專利名稱：一種應(yīng)用于喜溫硫桿菌的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒pSDU1的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種帶有氯霉素抗性基因和多克隆酶切位點的可在喜溫硫桿菌中穩(wěn)定存在的小型化質(zhì)粒PSDU1。
背景技術(shù)：
喜溫硫桿菌(AcidithicAacillus caldus，簡稱A. caldus)是一類革蘭氏陰性的化能無機營養(yǎng)細菌，從還原性或部分還原性的硫化物的氧化中獲得生長所必須的能量和還原力，以卡爾文循環(huán)固定空氣中的CO2為碳源。該菌為極端嗜酸性的專性自養(yǎng)菌，最適PH為 2-3，在細菌冶金、煤的脫硫和含硫廢水的處理等方面有著重要的用途。A. caldus以其獨特的生活方式和在自然界中的特殊地位，長期以來受到人們的廣泛重視，在菌種的分離培養(yǎng)、生理代謝、工業(yè)應(yīng)用等方面做了大量的工作。近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，對硫桿菌中硫代謝及重金屬抗性基因在體外進行了大量的表達研究，為利用基因工程的手段對硫桿菌進行改造，使其更好地用于產(chǎn)生奠定了基礎(chǔ)。發(fā)明人的實驗室率先在國際上使用接合轉(zhuǎn)移的方法將外源基因通過大腸桿菌轉(zhuǎn)移到氧化硫硫桿菌、氧化亞鐵硫桿菌和喜溫硫桿菌體內(nèi)(Jin S, et al. , Appl. Environ. Microbiol. 1992, Vol. 58, No. 1,429-430 ；Peng J, et al. ， J. Bacteriol. 1994, Vol.176，No. 10,2892-2897 ；Liu X，et al.，J. Microbiol. Biotechnol.，2007，Vol. 17， No. 1，162-167)，并成功地建立喜溫硫桿菌的電轉(zhuǎn)化方法(Chen L，et al.，J. Microbiol. Biotechnol.，2010，Vol. 20, No. 1，39-44)。在喜溫硫桿菌基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，其特殊的酸性生長環(huán)境，很容易使抗生素失效，液體培養(yǎng)時，質(zhì)粒上的抗生素抗性基因無法起到有效的篩選作用，導致接合效率及電轉(zhuǎn)效率均較低，且有較多的假陽性轉(zhuǎn)化子菌落出現(xiàn)。因此，尋找理想的抗生素篩選標記，將有助于提高基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)的轉(zhuǎn)化效率，方便實驗操作。 目前在喜溫硫桿菌中廣泛應(yīng)用的穿梭質(zhì)粒PJRD215多克隆位點較少且大多為不常用酶切位點，操作繁瑣，限制了該質(zhì)粒的使用，此外，質(zhì)粒PJRD215較大(10，316bp)，使得質(zhì)粒的承載能力較小。因此，構(gòu)建一個具有理想篩選標記及多克隆位點的小型化穿梭質(zhì)粒，對喜溫硫桿菌的分子生物學研究及基因工程改造具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有質(zhì)粒的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種可在喜溫硫桿菌中應(yīng)用的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒。本發(fā)明所述應(yīng)用于喜溫硫桿菌的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒命名為PSDU1，由復制子oriV、自主復制蛋白基因r印、接合轉(zhuǎn)移基因mob、氯霉素抗性篩選基因cat、多克隆酶切位點MCS構(gòu)成。進一步的，上述質(zhì)粒pSDUl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。上述質(zhì)粒pSDUl的構(gòu)建方法
第一，構(gòu)建可在A.caldus中轉(zhuǎn)錄表達的氯霉素抗性基因，第一輪PCR以質(zhì)粒 PACYC184為模板，使用引物Prl和Pr2擴增出氯霉素抗性基因的開放閱讀框，以第一輪PCR 產(chǎn)物為模板，以引物Pr3和Pr2，進行第二輪PCR，引物Pr3中含有質(zhì)粒pBR322四環(huán)素抗性基因P2啟動子，通過兩輪PCR獲得了含有P2啟動子的氯霉素抗性基因第二，使用引物Pr4和Pr5擴增質(zhì)粒pJRD215的oriV、r印、mob部分；第三，將PCR擴增獲得的氯霉素抗性基因和oriV、r印、mob部分，分別用Alw 44 I、 EocT 22 I雙酶切，純化后，用T4 DNA連接酶連接環(huán)化，轉(zhuǎn)化E. coli DH 5α，利用氯霉素篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并進行驗證，該質(zhì)粒為構(gòu)建過程中的中間質(zhì)粒，命名為PSDU ；第四，引入多克隆酶切位點，使用引物Pr6和Pr7，以中間質(zhì)粒pSDU為模板，進行 PCR，將其線性化，引物Pr6、Pr7中分別含有來自質(zhì)粒pUC19的一部分多克隆位點，PCR產(chǎn)物純化后用Xba I單酶切，連接轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α，獲得轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒酶切并測序驗證，獲得了含有多克隆位點的新型質(zhì)粒，所述質(zhì)粒命名為PSDU1，由復制子oriV、自主復制蛋白基因r印、接合轉(zhuǎn)移基因mob、氯霉素抗性篩選基因cat、多克隆酶切位點MCS構(gòu)成。上述引物序列是Prl GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGGPr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTTPr3 CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGPr4 CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTPr5 CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCAPr6 CTAGTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTPr7 CTAGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA申請人:研究發(fā)現(xiàn)氯霉素在酸性環(huán)境下具有很高的穩(wěn)定性，且對A. caldus的生長有明顯的抑制作用，是一種理想的抗生素篩選標記。以質(zhì)粒pACYC184(可購自Biovector Co.，LTD)上的氯霉素抗性基因開放閱讀框為基礎(chǔ)，使用可以在A. caldus中發(fā)揮功能的質(zhì)粒pBR322(可購自Biovector Co.，LTD)的四環(huán)素抗性基因P2啟動子，構(gòu)建了可以在 A. caldus中發(fā)揮作用的氯霉素抗性基因，首次實現(xiàn)了氯霉素抗性基因在A. caldus中的表達，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了質(zhì)粒pSDUl。本發(fā)明所述的質(zhì)粒pSDUl在喜溫硫桿菌的分子生物學研究和基因工程改造具有巨大的應(yīng)用潛力。該質(zhì)粒使用氯霉素抗性為篩選標記，具有更高的轉(zhuǎn)化效率，電轉(zhuǎn)化喜溫硫桿菌的轉(zhuǎn)化效率比質(zhì)粒PJRD215提高了 30倍；該質(zhì)粒引入了質(zhì)粒pUC19的多克隆位點，方便了使用；該質(zhì)粒使用了質(zhì)粒PJRD215的oriV、rep, mob部分，具有廣宿主性，且在喜溫硫桿菌中具有較高的穩(wěn)定性；該質(zhì)粒大小僅為6. 41Λρ，具有更大的承載能力。


圖1為質(zhì)粒pSDUl的構(gòu)建流程圖。圖2為質(zhì)粒pSDUl的物理圖譜。
具體實施例方式實施例11、質(zhì)粒 pACYC184(購自 Biovector Co.，LTD)的提取使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver. 2. O 質(zhì)粒小提試劑盒(購自TaKaRa公司，貨號DV801A)，具體操作如下(1) 20ml LB培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的抗生素，接種1 %活化的菌種，37°C，200rpm,振蕩培養(yǎng) 12-14h。(2)取5ml培養(yǎng)好的菌液倒入離心管中，12，OOOrpm離心3min，吸凈上清。(3)向收集的菌體中加入250 μ 1的Solution I (含RNaseAl)，Vortex,充分懸浮細胞沉淀后的菌液轉(zhuǎn)移到1. 5ml的EP管中。(4)加入250 μ 1的Solution II，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)5_6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液。注菌體裂解一定要充分，形成透明溶液，且操作要迅速，此步不宜超過5min。(5)加入400 μ 1的4°C Solution III，輕輕地上下翻轉(zhuǎn)混合5_6次，直至形成緊實凝集塊，然后室溫靜置anin。(6) 12，OOOrpm 離心 lOmin。(7)將試劑盒中的 Spin Column 安置于 Collection Tube 上。(8)取上清輕柔地轉(zhuǎn)移至Spin Column中，然后12，OOOrpm離心lmin，棄濾液。(9)將 500 μ 1 的 RinseA 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 離心 30sec，棄濾液。(10)將 700 μ 1 的 RinseB 加入 Spin Column 中，12，OOOrpm 離心 30sec，棄濾液。(11)重復(9)，傾倒殘液后，再l，2000rpm離心lmin。(12)將Spin Column安裝于新的1. 5ml的離心管上，在Spin Column膜中央處加入30 μ L的65°C預(yù)熱的滅菌ddH20，室溫靜置^iin。(13) 12，OOOrpm 離心 Imin 洗脫 DNA。2、第一輪PCR，擴增氯霉素抗性基因的開放閱讀框利用引物Prl和1^2，以質(zhì)粒pACYC184為模板，PCR擴增出氯霉素抗性基因開放閱讀框。(1)上述引物序列如下Prl GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGGAGAAAAAAATCACTGG
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Pr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTT(2)反應(yīng)體系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premiχ PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Prl :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final cone.)；引物 Pr2 :1· 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (質(zhì)粒 pACYC184) 1 μ L· (Premix PrimerSTAR HS 購自 TaKaRa 公司，貨號DR040A)(3)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)具體步驟為94°C2min ；之后 98°C 10s, 55°C 15s，72°C lmin,共 29 個循環(huán)；最后72°C IOmin。(4) DNA凝膠電泳檢測，擴增出了氯霉素抗性基因的開放閱讀框。3、第二輪PCR，通過PCR在氯霉素抗性基因的開放閱讀框上加入P2啟動子以第一輪擴增的PCR產(chǎn)物為模板，以引物Pr3和Pr2，進行第二輪PCR，引物Pr3中含有P2啟動子，通過PCR擴增獲得了含有P2啟動子的氯霉素抗性基因，引物Pr2含有Alw 44 I酶切位點，Pr3含有EcoT 22 I酶切位點。(1)上述引物序列如下Pr2 CTTCGTGCACATTCATCCGCTTATTATCACTTPr3 CTGAGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTTATCATCCATAAGGTTTAATGCGGTAGTTTATCACAG(2)反應(yīng)體系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premix PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr2 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final conc.)；引物 Pr3 1. 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (第一輪 PCR 產(chǎn)物)1μ 1。(3)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)具體步驟為94°C2min ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C lmin，共 29 個循環(huán)；最后 72°C IOmin。(4) DNA凝膠電泳檢測，擴增出了含有P2啟動子的氯霉素抗性基因。實施例21、質(zhì)粒pJRD215(購自Biovector Co.，LTD)的提取參照實施例1中的1。2、從質(zhì)粒pJRD215中擴增oriV、mob、r印等基因質(zhì)粒利用引物Pr4和Pr5，從質(zhì)粒pJRD215中擴增oriV、mob、r印等基因，引物Pr4 中含有Alw 44 I酶切位點，Pr5含有EcoT 221酶切位點(1)上述引物序列如下Pr4 CTTCGTGCACTCCTTGCAATACTGTGTTPr5 :CTTCATGCATCCCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA(2)反應(yīng)體系的配制 ddH20 21 μ 1 ；Premix PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr4 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final conc.)；引物 Pr5 :1· 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA(質(zhì)粒 pJRD215) 1 μ L·(3)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)
具體步驟為94°C2min ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C 6min，*^ 個循環(huán)；最后 72°C IOmin。G) DNA凝膠電泳檢測，擴增出了質(zhì)粒pJRD215的ori V, mob, rep等基因。實施例31、構(gòu)建中間質(zhì)粒pSDU 將實施例1獲得的含有P2啟動子的氯霉素抗性基因和實施例2中PCR擴增獲得的質(zhì)粒PJRD215的ori V、mob、r印等基因，使用Alw 44 I,EcoT 22 I分別進行雙酶切，純化后利用 T4DNA 連接酶連接(10XT4DNALigase Buffer 1 μ 1，T4DNALigase Ιμ ，質(zhì)粒片段1.5μ 1，基因bphC片段6. 5μ 1，16°C，過夜連接)。將連接反應(yīng)液加入到50μ 1 E.coli DH5a感受態(tài)細胞中，輕混，冰浴30min， 42°C 90s，立即冰浴5min，加入0. 5ml LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)lh，將上述轉(zhuǎn)化液涂布于含有氯霉素的LB培養(yǎng)基固體平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取氯霉素篩選平板上的轉(zhuǎn)化子菌落，接種到含有氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中， 370C，振蕩過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒并進行酶切驗證，驗證正確的質(zhì)粒即為中間質(zhì)粒，將其命名為 pSDU。實施例41、質(zhì)粒pSDU線性化利用引物Pr6和ft7，以質(zhì)粒pSDU為模板，進行PCR，將其線性化，引物Pr6、Pr7中分別含有來自PUC19的一部分多克隆位點，且在5’端都含有)(ba I酶切位點。(1)上述引物序列如下Pr6 CTAGTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATGCATTCATGTTTGACAGCTPr7 CTAGTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTAGAGCATACATCTGGAAGCA(2)反應(yīng)體系的配制ddH20 21 μ 1 ；Premiχ PrimerSTAR HS :25 μ 1 ；弓| 物 Pr6 :1· 5 μ 1 (0. 3 μ M final cone.)；引物 Pr7 :1. 5μ 1(0. 3μΜ final conc.)；模板 DNA (中間質(zhì)粒 pSDU) :1μ1。(3)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)循環(huán)具體步驟為94°Canin ；之后 98°C 10s，55°C 15s，72°C 6. 5min，共四個循環(huán)；最后 72°C IOmin。(4)DNA凝膠電泳檢測，擴增出了線性化的質(zhì)粒pSDU。2、構(gòu)建質(zhì)粒 pSDUl:PCR產(chǎn)物純化后利用)(ba I單酶切，連接轉(zhuǎn)化Ε. coli DH5 α，獲得轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒進行酶切和測序驗證，從而獲得了含有多克隆位點的新型質(zhì)粒，將其命名為PSDU1。
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用于喜溫硫桿菌的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒命名為pSDUl，由復制子oriV、自主復制蛋白基因r印、接合轉(zhuǎn)移基因mob、氯霉素抗性篩選基因cat、多克隆酶切位點MCS構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述應(yīng)用于喜溫硫桿菌的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒PSDUl的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種應(yīng)用于喜溫硫桿菌的帶有氯霉素抗性基因的小型化穿梭質(zhì)粒pSDU1，由復制子oriV、自主復制蛋白基因rep、接合轉(zhuǎn)移基因mob、氯霉素抗性篩選基因cat、多克隆酶切位點MCS構(gòu)成。所述質(zhì)粒pSDU1使用氯霉素抗性為篩選標記，具有更高的轉(zhuǎn)化效率；引入了質(zhì)粒pUC19的多克隆位點，方便了使用；使用了質(zhì)粒pJRD215的oriV、rep、mob部分，具有較高的穩(wěn)定性；大小僅為6.4kbp，具有更大的承載能力，預(yù)示該質(zhì)粒在喜溫硫桿菌的分子生物學研究和基因工程改造中具有巨大的應(yīng)用潛力。
文檔編號C12N15/74GK102250939SQ20111015907
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者林建強, 林建群, 陳林旭 申請人:山東大學