專利名稱：一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及茶產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝方法。
背景技術(shù)：
茶黃素是紅茶加工過程中由兒茶素類氧化聚合形成的具有苯駢卓酚酮結(jié)構(gòu)的高活性二聚體，是傳統(tǒng)紅茶品質(zhì)優(yōu)劣的標(biāo)志性物質(zhì)，占紅茶干重的0. 39Γ2. 0%。最早是由 Roberts Ε. A. H在1957年首次發(fā)現(xiàn)。研究證實(shí)，茶黃素類共有十九種組分，其中茶黃素 (TF),茶黃素-3-沒食子酸酯(TF-3-G)，茶黃素-3，3’ -雙沒食子酸酯(TF-D-G)和茶黃素_3’ -沒食子酸酯(TF-3’ -G)是四種主要的茶黃素單體。茶黃素的提純物呈橙黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)237 240°C，易溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇和乙酸乙酯，難溶于乙醚，不溶于三氯甲烷和苯。水溶液呈弱酸性，PH約5. 7，在堿性溶液中有自動(dòng)氧化的傾向，且隨pH的增加而加強(qiáng)，在380nm和460nm處有最大吸收峰。近年來茶黃素優(yōu)異的生物學(xué)活性及藥理作用已被眾多動(dòng)物、藥理試驗(yàn)所證實(shí)，現(xiàn)已探明的功效作用有抗氧化活性、抗癌變、抗病毒抑菌活性、消炎、抗心血管疾病、健齒防齲等，被譽(yù)為茶葉中的“軟黃金”，越來越多地應(yīng)用于保健食品、添加劑、天然醫(yī)藥、高端日化等眾多領(lǐng)域。但從紅茶中提取分離生產(chǎn)茶黃素的成本高，因此旺盛的市場需求使得茶黃素的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)漸趨成為深加工技術(shù)研究的熱點(diǎn)之一。根據(jù)茶黃素的理化性質(zhì)和組成，茶黃素提取制備技術(shù)主要包括溶劑浸提法、體外氧化制備法、以及柱層析法。但是目前，工業(yè)化提取制備茶黃素一般不使用溶劑浸提法來制備，一方面是因?yàn)槿軇┙岱▋H能得到茶黃素粗提物，且存在處理步驟繁瑣、有機(jī)溶劑用量大、能耗較大、成本較高，以及有毒性等問題；更重要的一方面是因?yàn)榧t茶中茶黃素含量極低，僅為0. 3% 2. 0%，直接從紅茶中提取制備茶黃素，非常不經(jīng)濟(jì)。體外氧化制備法又分為酶促氧化制備法和化學(xué)氧化制備法兩種，化學(xué)法生產(chǎn)比酶法生產(chǎn)將投人更多的廢水處理系統(tǒng)費(fèi)用，并且化學(xué)法缺乏底物專一性，副產(chǎn)品復(fù)雜，產(chǎn)品純度受到一定限制。柱層析法的缺點(diǎn)是進(jìn)樣量小、分離時(shí)間長、成本高、柱的再生困難等，限制了它在工業(yè)化規(guī)模上的進(jìn)一步應(yīng)用。因此酶促氧化法是制備茶黃素的理想方法。由于其氧化酶介導(dǎo)合成過程中聚合反應(yīng)的復(fù)雜性，易造成目標(biāo)組分過度氧化，最終形成水不溶性茶褐素，影響茶黃素的制率及含量，目前尚未找到一種行之有效的規(guī)?；蛛x純化茶黃素的工業(yè)化技術(shù)或材料，這些均在一定程度上限制了高規(guī)格茶黃素生產(chǎn)的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。公布號(hào)為CN101691591A的2009年發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種茶黃素的產(chǎn)業(yè)化制備方法，包括下述順序步驟(1)制備得到富含茶多酚的乙酸乙酯溶液；( 分別將粉碎茶鮮葉和乙酸乙酯溶液投入氧化發(fā)酵罐，依次加入乙酸乙酯和緩沖溶液，常溫下通入空氣進(jìn)行攪拌氧化發(fā)酵，得到茶黃素酯相溶液；C3)茶黃素酯相溶液先經(jīng)過濾，再進(jìn)行濃縮后洗雜；(4)水相溶液濃縮后噴霧干燥得到低規(guī)格的茶黃素干粉；(5)酯相溶液濃縮以回收乙酸乙酯，然后加入水使茶黃素轉(zhuǎn)溶到水中；(6)轉(zhuǎn)溶后的茶黃素水溶液離心過濾得到純凈的茶黃素溶液；(7)將茶黃素溶液濃縮，然后噴霧干燥即得到茶黃素干粉。公布號(hào)為CN101886097A的2010年發(fā)明專利申請(qǐng)公開了一種高純度茶黃素的制備工藝，其制備過程為將綠茶經(jīng)乙酸乙酯提取后，進(jìn)行茶多酚底物組成和濃度的調(diào)整，然后加入用新鮮茶葉制備的發(fā)酵酶，通入氧氣進(jìn)行攪拌發(fā)酵，然后分離、濃縮、水洗、轉(zhuǎn)溶、柱分離，濃縮，最后進(jìn)行干燥、粉碎、過篩，從而得到合格的茶黃素產(chǎn)品。上述公開的專利申請(qǐng)所述生產(chǎn)茶黃素的技術(shù)方法均屬于體外酶促氧化制備法，但是所采取的提制轉(zhuǎn)化工藝可控度不高，反應(yīng)自身的復(fù)雜性往往使得生產(chǎn)中不能兼顧產(chǎn)品制率、純度及生產(chǎn)成本，限制了工藝技術(shù)的產(chǎn)能規(guī)模和推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
為解決目前茶黃素體外酶促氧化制備法中工藝因連串反應(yīng)不受控造成的產(chǎn)品氧化過度、收率不高的問題。本發(fā)明提供一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵工藝的過程控制，同時(shí)提高茶黃素產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率及規(guī)格，節(jié)省了后續(xù)精制純化的工藝成本。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，采用以下步驟
(a)底物溶液制備用磷酸鹽緩沖溶液制備以茶多酚為主要成分的底物溶液，其質(zhì)量濃度為^Γ5%。(b)酶催化劑制備將鮮茶樹葉進(jìn)行冷凍處理，取用冷凍后鮮葉進(jìn)行萎凋、破碎，然后用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行勻漿釋酶，得到酶催化劑，酶催化劑置于(T20°c環(huán)境中待用，鮮葉酶基質(zhì)和緩沖液的比例為Ig :2^20mlo對(duì)鮮葉酶源進(jìn)行萎凋-冷凍處理，最大限度激發(fā)了酶活效力，減少鮮葉酶源的儲(chǔ)備量，便于提高單位酶源鮮葉的催化效果，而且冷凍保鮮技術(shù)的合理使用克服了因時(shí)令變化造成鮮葉酶活性差異顯著的缺點(diǎn)，可使生產(chǎn)線全年生產(chǎn)，提高設(shè)備利用率，增加企業(yè)效
■、Λ
frff. ο(C)發(fā)酵制備向反應(yīng)器中加入乙酸乙酯與步驟(b)制備的酶催化劑，通入步驟 (a)制備的底物溶液，進(jìn)行氧化聚合反應(yīng)，酶促催化過程參數(shù)為底物溶液500m廣1000ml， 反應(yīng)體系水酯兩相總體積比為1 :0. 2 2，調(diào)控溫度25°C 35°C，底物溶液補(bǔ)加流速3(T80mL/ min，純氧流速0. 2^1. OL/min ；作為優(yōu)選反應(yīng)容器選為控溫生物反應(yīng)釜。(d)酯相分離反應(yīng)3(T60min后，收集(c)步驟的反應(yīng)液，濾除茶渣，離心萃取，收集含茶黃素的酯相溶液。水-酯雙液相反應(yīng)的特征在于通過非均相界面微水相反應(yīng)萃取，但該反應(yīng)的底物和產(chǎn)物均溶優(yōu)先于酯相層，反應(yīng)開始前，酶液進(jìn)入水相，底物進(jìn)入酯相，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)入酯層的目標(biāo)產(chǎn)物逐漸增多，但由于未參與反應(yīng)的兒茶素的存在，導(dǎo)致茶黃素不能完全在酯層富集，從而在水相中發(fā)生連串反應(yīng)，造成反應(yīng)過度；引入底物動(dòng)態(tài)補(bǔ)加模式，集成雙液相反應(yīng)和動(dòng)態(tài)控制的有益效果，實(shí)現(xiàn)酶促氧化過程中底物和產(chǎn)物動(dòng)態(tài)反應(yīng)平衡，通過酯相及時(shí)移出目標(biāo)產(chǎn)物，解除產(chǎn)物抑制，酯相溶劑可得以循環(huán)使用。(e)濃縮轉(zhuǎn)相向步驟(d)得到的茶黃素酯相溶液中加入蒸餾水50πιΓ 00πι1，濃縮轉(zhuǎn)相，回收乙酸乙酯，濃縮液與原液的濃縮體積比率達(dá)到1 :1(Γ20，蒸發(fā)溫度2(T60°C ；
(f)干燥將步驟(e)得到的濃縮液進(jìn)行干燥處理，得到茶黃素粗品。其中茶黃素含量高于50%。作為優(yōu)選，干燥方法可選自冷凍干燥或噴霧干燥。作為優(yōu)選，步驟(a)、(b)中的磷酸鹽緩沖溶液均為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液， 推薦pH為4. 0 6.0。作為優(yōu)選，步驟(b)中鮮葉冷凍處理溫度在-2。C ^-IO0C。作為優(yōu)選，在步驟(d)之后進(jìn)行洗雜分別用酸性溶液和堿性溶液對(duì)步驟(d)得到的酯相溶液進(jìn)行洗雜，萃取分層后，得到純化的酯相溶液，加入的洗滌溶液與酯相的體積比為0. 5^5:1,中酸性溶液為檸檬酸溶液，堿性溶液為弱堿性TriS-鹽酸溶液或碳酸氫鈉溶液。本發(fā)明采用茶黃素產(chǎn)品生物轉(zhuǎn)化的過程控制工藝，制備方法選用動(dòng)態(tài)補(bǔ)料多相態(tài)發(fā)酵反應(yīng)，優(yōu)選茶葉多酚氧化酶對(duì)茶多酚進(jìn)行催化氧化，確保過程反應(yīng)體系的生物包容性和效能穩(wěn)定性。一方面，采用緩沖液/乙酸乙酯非均相發(fā)酵-萃取分離工藝可維持微水相界面反應(yīng)動(dòng)態(tài)平衡，使界面周圍的產(chǎn)物茶黃素不斷進(jìn)入萃取相，降低水相反應(yīng)體系內(nèi)部的產(chǎn)物阻遏和連串反應(yīng)，利于目標(biāo)產(chǎn)物的定向累積。另一方面，底物以動(dòng)態(tài)補(bǔ)加方式持續(xù)進(jìn)入反應(yīng)體系，使氧化反應(yīng)正向進(jìn)行，阻遏目標(biāo)產(chǎn)物中的組分與短暫性過剩底物發(fā)生二次偶聯(lián)，形成非茶黃素類的水不溶性色素。通入純氧進(jìn)行多相態(tài)催化反應(yīng)，可以利用酯相溶劑的增氧功能，提高氧氣的有效利用度，縮短催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化時(shí)間。本發(fā)明方法采用了多相反應(yīng)-動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)化的反應(yīng)模式，使生物質(zhì)催化反應(yīng)在反應(yīng)器內(nèi)初步實(shí)現(xiàn)過程可控性較強(qiáng)、目標(biāo)產(chǎn)物制率穩(wěn)定、產(chǎn)品規(guī)格相對(duì)較高的轉(zhuǎn)化目標(biāo)。反應(yīng)基質(zhì)便捷易得，流程簡單，降本增效、可以擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是
(1)生產(chǎn)線全年生產(chǎn)，提高設(shè)備利用率，增加企業(yè)效益。(2)由于茶多酚原料供應(yīng)相對(duì)充足，進(jìn)行茶黃素轉(zhuǎn)化不需另建茶多酚生產(chǎn)線，只需生物反應(yīng)釜和下游的濃縮、純化裝置，及必要的物料傳輸、溶劑回收設(shè)備，較大限度地降低了設(shè)備成本和能耗，減省了茶多酚廢液的排污成本，同時(shí)提高了單產(chǎn)效率和產(chǎn)品的差異附加值。(3)催化轉(zhuǎn)化過程工藝專一性強(qiáng)，流程簡化，過程可控性強(qiáng)，底物生物利用度高，產(chǎn)品茶黃素制率高，雜質(zhì)少。(4)反應(yīng)過程采用循環(huán)水加熱，能量可得到充分應(yīng)用，所有化學(xué)試劑和溶媒均為食用安全級(jí)，加以回收利用，不會(huì)造成環(huán)境問題。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于此。實(shí)施例1
(a)底物溶液制備用pH=5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液制備質(zhì)量濃度為3.5%的茶多酚底物溶液500mL ；
(b)酶催化劑制備取經(jīng)_6°C冷凍處理的萎凋茶鮮葉320g進(jìn)行粉碎廣2分鐘、加入與步驟(a)相同的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液500 mL進(jìn)行勻漿釋酶，得到酶催化劑，酶催化劑置于4°C冰箱待用；
(c)發(fā)酵制備將乙酸乙酯1000mL及(b)步驟制備的酶催化劑加入控溫生物反應(yīng)釜， 反應(yīng)溫度30°C，底物以連續(xù)補(bǔ)加方式投料，底物流速55 mL/min,純氧通入速度0. 6L/min進(jìn)
5行有氧發(fā)酵；
(d)酯相分離攪拌速度360r/min，反應(yīng)45min后，收集(c)步驟的反應(yīng)液，濾除茶渣， 離心萃取，得含茶黃素的酯相溶液800 mL ；
洗雜分別用2倍體積檸檬酸溶液和堿性溶液對(duì)步驟(d)得到的酯相進(jìn)行洗雜，萃取分層，得純化的酯相溶液；
(e)濃縮轉(zhuǎn)相向步驟(d)洗雜后得到的茶黃素酯相溶液中加入蒸餾水80ml濃縮轉(zhuǎn)相， 蒸發(fā)溫度40°C，濃縮液50mL;
(f)干燥將步驟(e)得到的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到茶黃素為主要成分的茶黃素粗品8. 4g，產(chǎn)品制率48. 0%。經(jīng)液相色譜測定，分析計(jì)算，茶黃素含量達(dá)56. 4%。實(shí)施例2
(a)底物溶液制備用pH4的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液制備質(zhì)量濃度為H的茶多酚底物溶液750mL ；
(b)酶催化劑制備取經(jīng)_2°C冷凍處理的萎凋茶鮮葉480g進(jìn)行粉碎、加入與步驟(a) 相同的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液750 mL進(jìn)行勻漿釋酶，得到酶催化劑，酶催化劑置于 20°C環(huán)境下待用；
(c)發(fā)酵制備將乙酸乙酯1500mL及(b)步驟制備的酶催化劑加入控溫生物反應(yīng)釜， 反應(yīng)溫度25°C，底物以連續(xù)補(bǔ)加方式投料，底物流速30 mL/min,純氧通入速度0. 2L/min進(jìn)行有氧發(fā)酵；
(d)酯相分離攪拌速度360r/min，反應(yīng)30min后，收集(c)步驟的反應(yīng)液，濾除茶渣， 離心萃取，得含茶黃素的酯相溶液1200 mL ；
洗雜分別用5倍體積檸檬酸溶液和堿性溶液對(duì)步驟(d)得到的酯相進(jìn)行洗雜，萃取分層，得純化的酯相溶液；
(e)濃縮轉(zhuǎn)相向步驟(d)洗雜后得到的茶黃素酯相溶液中加入蒸餾水IOOml濃縮轉(zhuǎn)相，蒸發(fā)溫度60°C，濃縮液75mL ；
(f)干燥將步驟(e)得到的濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，得到茶黃素為主要成分的茶黃素粗品6. 8g，產(chǎn)品制率45. 3%。經(jīng)液相色譜測定，分析計(jì)算，茶黃素含量達(dá)57. 9%。實(shí)施例3
(a)底物溶液制備用pH6的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液制備質(zhì)量濃度為5%的茶多酚底物溶液IOOOmL ；
(b)酶催化劑制備取經(jīng)冷凍處理的萎凋茶鮮葉640g進(jìn)行粉碎、加入與步驟(a)相同的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液1000 mL進(jìn)行勻漿釋酶，得到酶催化劑，酶催化劑置于0°C冰箱待用；
(c)發(fā)酵制備將乙酸乙酯2000mL及(b)步驟制備的酶催化劑加入控溫生物反應(yīng)釜， 反應(yīng)溫度30°C，底物溶液以連續(xù)補(bǔ)加方式投料，底物流速80 mL/min，純氧通入速度1.0L/ min進(jìn)行有氧發(fā)酵；
(d)酯相分離攪拌速度360r/min，反應(yīng)60min后，收集(c)步驟的反應(yīng)液，濾除茶渣， 離心萃取，得含茶黃素的酯相溶液1600 mL ；
6洗雜分別用0. 5倍體積檸檬酸溶液和堿性溶液對(duì)步驟(d)得到的酯相進(jìn)行洗雜， 萃取分層，得純化的酯相溶液；
(e)濃縮轉(zhuǎn)相向步驟(d)洗雜后得到的茶黃素酯相溶液中加入蒸餾水50ml濃縮轉(zhuǎn)相， 蒸發(fā)溫度20°C，濃縮液IOOmL ；
(f)干燥將步驟(e)得到的濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到茶黃素為主要成分的茶黃素粗品28. lg，產(chǎn)品制率56. 2%。 經(jīng)液相色譜測定，分析計(jì)算，茶黃素含量達(dá)51. 8 %。
權(quán)利要求
1.一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，其特征在于所述的提制工藝采用以下步驟，(a)底物溶液制備用磷酸鹽緩沖溶液制備以茶多酚為主要成分的底物溶液，茶多酚的質(zhì)量濃度為2% 5% ；(b)酶催化劑制備將鮮茶樹葉進(jìn)行冷凍處理，取用冷凍后的鮮茶樹葉進(jìn)行萎凋、破碎， 然后用磷酸鹽緩沖溶液進(jìn)行勻漿釋酶，得到酶催化劑，酶催化劑置于(T20°C環(huán)境中待用，鮮葉酶基質(zhì)和磷酸鹽緩沖溶液的比例為Ig :2^20ml ；(c)發(fā)酵制備向反應(yīng)器中加入乙酸乙酯與步驟(b)制備的酶催化劑，通入步驟(a)制備的底物溶液，進(jìn)行氧化聚合反應(yīng)，酶促催化過程參數(shù)為底物溶液500m廣1000ml，反應(yīng)體系水酯兩相總體積比為1 :0. 2 2，調(diào)控溫度25°C ^35°C，底物溶液補(bǔ)加流速3(T80mL/min，純氧流速 0. 2^1. OL/min ；(d)酯相分離反應(yīng)3(T60min后，收集(c)步驟的反應(yīng)液，濾除茶渣，離心萃取，收集含茶黃素的酯相溶液；(e)濃縮轉(zhuǎn)相向步驟(d)得到的茶黃素酯相溶液中加入蒸餾水50πιΓ 00πι1，濃縮轉(zhuǎn)相，回收乙酸乙酯，濃縮液與原液的濃縮體積比率達(dá)到1 :1(Γ20，蒸發(fā)溫度2(T60°C ；(f)干燥將步驟(e)得到的濃縮液進(jìn)行干燥處理，得到茶黃素粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，其特征在于所述的步驟(a)、 (b)中的磷酸鹽緩沖溶液為檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，pH為4. (Γ6. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，其特征在于鮮葉冷凍處理溫度在-20C -10°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，其特征在于在步驟 (d)之后進(jìn)行洗雜分別用酸性溶液和堿性溶液對(duì)步驟(d)得到的酯相溶液進(jìn)行洗雜，萃取分層后，得到純化的酯相溶液，加入的洗滌溶液與酯相溶液的體積比為0. 5 5:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的的一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，其特征在于步驟(e)中酸性溶液為檸檬酸溶液，堿性溶液為弱堿性Tris-鹽酸溶液或碳酸氫鈉溶液。
全文摘要
一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝涉及茶產(chǎn)品深加工技術(shù)領(lǐng)域，為解決目前茶黃素體外酶促氧化制備法中工藝因連串反應(yīng)不受控造成的產(chǎn)品氧化過度、收率不高的問題，本發(fā)明提供一種茶黃素產(chǎn)品的提制工藝，(a)底物溶液制備，(b)酶催化劑制備，(c)發(fā)酵制備，(d)酯相分離，(e)濃縮轉(zhuǎn)相，(f)干燥，本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了發(fā)酵工藝的過程控制，同時(shí)提高茶黃素產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率及規(guī)格，減省了后續(xù)精制純化的工藝成本。
文檔編號(hào)C12P17/16GK102250980SQ201110161809
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月16日
發(fā)明者孔俊豪, 孫慶磊, 張士康, 楊秀芳, 涂云飛, 陳小強(qiáng) 申請(qǐng)人:中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究所