專利名稱：人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬微生物動物細胞系領(lǐng)域，涉及一種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系及其制備方法，尤其涉及一種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H。
背景技術(shù)：
缺氧是包括乳腺癌在內(nèi)的惡性實體瘤發(fā)展過程中普遍存在的現(xiàn)象。缺氧會導致一部分腫瘤細胞死亡形成壞死灶，但大部分腫瘤細胞仍然可以生長。為了適應(yīng)或克服缺氧環(huán)境，腫瘤組織內(nèi)部會發(fā)生一系列生物化學和病理學的改變，稱之為缺氧反應(yīng)，主要包括無氧代謝增加、細胞凋亡抑制、新生血管形成、腫瘤局部浸潤和轉(zhuǎn)移能力增強等。目前認為缺氧反應(yīng)是通過缺氧誘導因子HIF-I來啟動和調(diào)節(jié)的，其下游基因包括碳酸酐酶CA-IX、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT-1、促紅細胞生成素ΕΡ0、血管內(nèi)皮生長因子VEGF、金
屬蛋白酶MMP、轉(zhuǎn)化生長因子TGF- α等，從而形成一系列由HIF-I介導的缺氧反應(yīng)調(diào)控通路。有關(guān)臨床研究結(jié)果顯示，缺氧與乳腺癌復發(fā)轉(zhuǎn)移和患者不良預后密切相關(guān)，乳腺癌復發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源則可主要歸咎于耐藥。耐藥機制是目前腫瘤研究中的熱點課題之一，而腫瘤中缺氧環(huán)境的存在則可能在誘導腫瘤產(chǎn)生耐藥過程中發(fā)揮一定作用。已有大量基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)表明，缺氧環(huán)境下的腫瘤細胞對化療、放療均不敏感；但是至今為止，國際上尚無穩(wěn)定的乳腺癌缺氧細胞系存在，而乳腺癌缺氧相關(guān)研究的必要前提則是缺氧細胞系的建立。Kurebayashi等于2001年報道了體外急性缺氧可使人乳腺癌細胞系ER-α的表達呈時間依賴性下調(diào)，并在恢復供氧后的一至兩周內(nèi)逐漸恢復到原來水平，同時缺氧還可抑制ER_a下游基因PR的轉(zhuǎn)錄。但是，由于新生血管的形成，因血管完全阻塞所造成的急性缺氧并不常見，相反，慢性間歇性缺氧則因腫瘤內(nèi)部各區(qū)域的氧供水平多處于波動狀態(tài)而廣泛存在。在2004年Cooper等發(fā)現(xiàn)慢性間歇性缺氧環(huán)境對人乳腺癌細胞系MCF-7中ER- α
表達的抑制作用與急性缺氧相比更為持久，并在人乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)ER- α下調(diào)與腫瘤壞
死灶的發(fā)生以及缺氧反應(yīng)標志蛋白HIF-I α、CA-IX和GLUT-I的高表達有關(guān)。由于慢性間歇性缺氧細胞系更接近人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境，因此若采用慢性間歇性缺氧細胞系進行研究相較急性缺氧細胞系而言更能真實反映人體內(nèi)缺氧對細胞生物學行為的影響及其相關(guān)作用機制。雖然Cooper等所作的研究是以人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系為載體，但尚存在以下缺陷
I.缺氧處理時間過短。Cooper等報道的缺氧細胞系僅經(jīng)歷了 3個缺氧周期，其中每個缺氧周期包括64小時的缺氧階段和8小時的恢復供氧階段。而在結(jié)束3個缺氧周期后，即將細胞置于正常供氧環(huán)境。Cooper等研究表明，與缺氧處理時相比，該細胞系在正常供氧I天后即恢復ER- α表達，其HIF-I α的表達卻消失殆盡。這一現(xiàn)象可從側(cè)面反映短短3個
周期的缺氧處理并不能建立生物學特性相對穩(wěn)定的慢性間歇缺氧細胞系。2.缺乏體內(nèi)實驗支持。雖然Cooper等通過體外實驗培養(yǎng)出慢性間歇性缺氧細胞系，但該細胞系是否能在裸鼠體內(nèi)存活并保留原有缺氧環(huán)境下的生物學特性卻并無證據(jù)支持。因此，目前，國際上尚無穩(wěn)定的乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系及其體內(nèi)實驗(如將慢性間歇性缺氧細胞系種植入裸鼠體內(nèi))的研究報道。鑒于此，目前慢性間歇性缺氧細胞系的培養(yǎng)現(xiàn)狀遠不能滿足缺氧相關(guān)研究的需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系及其制備方法，尤其涉及一種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H。本發(fā)明慢性間歇性缺氧細胞系能夠彌補現(xiàn)有缺氧研究載體的弊端，更能真實反映人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境對人乳腺癌細胞生物學特性的影響，從而提高缺氧相關(guān)研究的質(zhì)量水平。本發(fā)明提供了一種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，本發(fā)明中稱為MCF-7H。本發(fā)明采用人乳腺癌細胞系MCF-7作為建系來源(稱為源細胞系)，通過慢性間歇性缺氧的體外培養(yǎng)方式進行傳代，建成穩(wěn)定生長的慢性間歇性缺氧細胞系，獲得人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H。本發(fā)明中，將所述的人乳腺癌細胞系MCF-7，采用RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml鏈霉素進行培養(yǎng)；將上述細胞依次經(jīng)歷64小時的缺氧階段和8小時的正常供氧階段，培養(yǎng)持續(xù)兩個月以上，得到穩(wěn)定生長的慢性間歇性缺氧人乳腺癌細胞株MCF-7H，已于2011年5月20日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCCNo. 4902，分類命名人乳腺癌細胞，MCF-7H。所述的人乳腺癌MCF-7細胞株來源于69歲高加索女性的胸腔積液轉(zhuǎn)移性腺癌細胞，ATCC號HTB-22，由復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院自ATCC購入。本發(fā)明，缺氧階段是指將上述培養(yǎng)的人乳腺癌細胞系MCF-7細胞放置在37°C密閉的缺氧培養(yǎng)室中，該缺氧培養(yǎng)室中95% N2和5% CO2的混合氣體，氧含量控制在0. 02% 0. 5%的范圍。本細胞株具有以下生物學特征和遺傳學特征
能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，該細胞株體外培養(yǎng)生長良好，每3天傳代一次；MCF-7H細胞呈多極形上皮形態(tài)特征，聚集成片或團簇狀，胞漿豐富，貼壁生長，接觸性生長抑制消失，但與源細胞在形態(tài)上無明顯差異(如圖I所示)；本細胞株倍增時間約為8小時，而源細胞的倍增時間約為27小時，后者與ATCC提供的數(shù)據(jù)相符。CCK-8法描記的細胞生長曲線提示，MCF-7H細胞的增殖速度較源細胞明顯加快(P < 0. 05 ;如圖2所示);Transwell侵襲試驗的結(jié)果證實，MCF-7H較源細胞有更強的侵襲能力(P < 0.05 ;如圖3所示^Western blot結(jié)果表明，MCF-7H細胞缺氧反應(yīng)調(diào)控通路中的FIH-1、HIF-I α和CAIX蛋白表達水平明顯上調(diào)(如圖4所示)。體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，將本發(fā)明細胞株與源細胞分別接種至裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊后，雖然兩組成瘤率無明顯差異，但是本發(fā)明細胞株所成移植瘤的增長速度較源細胞組明顯加快(P < O. 05;如圖5所示)。免疫組化結(jié)果顯示，本發(fā)明細胞株所成移植瘤的FIH-UHIF-I α和CAIX蛋白表達水平仍持續(xù)上調(diào)。
本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系，具有與源細胞遺傳背景相同、增殖速度快、侵襲能力強的特點，能再現(xiàn)人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境下所產(chǎn)生的人乳腺癌細胞系，能彌補現(xiàn)有缺氧研究載體的弊端，更能真實反映人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境對人乳腺癌細胞生物學特性的影響，為理想可靠的研究模型，適用于在體內(nèi)、體外的缺氧相關(guān)研究，從而提高缺氧相關(guān)研究的質(zhì)量水平，具有重要的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用價值。


圖I是本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系與正常供氧人乳腺癌細胞系(源細胞系)體外增殖能力的比較圖，
其中顯示培養(yǎng)的10 -7!1細胞，400\ ;呈多極形上皮形態(tài)特征，聚集成片或團簇狀，胞衆(zhòng)豐富，貼壁生長。圖2是本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞MCF-7H與MCF-7源細胞體外增殖能力的比較。圖3是本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞MCF-7H與MCF-7源細胞體外侵襲能力的比較。圖4是本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞MCF-7H與MCF-7源細胞缺氧反應(yīng)調(diào)控通路表達的比較。圖5是本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞MCF-7H與MCF-7源細胞所成移植瘤增殖能力的比較。
具體實施例方式實施例I建立MCF-7H細胞系
采用人乳腺癌細胞系MCF-7作為源細胞，采用慢性間歇性缺氧的體外培養(yǎng)方式進行傳代，建成穩(wěn)定生長的慢性間歇性缺氧細胞系，獲得人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H，已于2011年5月20日保藏，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號CGMCC No. 4902，分類命名人乳腺癌細胞，MCF-7H。本實施例中，將所述的源細胞人乳腺癌細胞系MCF-7，采用RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml鏈霉素進行培養(yǎng)；依次經(jīng)歷64小時的缺氧階段和8小時的正常供氧階段，培養(yǎng)持續(xù)兩個月以上，得到穩(wěn)定生長的保藏編號為CGMCCNo. 4902的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H。所述的缺氧階段是指將上述培養(yǎng)的人乳腺癌細胞系MCF-7細胞放置在37°C密閉的缺氧培養(yǎng)室中，該缺氧培養(yǎng)室中95% N2和5% C02的混合氣體，氧含量控制在O. 02% O. 5%的范圍。
實施例2人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H體內(nèi)、外培養(yǎng)、實驗本發(fā)明的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H進行體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，所述細胞株具有以下生物學特性體外培養(yǎng)生長良好，每3天傳代一次；細胞呈多極形上皮形態(tài)特征，聚集成片或團簇狀，胞漿豐富，貼壁生長，接觸性生長抑制消失，與源細胞在形態(tài)上無明顯差異(如圖I所示);細胞株倍增時間約為8小時，而源細胞的倍增時間約為27小時，CCK-8法描記的細胞生長曲線提示，MCF-7H細胞的增殖速度較源細胞明顯加快(P < O. 05;如圖2所示);TranSWell侵襲試驗的結(jié)果證實，MCF-7H較源細胞有更強的侵襲能力(P < O. 05 ;如圖3所示);Western blot結(jié)果表明，MCF-7H細胞缺氧反應(yīng)調(diào)控通路中的FIH-I、HIF_1 α和CAIX蛋白表達水平明顯上調(diào)(如圖4所示)。
體內(nèi)試驗結(jié)果顯示，將本發(fā)明細胞株與源細胞分別接種至裸小鼠左側(cè)第二乳頭的脂肪墊后，雖然兩組成瘤率無明顯差異，但是本發(fā)明細胞株所成移植瘤的增長速度較源細胞組明顯加快(P < O. 05;如圖5所示)；免疫組化結(jié)果顯示，本發(fā)明細胞株所成移植瘤的FIH-UHIF-I α和CAIX蛋白表達水平仍持續(xù)上調(diào)。
權(quán)利要求
1.ー種人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，其特征在于，所述的細胞株為人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H，保藏編號=CGMCC No. 4902，分類命名人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，MCF-7H。
2.按權(quán)利要求I所述的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，其特征在于，所述的細胞株具有以下生物學特征和遺傳學特征能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，細胞呈多極形上皮形態(tài)特征，聚集成片或團簇狀，胞漿豐富，貼壁生長，接觸性生長抑制消失，與源細胞形態(tài)無差異；細胞株倍増時間為8小時，細胞的増殖速度較源細胞快，侵襲能力較源細胞強，細胞缺氧反應(yīng)調(diào)控通路中的FIH-I、HIF-I α和CAIX蛋白表達水平上調(diào)。
3.按權(quán)利要求I所述的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，其特征在于，所述的細胞株MCF-7H的源細胞為人乳腺癌MCF-7細胞，ATCC號ΗΤΒ_22。
4.按權(quán)利要求I所述的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，其特征在于，所述的細胞株MCF-7H的成瘤能力與MCF-7源細胞無明顯差異，成移植瘤的生長速度較MCF-7源細胞加快，同時其缺氧反應(yīng)調(diào)控通路的表達仍持續(xù)上調(diào)，能再現(xiàn)人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境下所產(chǎn)生的人乳腺癌細胞系。
5.權(quán)利要求I所述的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株的制備方法，其特征在于，采用慢性間歇性缺氧的體外培養(yǎng)方式進行傳代，建成穩(wěn)定生長的慢性間歇性缺氧細胞株，包括以下步驟 將所述的人乳腺癌細胞系MCF-7，采用RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、100IU/ml青霉素及100 μ g/ml鏈霉素進行培養(yǎng)；將上述細胞依次經(jīng)歷64小時的缺氧階段和8小時的正常供氧階段，培養(yǎng)持續(xù)兩個月以上，得到穩(wěn)定生長的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H ； 其中，缺氧階段是指將上述細胞放置在37°C密閉的缺氧培養(yǎng)室中，其中95% N2和5%C02的混合氣體，氧含量為O. 02% O. 5%。
6.權(quán)利要求I的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株細胞株在制備人體內(nèi)缺氧環(huán)境下的人乳腺癌細胞系中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬微生物動物細胞系領(lǐng)域，涉及人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞系。本發(fā)明以人乳腺癌細胞系MCF-7為源細胞，用慢性間歇性缺氧體外培養(yǎng)傳代，獲得穩(wěn)定生長的人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株MCF-7H，保藏編號CGMCC No.4902，分類命名人乳腺癌慢性間歇性缺氧細胞株，MCF-7H。該細胞呈多極形上皮形態(tài)特征，聚集成片或團簇狀，增殖速度快，侵襲能力增強，缺氧反應(yīng)調(diào)控通路的表達上調(diào)；成瘤能力與源細胞系無明顯差異，所成移植瘤的生長速度快，同時缺氧反應(yīng)調(diào)控通路的表達仍持續(xù)上調(diào)，能再現(xiàn)人體內(nèi)實際的缺氧環(huán)境下所產(chǎn)生的人乳腺癌細胞系，為較理想可靠的體內(nèi)、外缺氧相關(guān)研究模型。
文檔編號C12R1/91GK102827811SQ20111015831
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者邵志敏, 柳光宇, 殷文瑾, 雷莉, 羅建民, 歐周羅, 吳炅, 沈鎮(zhèn)宙 申請人:復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院