專利名稱：一種et2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立及其在藥物篩選中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域和醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及其在藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
高血壓(hypertensive disease)是一種以動脈血壓持續(xù)升高為主要表現(xiàn)的慢性疾病，常引起心、腦、腎等重要器官的病變并出現(xiàn)相應(yīng)的后果。目前，高血壓已成為世界范圍內(nèi)引起心血管事件最重要的可改變因素之一，其危害日趨嚴(yán)重。我國現(xiàn)有高血壓人群已逾2億，其治療率和控制率仍然不高。內(nèi)皮素(Endothelin，ET)是日本學(xué)者Yanagisawa等從培養(yǎng)的豬主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中分離純化出一種活性多肽，其不僅存在于血管內(nèi)皮，也廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)心血管功能的重要因子，對維持基礎(chǔ)血管張力與心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)起重要作用。它是由21個氨基酸組成的多肽，分子量為2400D。ET2是內(nèi)皮素家族中 的一員，能夠作為配體與內(nèi)皮素受體相結(jié)合，介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞通路。內(nèi)皮素是迄今所知最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，其作用時間持久，是一種內(nèi)源性長效血管收縮調(diào)節(jié)因子。內(nèi)皮素還有強(qiáng)大的正性肌力作用，并且縮血管升血壓效應(yīng)還可反射性引起心率抑制，造成心肌供血不足.而且還可誘發(fā)心肌細(xì)胞糖超載，心律失常以及心肌能量代謝障礙。目前大量研究表礙嚴(yán)重心絞痛、AMI、心肌1/R損傷、經(jīng)皮腔內(nèi)成形術(shù)的機(jī)體ET合成和釋放礙顯增加，或血管對ET反應(yīng)性亢進(jìn)，都可能促進(jìn)上述病理過程的發(fā)生發(fā)展。而應(yīng)用ET抗體或ET阻斷劑則可防治高血壓等心腦血管疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法。本發(fā)明提供的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，包括以下步驟I)將ET2基因的編碼序列插入到真核表達(dá)載體的多克隆位點，得到重組表達(dá)載體；2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ET2的細(xì)胞系O上述真核表達(dá)載體具體可為pTagLite-Snap、pEGFP_N3等。為了便于對表達(dá)的ET2進(jìn)行細(xì)胞定位，可在真核表達(dá)載體上加入能于宿主中表達(dá)并產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因，如SNAP、GFP、YFP等。上述宿主細(xì)胞可為Hela細(xì)胞、MDA_MB_231細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞等。利用上述方法制備的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種篩選預(yù)防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細(xì)胞模型。實驗證明，本發(fā)明的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株對ET2阻斷劑和ET2抗體敏感，作用顯著。本發(fā)明的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為深入探索ET2在高血壓中的作用提供實驗技術(shù)平臺，可用于篩選預(yù)防和/或治療高血壓的藥物。


圖I為重組表達(dá)載體pTagLite-Snap_ET2的構(gòu)建流程2為各穩(wěn)定表達(dá)ET2細(xì)胞系的ET2表達(dá)量實驗結(jié)果圖3為ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對對ET2抑制劑的敏感性分析實驗結(jié)果
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，實施例僅為解釋性的，絕不意味著以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的具體構(gòu)建流程如圖I所示。實施例I.重組真核表達(dá)載體pTagLite-Snap_ET2的構(gòu)建下述實驗過程中所用的DNA引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。根據(jù)ET2蛋白編碼框的cDNA序列，設(shè)計PCR引物如下正向引物5’ ACTGATATCATGGTCTCCGTGCCTACCACCTGGT-3’ (下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識別位點)；反向引物5' -AACGAGCTCTCTCTTCCTCCACCTGGAATGTGTG-3 '(下劃線處為限制性內(nèi)切酶的識別位點)。取人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC并提取總RNA，將其反轉(zhuǎn)成cDNA，以該cDNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，用限制性內(nèi)切酶EcoRV和Xho I對純化回收后的產(chǎn)物進(jìn)行酶切,酶切產(chǎn)物再次進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收，得到ET2蛋白編碼框的cDNA序列。同時，將真核表達(dá)載體pTagLite-Snap (購自Cisbio公司)也用EcoR V和Xho I進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳純化和回收。用DNA連接酶連接上述擴(kuò)增得到的ET2蛋白編碼框的cDNA序列和真核表達(dá)載體pTagLite-Snap酶切后的產(chǎn)物,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli Top 10)感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于含有氨芐青霉素的LB平板上，挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，以檢測陽性克隆中插入序列的正確。測序結(jié)果表明，插入的534bp的ET2蛋白編碼框的cDNA序列與 GenBank Accession Number NM 001956 的自 5'端第 73 位-第 606 位的序列一致。將得到的重組表達(dá)載體命名為pTagLite-Snap-ET2。實施例2.ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的建立將上述步驟一得到的重組大腸桿菌利用Wizard Plus SVMinipreps (購自Promega)提取質(zhì)粒，得到高純度的重組表達(dá)載體pTagLite_Snap-ET2,將重組表達(dá)載體pTagLite_Snap-ET2 利用 Lipofectamine 2000 (購自 Invitrogen)轉(zhuǎn)染 Hela 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞24小時以上。用G418 (濃度為I μ g/ml)對重組HeLa細(xì)胞進(jìn)行篩選，經(jīng)多次篩選后，得到ET2的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。同時以轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞作為對照。選取四個ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，利用抗ET2的抗體(購自AbCam公司)進(jìn)行蛋白免疫印跡實驗，結(jié)果如圖2所示。其中，A-D分別表示不同的ET2的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的ET2表達(dá)量，Blank為轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的空白對照細(xì)胞,anti-Tubulin表示參照。結(jié)果表明，各ET2的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株均有不用程度的ET2表達(dá)。實施例3.ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系對ET2抑制劑的敏感性分析選用上述實施例2的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞進(jìn)行ET2抑制劑敏感性試驗。將ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞、轉(zhuǎn)入真核表達(dá)載體pTagLite-Snap的細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10%胎牛血清的培養(yǎng)基里，將處于旺盛生長期的細(xì)胞(一般在傳代后20小時左右)經(jīng)膜蛋白酶消化重懸后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，以每孔IO3到IO4個細(xì)胞的量接種于96孔板中進(jìn)行擴(kuò)增，且每孔細(xì)胞數(shù)目均勻。24小時后，分別加入ETl抑制劑(Ambrisentan)。抑制劑(Ambrisentan)的濃度分別為 10、20、30、40 和 50nM。而后按照 ET cell-based AssayKit(購自Cisbio)說明書進(jìn)行HTRF(均相時間分辨熒光)實驗，在加入抑制劑后的細(xì)胞孔板中加入標(biāo)記的一抗和二抗，孵育30min后在sunrise酶標(biāo)儀(TECAN公司產(chǎn)品)上于665 和620nm波長處讀取吸光值，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體結(jié)果如圖3所示。
權(quán)利要求
1.一種ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法,包括以下步驟 1)將ET2的編碼基因插入真核表達(dá)載體的多克隆位點，得到重組表達(dá)載體； 2)將步驟I得到的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)ET2的細(xì)胞系。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述真核表達(dá)載體為pTagLite-Snap或PEGFP-N3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為HeLa細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞或MCF-7細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法制備的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，其特征在于，所述ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系為SNAP-ET2穩(wěn)定表達(dá)的HeLa細(xì)胞系。
6.權(quán)利要求4-5中任一項所述的ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系在篩選預(yù)防和/或治療針對此靶點的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了ET2穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的制備方法，從而提供一種篩選預(yù)防和/或治療高血壓、缺血性心臟病的藥物的細(xì)胞模型。
文檔編號C12N5/10GK102827867SQ20111016085
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者譚初兵, 徐為人 申請人:天津藥物研究院