專利名稱：一種烏梢蛇pcr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥及中藥材鑒定技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種能夠快速鑒定烏梢蛇的PCR檢測試劑盒。主要用于烏梢蛇藥材、含有烏梢蛇的制劑以及烏梢蛇活體材料的快速鑒定。
背景技術(shù)：
烏梢蛇為《中國藥典》(2005版)一部收載的一種常用中藥，來源于游蛇科動物烏梢蛇Zaocys dhumnades Cantor的干燥體。有祛風(fēng)、通絡(luò)、止疫之功效,用于風(fēng)濕頑痹,麻木拘攣，半身不遂，抽搐痙攣，瘰癘惡瘡。 鑒于烏梢蛇作為中藥的臨床功效確切，但商品來源復(fù)雜、藥材形態(tài)鑒別困難的現(xiàn)狀，我們在收集藥材的同時，對市場上烏梢蛇藥材流通情況進行了調(diào)查。商品流通中多以紅點錦蛇、黑眉錦蛇、玉斑錦蛇、王錦蛇、灰鼠蛇等來混作正品藥材進行銷售(王義權(quán)，周開亞.蛇類藥材的商品調(diào)查及鑒定.中藥材1996，19(6) :285)，這些品種多數(shù)與烏梢蛇同科不同屬，因其來源相近，造成鑒定困難。此外，藥材在加工處理時剖去內(nèi)臟后，要進行干燥熏黑處理，皮上的花紋特征、顏色幾近消失，難以辨認，而且其大小、形態(tài)特征與烏梢蛇相近，這是造成其性狀鑒別困難的另一重要原因。我們已于2004年3月I日申報了 “高特異性聚合酶鏈式反應(yīng)技術(shù)鑒別中藥材烏梢蛇真?zhèn)蔚姆椒ā钡陌l(fā)明專利(專利號200410006374. O)。由于專利中的DNA提取等方法操作具有一定的專業(yè)性，同時需要大量的配制試劑的時間，因此，在推廣應(yīng)用上存在一定的困難。同時，在以往的中藥材PCR分子鑒別中，很少設(shè)置PCR陽性和陰性對照或僅僅用相應(yīng)藥材提取的總DNA用做對照，這樣導(dǎo)致PCR鑒別的準確率得不到有效的控制。本專利則在上述專利的基礎(chǔ)上，將所有需要應(yīng)用到的試劑集成為一個試劑盒，利用此試劑盒進行烏梢蛇的鑒別時，不須再配制任何試劑，而且操作人員無須特殊培訓(xùn)即可掌握操作，同時，以含有正品和偽品鑒別引物在內(nèi)相應(yīng)片段的質(zhì)粒DNA作為PCR的陽性和陰性對照，從而極大提高了 PCR鑒別的準確性，為烏梢蛇PCR鑒別的推廣應(yīng)用奠定了堅實的基礎(chǔ)。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何專門用于烏梢蛇鑒別的PCR試劑盒和相應(yīng)的PCR對照品。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明試劑盒包括DNA提取系統(tǒng)、PCR擴增系統(tǒng)和瓊脂糖凝膠檢測系統(tǒng)。其中DNA提取系統(tǒng)包括細胞核裂解液I，裂解緩沖液II，洗脫液，RNase酶溶液，蛋白酶K、滅菌雙蒸水、離心柱和離心管。PCR擴增系統(tǒng)包括2XTaq PCR Mix，檢測用引物、陽性對照品和陰性對照品和滅菌雙蒸水。瓊脂糖凝膠檢測系統(tǒng)包括瓊脂糖，50 X TAE緩沖液、IOObp DNA分子量標準、GelRed 核酸凝膠染色劑。檢測用引物為WS-F5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’和WS-R 5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’。質(zhì)控標準品中陽性對照品為含有烏梢蛇12S片段SEQ ID. 5的載體pGEM_WS，陰性對照品為含有烏梢蛇偽品灰鼠蛇12S相應(yīng)片段SEQ ID. 6的載體pGEM_HS。本試劑盒不同成分應(yīng)按要求分別存放于_20°C、4°C和室溫。存放于-20°c的成分應(yīng)盡量減少反復(fù)凍融。本發(fā)明建立了利用PCR技術(shù)檢測烏梢蛇真?zhèn)蔚脑噭┖?，利用所提供的試劑盒，不需單獨配制任何試劑，操作人員無須特殊培訓(xùn)即可掌握PCR鑒別的方法，為PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于藥用動植物的檢測提供了實用的技術(shù)。


圖I烏梢蛇PCR對照品特異性檢測
I.烏梢蛇總DNA為模板2. pGEM-ffS質(zhì)粒為模板3. pGEM-HS質(zhì)粒為模板圖2烏梢蛇藥材及其混淆品PCR鑒別結(jié)果I.陽性對照2.烏梢蛇3.虎斑頸槽蛇4.三索錦蛇5.雙全白花蛇6.灰鼠蛇7.滑鼠蛇8.紅點錦蛇9.王錦蛇10.赤鏈華游蛇11.中國水蛇12.短吻蝮蛇13.百花錦蛇14.眼鏡蛇15.赤練蛇16.鉛色水蛇17.金環(huán)蛇18.山烙鐵頭蛇19.黑眉錦蛇20.環(huán)紋華游蛇21.蘄蛇22.金錢白花蛇23.玉斑錦蛇24.空白M. marker (2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp)(下同)圖3 10個不同批次的烏梢蛇藥材PCR鑒別結(jié)果I.陽性對照2-11.烏梢蛇12.陰性對照13.空白圖4 10個不同批次的烏梢蛇炮制品PCR鑒別結(jié)果I.陽性對照2-11烏梢蛇12.陰性對照13.空白
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施例作進一步說明。應(yīng)該理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實施例I :烏梢蛇PCR檢測試劑盒的配置本實施例提供10次的檢測量以及各種組分的儲存條件，具體實施時可根據(jù)需要調(diào)整試劑盒內(nèi)配置的具體數(shù)量。
權(quán)利要求
1.一種快速檢測烏梢蛇的PCR試劑盒，其特征在于 由DNA提取系統(tǒng)、PCR擴增系統(tǒng)和瓊脂糖凝膠檢測系統(tǒng)組成； DNA提取系統(tǒng)由細胞核裂解I，裂解緩沖液II，洗脫液，RNA酶溶液，蛋白酶K、滅菌雙蒸水、離心柱和離心管組成； PCR擴增系統(tǒng)由2XTaq PCR反應(yīng)混合液，檢測用引物、陽性對照質(zhì)粒、陰性對照質(zhì)粒和滅菌雙蒸水組成； 瓊脂糖凝膠檢測系統(tǒng)由50 X TAE緩沖液、IOObp DNA分子量標準和GelRed 核酸凝膠染色劑組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR擴增系統(tǒng)，其特征是 檢測用引物為5’ GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’ 和 5’ CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的PCR擴增系統(tǒng)，其特征是 PCR陽性對照品為pGEM載體中插入片段為SEQ ID. 5的質(zhì)粒，陰性對照為pGEM載體中插入片段為SEQ ID. 6的質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明為一種利用PCR技術(shù)檢測烏梢蛇真?zhèn)蔚脑噭┖?，該試劑盒由DNA提取、PCR擴增和瓊脂糖凝膠檢測3個系統(tǒng)組成。試劑盒中PCR陽性對照為插入序列為SEQ ID.5的pGEM-WS質(zhì)粒，陰性對照為插入序列為SEQ ID.5的pGEM-HS質(zhì)粒。利用該試劑盒，不需配制任何試劑，只通過簡單的DNA提取、PCR擴增和電泳檢測即可完成對樣品真?zhèn)蔚蔫b別，具有操作簡單、特異性強、重復(fù)性好等優(yōu)點，可用于烏梢蛇藥材、含有烏梢蛇的制劑以及烏梢蛇活體材料的快速鑒定。
文檔編號C12Q1/68GK102827920SQ20111015786
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者黃璐琦, 崔光紅, 趙靜雪, 李昶, 唐曉晶 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所