KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01 %，其余為水； ⑷發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.03 0.05Mpa，通氣量1 0.2，罐溫17 19°C，攪拌速度120 140rpm，培養(yǎng)9 12天，菌絲體體積濃度達(dá)25%以上，葡萄糖降至1. 0%，視為發(fā)酵終點(diǎn)，放罐；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 %，麩皮5 %，玉米粉1.5%， 葡萄糖 2%，魚(yú)蛋白胨 0. 25%，肉蛋白胨 0. 75%，酵母膏0. 1%,KH2PO4O. 02%,MgSO4O. 01%, 其余為水；調(diào)節(jié)pH至7.2 ；(5)固液分離經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離器分離，分離出菌絲體和發(fā)酵清液；(6)膜分離將固液分離過(guò)程中的發(fā)酵清液用300-4000分子量的膜分離器分離，得膜分離濃液；本發(fā)明中的膜分離為常規(guī)的分離方法，選擇相應(yīng)的膜材料、操作條件即可，且目前市場(chǎng)上有大量的膜材料可以選擇。(7)菌絲體與分離濃液干燥將膜分離濃液噴入干燥器，與菌絲體一同干燥，干燥溫度在80-100°C，得產(chǎn)品。作為優(yōu)選，上述生產(chǎn)方法的步驟(1)中國(guó)被毛孢菌種的接入在18°C，接種量為 10%，且為火焰保護(hù)無(wú)菌接種。作為優(yōu)選，上述生產(chǎn)方法的步驟⑴中所述的脫脂蠶蛹粉的含油量低于3%。作為優(yōu)選，上述生產(chǎn)方法中的脫脂蠶蛹粉，玉米粉，麩皮用10-20倍水提取，經(jīng)過(guò)濾后，水提液加入培養(yǎng)基。作為優(yōu)選，上述生產(chǎn)方法中的中國(guó)被毛孢菌種是指經(jīng)以上生產(chǎn)方法所得產(chǎn)品的水提物加入鼠肥大細(xì)胞RBL-2H3株進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)60小時(shí)，其細(xì)胞指數(shù)降低至1. 5以下的中國(guó)被毛孢菌株。本發(fā)明中國(guó)被毛孢是微生物界真菌的一個(gè)正式種名，曾用名為蝙蝠蛾被毛孢。本發(fā)明中在半固體培養(yǎng)基和液體中所使用含油量< 3%脫脂蠶蛹粉，可以更好地促進(jìn)中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)，達(dá)到更好的技術(shù)效果。另外，在半固體培養(yǎng)基和液體中加入2. 1-3% 脫脂蠶蛹粉、玉米粉、麩皮水提液有利于中國(guó)被毛孢生長(zhǎng)，使菌絲量在上述時(shí)間內(nèi)達(dá)到生產(chǎn)方法規(guī)定的要求。本發(fā)明中液體菌種增殖培養(yǎng)是根據(jù)發(fā)酵罐的體積和接種量的要求，可以是二級(jí) (次)、三級(jí)、四級(jí)菌種放大培養(yǎng)。本發(fā)明中所指細(xì)胞指數(shù)(Cell Index)是一個(gè)現(xiàn)有技術(shù)中公開(kāi)了的概念，具體在參考文獻(xiàn)(ASSAY and Drug Development Technologies,Volume 2， Number 4,2004)中所公開(kāi)。有益效果通過(guò)本發(fā)明結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)的方法，將二十多個(gè)分離所得的中國(guó)被毛孢菌種的水提物加入無(wú)血清培養(yǎng)的鼠肥大細(xì)胞株RBL-2H3培養(yǎng)基，獲得細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息，用天然冬蟲(chóng)夏草作對(duì)照，加入水提物的60小時(shí)內(nèi)，細(xì)胞指數(shù)降低至1. 5以下的中國(guó)被毛孢培養(yǎng)物，篩選為優(yōu)良菌種。 通過(guò)對(duì)工藝的改進(jìn)取中國(guó)被毛孢常規(guī)發(fā)酵物，固液分離，發(fā)酵清液用300 4000 分子量的膜分離器分離，得膜分離濃液，濃液與菌絲體混合或分別干燥，得中國(guó)被毛孢的發(fā)酵終產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)對(duì)優(yōu)良菌種的篩選，使冬蟲(chóng)夏草制品在功效上與天然冬蟲(chóng)夏草更接近，經(jīng)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)證明，具有增強(qiáng)免疫功能和補(bǔ)肺強(qiáng)腎功能。中國(guó)被毛孢發(fā)酵物處理工藝的改進(jìn)，大大提高了產(chǎn)量，同時(shí)也減少了環(huán)境污染，而且可控性大大增強(qiáng)。
具體實(shí)施例方式下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施作具體說(shuō)明實(shí)施例1一種中國(guó)被毛孢的生產(chǎn)方法，通過(guò)下述步驟進(jìn)行實(shí)施(1)半固體菌種斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基溶于煮沸的水中，調(diào)節(jié)pH至7. 2，在121°C、滅菌30分鐘，制成斜面培養(yǎng)基； 冷卻后放入28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，確認(rèn)無(wú)雜菌污染后，接入中國(guó)被毛孢菌種，均勻涂布；控制溫度17 18°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間40天；然后，放入3°C冰箱保存；其中斜面培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1%，玉米粉1. 5%，麩皮1. 5%，葡萄糖2%,KH2PO4O. 02%, MgSO4O. 01%，瓊脂1.8%，其余為水；其中接種量為15% ；(2)液體菌種搖瓶培養(yǎng)把斜面培養(yǎng)后的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶，在搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 17°C，搖床轉(zhuǎn)速IOOrpm，培養(yǎng)9天，接入無(wú)菌接種罐內(nèi)，供液體菌種增殖培養(yǎng)接種用；搖瓶菌種培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 %，玉米粉1. 5 %，麩皮2 %，葡萄糖2 %， KH2PO4 0.02%，MgSO4O. 01%，其余為水;(3)液體菌種增殖培養(yǎng)液體菌種增殖培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.03Mpa，通氣量1 0.2， 罐溫18°C，攪拌速度120rpm，培養(yǎng)8天；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖糖量快速下降，菌絲生長(zhǎng)旺盛， 菌絲稠密，菌絲體體積濃度不低于13%，檢查無(wú)雜菌后，移入發(fā)酵罐；液體菌種增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 %，玉米粉1. 5 %，麩皮2 %，葡萄糖2 %， KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%，其余為水；(4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.04Mpa，通氣量1 0. 2，罐溫 18°c，攪拌速度120rpm，培養(yǎng)9天，菌絲體體積濃度達(dá)25%以上，葡萄糖降至1.0%，視為發(fā)酵終點(diǎn)，放罐；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 %，麩皮5 %，玉米粉1.5%， 葡萄糖 2%，魚(yú)蛋白胨 0. 25%，肉蛋白胨 0. 75%，酵母膏0. 1%,KH2PO4O. 02%,MgSO4O. 01%, 其余為水；調(diào)節(jié)pH至7.2 ；(5)固液分離經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離器分離，分離出菌絲體和發(fā)酵清液；此步驟為本行業(yè)內(nèi)的常規(guī) 操作方法。(6)膜分離將固液分離過(guò)程中的發(fā)酵清液用3000分子量的膜分離器分離，得膜分離濃液；(7)菌絲體與分離濃液干燥將膜分離濃液噴入干燥器，與菌絲體一同干燥，干燥溫度在80-100°C，得產(chǎn)品。本產(chǎn)品經(jīng)使用驗(yàn)證，具有良好的效果。實(shí)施例2與實(shí)施例相同的方法，通過(guò)下述步驟進(jìn)行實(shí)施(1)半固體菌種斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基溶于煮沸的水中，調(diào)節(jié)pH至7. 2，在121°C、滅菌30分鐘，制成斜面培養(yǎng)基； 冷卻后放入28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，確認(rèn)無(wú)雜菌污染后，接入中國(guó)被毛孢菌種，均勻涂布；控制溫度18 19°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間45天；然后，放入4°C冰箱保存；其中斜面培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2.9%，玉米粉1. 5 %，麩皮4. 5 %，葡萄糖2 %，KH2PO4O. 02 %， MgSO4O. 01%，瓊脂1.8%，其余為水；其中接種量為15% ；中國(guó)被毛孢菌種的接入在18°C, 接種量為10%，且為火焰保護(hù)無(wú)菌接種；其中脫脂蠶蛹粉的含油量低于3% ；本實(shí)施例中的中國(guó)被毛孢菌種是指經(jīng)以上生產(chǎn)方法所得產(chǎn)品的水提物加入鼠肥大細(xì)胞RBL-2H3株進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)60小時(shí)，其細(xì)胞指數(shù)降低至1. 5時(shí)的中國(guó)被毛孢菌株；(2)液體菌種搖瓶培養(yǎng)把斜面培養(yǎng)后的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶，在搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度 18°C，搖床轉(zhuǎn)速120rpm，培養(yǎng)13天，接入無(wú)菌接種罐內(nèi)，供液體菌種增殖培養(yǎng)接種用；搖瓶菌種培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2.8%，玉米粉1.5%，麩皮4%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%,其余為水；(3)液體菌種增殖培養(yǎng)液體菌種增殖培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.04Mpa，通氣量1 0.2， 罐溫19°C，攪拌速度140rpm，培養(yǎng)12天；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖糖量快速下降，菌絲生長(zhǎng)旺盛， 菌絲稠密，菌絲體體積濃度不低于13%，檢查無(wú)雜菌后，移入發(fā)酵罐；液體菌種增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 8 %，玉米粉1. 5 %，麩皮4 %，葡萄糖2 %， KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%，其余為水；本實(shí)施例中脫脂蠶蛹粉，玉米粉，麩皮用10-20倍水提取，經(jīng)過(guò)濾后，水提液加入
培養(yǎng)基；(4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.05Mpa，通氣量1 0. 2，罐溫 18°c，攪拌速度140rpm，培養(yǎng)11天，菌絲體體積濃度達(dá)25%以上，葡萄糖降至1.0%，視為發(fā)酵終點(diǎn)，放罐；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1%，麩皮5%，玉米粉1.5%， 葡萄糖 2%，魚(yú)蛋白胨 0. 25%，肉蛋白胨 0. 75%，酵母膏0. 1%,KH2PO4O. 02%,MgSO4O. 01%, 其余為水；調(diào)節(jié)pH至7.2 ；(5)固液分離經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離器分離，分離出菌絲體和發(fā)酵清液；此步驟為本行業(yè)內(nèi)的常規(guī)操作方法。(6)膜分離 將固液分離過(guò)程中的發(fā)酵清液用2000分子量的膜分離器分離，得膜分離濃液；(7)菌絲體與分離濃液干燥本產(chǎn)品經(jīng)使用驗(yàn)證，具有良好的效果。
權(quán)利要求
1.一種中國(guó)被毛孢的生產(chǎn)方法，其特征在于包括下述步驟(1)半固體菌種斜面培養(yǎng)培養(yǎng)基溶于煮沸的水中，調(diào)節(jié)PH至7. 2，在121°C、滅菌30分鐘，制成斜面培養(yǎng)基；冷卻后放入28°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天，確認(rèn)無(wú)雜菌污染后，接入中國(guó)被毛孢菌種，均勻涂布；控制溫度17 19°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間30 45天；然后，放入0 4°C冰箱保存；其中斜面培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉1.5%，麩皮 1 5%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 02%, MgSO4O. 01%，瓊脂 1. 8%，其余為水；(2)液體菌種搖瓶培養(yǎng)把斜面培養(yǎng)后的菌種接種到裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶，在搖床震蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度17 19°C，搖床轉(zhuǎn)速100 120rpm，培養(yǎng)8 13天，接入無(wú)菌接種罐內(nèi)，供液體菌種增殖培養(yǎng)接種用；搖瓶菌種培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉1.5%，麩皮 1 5%，葡萄糖 2%，KH2PO4O. 02%，MgSO4O. 01%,其余為水；(3)液體菌種增殖培養(yǎng)液體菌種增殖培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0. 03 0. 05Mpa,通氣量 1 0.2，罐溫17 19°C，攪拌速度120 140rpm，培養(yǎng)7 12天；當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖糖量快速下降，菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌絲稠密，菌絲體體積濃度不低于13%，檢查無(wú)雜菌后，移入發(fā)酵罐；液體菌種增殖培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 3.0%，玉米粉 1. 5%，麩皮 1 5%，葡萄糖 2%, KH2PO4O. 02%, MgSO4O. 01%，其余為水；(4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)在培養(yǎng)罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為罐壓0.03 0.05Mpa，通氣量1 0.2，罐溫 17 19°C，攪拌速度120 140rpm，培養(yǎng)9 12天，菌絲體體積濃度達(dá)25%以上，葡萄糖降至1. 0%，視為發(fā)酵終點(diǎn)，放罐；發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按重量百分比為脫脂蠶蛹粉2. 1 %，麩皮5 %，玉米粉1. 5 %，葡萄糖 2%，魚(yú)蛋白胨 0. 25%，肉蛋白胨 0. 75%，酵母膏 0. 1%,KH2PO4O. 02%,MgSO4O. 01%，其余為水；調(diào)節(jié)pH至7.2 ；(5)固液分離經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后的發(fā)酵液經(jīng)固液分離器分離，分離出菌絲體和發(fā)酵清液；(6)膜分離將固液分離過(guò)程中的發(fā)酵清液用300-4000分子量的膜分離器分離，得膜分離濃液；(7)菌絲體與分離濃液干燥將膜分離濃液噴入干燥器，與菌絲體一同干燥，干燥溫度在80-100°C，得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(1)中國(guó)被毛孢菌種的接入在 18°C，接種量為10%，且為火焰保護(hù)無(wú)菌接種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于步驟(1)中所述的脫脂蠶蛹粉的含油量低于3%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的脫脂蠶蛹粉，玉米粉，麩皮用 10-20倍水提取，經(jīng)過(guò)濾后，水提液加入培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的中國(guó)被毛孢菌種是指經(jīng)以上生產(chǎn)方法所得產(chǎn)品的水提物加入鼠肥大細(xì)胞RBL-2H3株進(jìn)行無(wú)血清培養(yǎng)60小時(shí)，其細(xì)胞指數(shù)降低至1. 5以下的中國(guó)被毛孢菌株。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種微生物菌種的生產(chǎn)方法，具體是指一種中國(guó)被毛孢新品系的生產(chǎn)方法。本發(fā)明使用鼠巨噬細(xì)胞培養(yǎng)獲得細(xì)胞動(dòng)態(tài)信息篩選出的中國(guó)被毛孢，經(jīng)多級(jí)培養(yǎng)發(fā)酵后，通過(guò)固液分離技術(shù)，將菌絲加以通過(guò)300-4000分子量的膜過(guò)濾后菌液干燥處理后，制成具有增加免疫功能的保健食品與藥品。該方法實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)業(yè)化冬蟲(chóng)夏草菌種的不穩(wěn)定性，從菌種篩選到培養(yǎng)發(fā)酵到固液膜處理，全程數(shù)字化標(biāo)準(zhǔn)控制，真正意義上實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化冬蟲(chóng)夏草的工藝，其精準(zhǔn)的篩選方法、快捷的生產(chǎn)速度、純凈的生產(chǎn)工藝、較低的生產(chǎn)成本，可以廣泛的為大眾所接受。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102220249SQ20111015687
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月13日
發(fā)明者徐洋, 柯越海, 翟云燕 申請(qǐng)人:杭州柯氏生物科技有限公司