專利名稱：與黃瓜黃、綠色子葉連鎖的基因片段及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物基因工程技術領域，涉及黃瓜常規(guī)雜交育種、分子標記輔助育種的方法與技術，特別涉及與黃瓜子葉顏色連鎖的基因片段及用途。
背景技術：
植物葉色突變是自然界比較普遍的突變現(xiàn)象，主要來源于自發(fā)突變、人工誘發(fā)突變、插入突變和基因沉默突變等。葉色突變性狀作為一種指示性標記在遺傳育種中具有重要的利用價值，可以用于簡化良種繁育和雜交種生產(chǎn)，具有特殊優(yōu)良性狀的突變體還可為作物遺傳育種提供優(yōu)秀的種質資源。作者于2007年和2008年在華北類型黃瓜B180親本自交系群體中先后發(fā)現(xiàn)若干株突變類型單株，子葉黃色，邊緣漸漸轉綠至斑駁狀，真葉綠色，第一真葉比正常子葉綠色植株生長緩慢。將突變的黃色子葉類型植株全部自交，后代一致，無分離現(xiàn)象。以往對于黃瓜真葉葉色突變性狀的生理學、遺傳學等方面研究較多，對于黃瓜子葉顏色的研究則較少， 對黃瓜葉色突變性狀的分子機制研究也少有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術中的不足，提供與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段。本發(fā)明的第二個目的是提供與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段。本發(fā)明的第三個目的是提供與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段的用途。本發(fā)明的技術方案概述如下與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段，是SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列。與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段，是SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列。用與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段進行黃瓜分子標記輔助育種。利用本發(fā)明的與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段對構建的F2代分離群體和黃瓜種質資源進行子葉顏色鑒定，其結果與人工接種鑒定符合率達96. 77% (數(shù)據(jù)見表1)，與黃瓜子葉顏色相關基因的連鎖遺傳距離為3. 2cM。具有快速、準確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，本發(fā)明在黃瓜育種中進行資源篩選和純度檢測具有很大的應用價值。


圖1是與黃瓜綠色子葉和黃色子葉連鎖的特異DNA片段的獲得圖譜其中A(M)為 DNA標準；B(P1)為父本Q12綠色子葉連鎖的基因片段，C(P2)為母本B180H黃色子葉連鎖的基因片段；1 5為綠色子葉單株；6 10為黃色子葉單株。圖2是B180HXQ12雜交后代&代部分單株分離情況圖譜其中A(M)為DNA標準；B(P1)為父本Q12綠色子葉連鎖的基因片段，C (P2)為母本B180H黃色子葉連鎖的基因片段； 4、7、10、12、14 16、20、沘、33、；35為綠色子葉單株，17、22、25、四、31、；34、36、37為黃色子葉單株；1 3、5、6、8、9、11、13、18、19、21、23、24、26、27、30、32、38 為雜合類型單株(表型為綠色)，純合綠色子葉株僅有257bp基因片段，純合黃色子葉株僅有258bp基因片段，雜合類型單株同時具有257bp和258bp基因片段。圖3是與綠色子葉和黃色子葉連鎖的基因片段對比圖H為與黃色子葉連鎖的基因片段；L為與綠色子葉連鎖的基因片段；陰影部分為差異片段；下劃線標注為所用引物 E-AGA/M-AAG 的序列。
具體實施例方式本發(fā)明是在對黃色子葉親本B180H自交，后代一致無分離現(xiàn)象的基礎上，采用BSA 方法和AFLP技術分離與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段，進行序列同源性分析，為優(yōu)良種質資源的篩選、種子純度鑒定、分子標記輔助育種奠定 ■石出。為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明采用AFLP(Amplified fragment length polymorphism)分子標記技術結合BSA (Bulked segregant analysis，混合分離分析)法對黃瓜黃色子葉材料B180H的黃色子葉連鎖的相關基因和黃瓜綠色子葉材料Q12的綠色子葉連鎖的相關基因進行了分子標記研究。獲得與黃瓜黃色子葉連鎖的DNA基因片段1個，獲得與黃瓜綠色子葉連鎖的DNA基因片段1個，對這些片段測序后，其大小分別為258bp(SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列)、257bp(SEQ ID No. 2所述的核苷酸序列)。具體操作步驟如下1. FpF2及BC1群體的構建及表型鑒定以黃瓜黃色子葉材料B180H和綠色子葉材料Q12及其76株F1,124株F2、85株BC1H 和68株BC1L分離群體為試材，田間種植各世代群體，正常管理。待子葉出土至展平期、第一真葉期進行子葉顏色鑒定。2. DNA提取及AFLP分析體系剪取F2群體黃瓜幼嫩小葉，采用CTAB法單株提取DNA，_20°C保存。利用BSA法各取5個黃色子葉和綠色子葉單株DNA，構建成黃色子葉組和綠色子葉組用于AFLP引物的多態(tài)性篩選。AFLP yMfrWM^M Vos (a new technique for DNA fingerprinting [J]. Nucleic Acids Res, 1995,23(21) :4407-4414.)的方法。PCR反應體系為20 μ 1，黃瓜基因組DNA預擴增產(chǎn)物2. 5ng、引物各50ng、 dNTPO. 4mM、Mg2+L 5mM、1倍的PCR緩沖液、Taq DNA聚合酶1. 0單位；反應條件為94°C預變性180秒，94°C變性30秒，65°C退火30秒，72°C延伸120秒，每個循環(huán)退火溫度降低0. 7°C， 13個循環(huán)后，退火溫度降至56°C，再進行23個循環(huán)的擴增94°C變性30秒，56°C退火30秒， 再72°C延伸120秒。3.引物篩選和驗證在黃色/綠色子葉親本間篩選IOM對AFLP選擇性擴增引物，在雙親間產(chǎn)生多態(tài)性的引物Iio對，根據(jù)特異DNA片段在F2代分離群體中的表現(xiàn)情況，對照以上對各世代的苗期人工表型鑒定結果，發(fā)現(xiàn)引物E-AG/M-AAG在兩親本以及F2黃色/綠色子葉組單株進行PCR擴增，獲得了一個共顯性AFLP標記，進一步用E+3引物進行篩選，獲得與黃瓜子葉色基因緊密連鎖的AFLP標記E-AGA/M-AAG以及與黃瓜黃色子葉連鎖的DNA基因片段(SEQ ID No. 1所示)和與黃瓜綠色子葉連鎖的DNA基因片段(SEQ ID No. 2所示)。用該引物組合對組外的其它F2單株進行擴增，進一步確認所篩選到的標記。結果表明黃色子葉親本和黃色子葉組單株只有258bp的特異片段，綠色子葉親本只有257bp的特異片段，而綠色子葉組單株或者只有257bp的特異片段，或者同時具有258和257bp的特異片段，進一步說明黃瓜綠色子葉相對于黃色子葉為顯性。經(jīng)連鎖值測定，所篩選到的標記與目標基因——黃瓜子葉色相關基因緊密連鎖，遺傳距離為3. 2cM。所用AFLP引物E-AGA/M-AAG的堿基序列為E-AGA 5' -GACTGCGTAC CAATTCAGA-3‘ (SEQ ID No.3)M-AAG 5' -GATGAGTCCT GAGTAAAAG-3‘ (SEQ ID No. 4)4. PCR產(chǎn)物的回收和測序將擴增產(chǎn)物采用5%變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離；在擴增產(chǎn)物中加入變性凝膠上樣緩沖液，于95°C變性300秒，上樣于經(jīng)30分鐘預電泳的變性聚丙烯胺凝膠上，IOOff 恒功率電泳至溴酚蘭剛剛到達凝膠的另一端，凝膠經(jīng)硝酸銀染色后在可見光下觀察。5.序列分析采用煮沸法將兩個目的片段從銀染膠上回收、擴增，送至北京三博遠志生物工程公司進行測序。根據(jù)測序結果，與黃瓜黃色子葉連鎖的特異片段有258個堿基(SEQ ID No. 1所示)，與綠色子葉連鎖的特異片段有257個堿基(SEQ ID No. 2所示)，二者的差異在于1個堿基“A”的插入和缺失以及兩個“A<=i>G”的堿基突變(圖3)。實施例2利用獲得的與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段， 進行黃瓜分子標記輔助育種的方法，即對黃瓜種質資源或雜交種進行純度檢測或鑒定。用天津科潤黃瓜研究所育種一室育成的商品化品種，津優(yōu)3、津優(yōu)12、津優(yōu)30、津優(yōu)32、津優(yōu)38以及一些黃瓜種質資源W17-2-1、A13、P53、P54、P60_l、66、Q21等，采用苗期人工表型鑒定的方法對以上材料進行子葉色鑒定。根據(jù)實施例1獲得的與黃瓜子葉色基因緊密連鎖的AFLP特異引物E-AGA/M-AAG，對上述黃瓜材料基因組DNA進行PCR擴增，凡擴增產(chǎn)物出現(xiàn)258bp的特異片段的材料，為黃色子葉資源；凡擴增產(chǎn)物只出現(xiàn)257bp的特異片段的材料，為綠色子葉資源；凡同時擴增出該兩個特異片段的材料，為不純合材料。表1 F2群體單株的表型及標記分離統(tǒng)計
權利要求
1.與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段，其特征是SEQID No. 1所述的核苷酸序列。
2.與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段，其特征是SEQID No. 2所述的核苷酸序列。
3.用權利要求1所述的與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和權利要求2所述的與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段進行黃瓜分子標記輔助育種。
全文摘要
本發(fā)明公開了與黃瓜黃、綠色子葉連鎖的基因片段及用途，與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段是SEQ ID No.1所述的核苷酸序列；與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段是SEQ ID No.2所述的核苷酸序列。利用與黃瓜黃色子葉連鎖的基因片段和與黃瓜綠色子葉連鎖的基因片段對構建的F2代分離群體及黃瓜種質資源進行檢測，其結果與人工表型鑒定符合率達96.77％，與黃瓜子葉顏色相關基因的連鎖遺傳距離為3.2cM。本發(fā)明具有快速、準確、不受環(huán)境條件影響等優(yōu)點，對進行黃瓜分子標記輔助育種具有很大的應用價值。
文檔編號C12Q1/68GK102242130SQ201110161299
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者李淑菊, 楊瑞環(huán), 王惠哲, 管煒 申請人:天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司