專利名稱：來源于戊糖片球菌的食品級l-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列及其應(yīng)用的制作方法
來源于戊糖片球菌的食品級L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和遺傳工程領(lǐng)域，涉及從食品級微生物戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(LAI)基因，具體講是的戊糖片球菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列及其應(yīng)用。將該基因與不同表達(dá)載體連接，轉(zhuǎn)入到細(xì)菌、酵母、植物或動物中，利用其編碼的LAI生產(chǎn)D-塔格糖的方法和應(yīng)用。背景技術(shù)：
近年來發(fā)現(xiàn)了一類低熱量、具有多生物學(xué)功能的單糖及其衍生物，由于在自然界中存在量極少，學(xué)術(shù)界把它們稱為稀少糖(Rare Sugar)。其中D-塔格糖(D-Tagatose)是近年發(fā)現(xiàn)的一種具有特殊保健功能的新型功能性甜味劑，具有抑制齲齒、降低血糖、輔助減肥、改善腸道菌群等特殊功能，在食品、保健品及醫(yī)藥品領(lǐng)域有著十分重要的應(yīng)用價值。D-塔格糖已于2001年被美國食品與藥物管理局(FDA)確定為普遍公認(rèn)安全食品(GRAS)。
生產(chǎn)D-塔格糖的傳統(tǒng)方法主要是化學(xué)轉(zhuǎn)化法。即以乳糖為原料，經(jīng)過水解獲得D-半乳糖，再經(jīng)過鈣鹽催化劑，促使D-半乳糖在堿性條件下催化生成D-塔格糖。因為乳糖是一種相對廉價的原料，因此這種方法被首次利用于D-塔格糖的工業(yè)化制備。但是通過化學(xué)合成的方法制備的稀少糖轉(zhuǎn)化率較低，步驟繁復(fù)不易控制，反應(yīng)過程中伴有副產(chǎn)物產(chǎn)生，且產(chǎn)生較嚴(yán)重環(huán)境污染，可見化學(xué)法仍存在一定的不足。研究發(fā)現(xiàn)來源于微生物的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，隨之D-塔格糖的生物轉(zhuǎn)化法應(yīng)用而生。生物轉(zhuǎn)化法可以利用自然界中廣泛存在的單糖或富含某些單糖的加工副產(chǎn)物為原料，以生物酶作為催化劑，不僅轉(zhuǎn)化效率高于化學(xué)轉(zhuǎn)化法，而且成本較低，產(chǎn)生污染物較少，是規(guī)?；苽銬-塔格糖的重要技術(shù)手段。此后，LAI便成為了生物法生產(chǎn)D-塔格糖研究的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，隨著LAI催化反應(yīng)溫度的升高，D-半乳糖與D-塔格糖之間的異構(gòu)平衡會逐漸偏向D-塔格糖，D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率會呈現(xiàn)上升的趨勢。因此，來源于嗜熱菌的LAI被研究學(xué)者關(guān)注。來源于 Geobacillus stearothermophilus、Geobacillus thermonitrificans> Thermotoganeapolitana、Thermotoga maritime等嗜熱細(xì)菌的LAI基因被克隆并詳細(xì)研究。但是,這些嗜熱細(xì)菌并不是食品級微生物，其LAI用于食品工業(yè)的安全性受到質(zhì)疑。而且反應(yīng)溫度過高時，容易促使褐變反應(yīng)，可見這些嗜熱性的LAI并不適合于D-塔格糖的工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明中提及的LAI來源于食品級微生物戊糖片球菌，戊糖片球菌已經(jīng)被廣泛利用于傳統(tǒng)的食品發(fā)酵工業(yè)，其來源的LAI具有很高的安全性。
發(fā)明內(nèi)容:本發(fā)明的目的之一是提供從戊糖片球菌中分離的編碼L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列。本發(fā)明的目的之二是提供該核苷酸序列所編碼的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶多肽。本發(fā)明的目的之三是提供含有該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接，進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體。本發(fā)明的目的之四是提供含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代。
本發(fā)明的目的之五是提供一種用含有該基因核苷酸序列或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞或該核苷酸序列所編碼的L阿拉伯糖異構(gòu)酶多肽制備D-塔格糖的方法。本發(fā)明第一方面提供的是如SEQ ID No 1所示的核苷酸序列。本發(fā)明提供了一種新的分離的核苷酸序列-即編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列，它是由SEQ ID No :1所示的核苷酸序列組成的，其特征是該序列長為1425bp (堿基)。分離的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列，它選自下組的一種核苷酸序列(1)編碼SEQ ID No :2氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列；(2)與核苷酸序列(I)互補(bǔ)的核苷酸序列。準(zhǔn)確地，該核苷酸序列是SEQ ID No :I所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提供了編碼SEQ ID No 2所示的氨基酸序列的活性多肽的核苷酸序列，具體來講本發(fā)明的核苷酸序列是SEQ ID No : I的核苷酸序列。 本發(fā)明的核苷酸序列可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID No :2所示的編碼區(qū)序列相同或是簡并的變異體。本發(fā)明的第二方面，提供分離的上述核苷酸序列所編碼的多肽，該多肽是SEQ IDNo : 2氨基酸序列的多肽。本發(fā)明提供了一種新的多肽序列-戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的氨基酸序列，它是由SEQ ID No :2所示的氨基酸序列組成。本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物)細(xì)胞中產(chǎn)生。編碼SEQ ID No 2活性多肽的核苷酸序列包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。本發(fā)明的第三、第四方面，提供了含有上述基因核苷酸序列的重組表達(dá)載體，以及被上述核苷酸序列或重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞包括細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明也涉及含有編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列和外源性調(diào)節(jié)序列元件結(jié)合進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體。能夠影響基因表達(dá)產(chǎn)物的序列元件包括有復(fù)制起始點、啟動子、標(biāo)記基因和翻譯調(diào)控元件?？捎帽绢I(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法來構(gòu)建含編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook, et al. ,Molecular Cloning, a LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)。所述的編碼戍糖片球菌 LAI的核苷酸序列可有效連接到表達(dá)載體的恰當(dāng)啟動子上，以指導(dǎo)mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的Iac或trp啟動子；λ噬菌體的啟動子真核啟動子包括CMV早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核細(xì)胞或真核細(xì)胞或其病毒中表達(dá)的啟動子。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子等。在載體中插入增強(qiáng)子序列將會使其在高等真核細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄得到增強(qiáng)。增強(qiáng)子是DNA表達(dá)的順式作用因子，通常大約有10-300bp，作用于啟動子以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄。如腺病毒增強(qiáng)子。本發(fā)明還涉及用含有本發(fā)明戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列的重組表達(dá)載體或直接用編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列經(jīng)基因工程產(chǎn)生的宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列或含有該核苷酸序列的重組表達(dá)載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該核苷酸序列或重組表達(dá)載體的基因工程化宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的代表性例子有大腸桿菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞如油菜、煙草、大豆；昆蟲細(xì)胞如果蠅S2或Sf9 ;動物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。用本發(fā)明所述的核苷酸序列或含有核苷酸序列的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長期收集菌體，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域是眾所周知的。也可用MgCl2,電穿孔等方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用DNA轉(zhuǎn)染法、顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等方法。 本發(fā)明的第五方面，提供了一種用含有該基因的核苷酸序列、或該基因核苷酸序列與異源調(diào)節(jié)序列連接的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞、或用該核苷酸序列所編碼的LAI多肽制備D-塔格糖的方法。該方法是這樣實現(xiàn)的，根據(jù)宿主細(xì)胞，用本領(lǐng)域技術(shù)人員所共知的方法生長或培養(yǎng)。比如微生物細(xì)胞通常是在0-100°C，優(yōu)選10-60°c，同時還要氧氣。培養(yǎng)基中含有碳源，如葡萄糖；氮源，通常是有機(jī)氮的形式，如酵母提取物、氨基酸；鹽，如硫酸銨，微量元素，如鐵、鎂鹽；如果需要的話還有維生素。在此期間培養(yǎng)基的PH可以保持固定的值，就是說，在培養(yǎng)期間進(jìn)行控制或不控制。培養(yǎng)可以分批培養(yǎng)、半不連續(xù)培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)形式進(jìn)行。在培養(yǎng)之后，收集細(xì)胞，破碎或直接使用。將D-半乳糖與SEQ ID No :2或含有SEQ ID No 2的細(xì)胞一起培養(yǎng)，即可將D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖。本發(fā)明還涉及用上述方法制備D-塔格糖，以及將其應(yīng)用于生產(chǎn)人類食品、保健品、動物飼料、化妝品或藥品用途。本發(fā)明的其他方面由于本文技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。本發(fā)明所涉及的技術(shù)術(shù)語的含義“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。例如，活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的核苷酸序列和多肽是沒有分離純化的，但同樣的核苷酸序列或多肽如從天然狀態(tài)中與同存在的其它物質(zhì)中分開，則為分離純化的。“分離的核苷酸序列”是指基本上不含天然與其相關(guān)的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能用標(biāo)準(zhǔn)的DNA純化技術(shù)純化的?！熬幋a戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的核苷酸序列”是指包括編碼戊糖片球菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶多肽的核苷酸序列和包括附加編碼和/或非編碼的核苷酸序列。“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果本發(fā)明獲得了來源于戍糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的食品級L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，并實現(xiàn)了其在大腸桿菌細(xì)胞中的大量表達(dá)。該酶可以將D-半乳糖轉(zhuǎn)化為功能性稀少糖D-塔格糖，且具有較高的生物安全性，可以應(yīng)用于食品、保健品以及醫(yī)藥品等領(lǐng)域，有很廣泛的應(yīng)用前景。

圖I顯示所構(gòu)建的大腸桿菌重組表達(dá)載體pETPPLAI。圖2SDS-PAGE顯示所構(gòu)建的工程菌株中LAI的表達(dá)情況。Marker :蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；第I泳道含質(zhì)粒pET-21a菌株未誘導(dǎo)時的菌體煮沸樣品；第2泳道含質(zhì)粒pET_21a菌株誘導(dǎo)后的菌體煮沸樣品；第3泳道含質(zhì)粒pET-21a菌株誘導(dǎo)后的菌體破碎上清樣品； 第4泳道含質(zhì)粒pETPPLAI菌株未誘導(dǎo)時的菌體煮沸樣品；第5泳道含質(zhì)粒pETPPLAI菌株誘導(dǎo)后的菌體煮沸樣品；第6泳道含質(zhì)粒pETPPLAI菌株誘導(dǎo)后的菌體破碎上清樣品。圖3A顯示D-半乳糖、D-塔格糖標(biāo)準(zhǔn)物的高效液相色譜圖(前者為D-半乳糖，后者為D-塔格糖)。圖3B是含重組質(zhì)粒pETPPLAI大腸桿菌的細(xì)胞破碎上清液(LAI粗酶液)與D-半乳糖30°C反應(yīng)過夜后的高效液相色譜圖。 圖3C是含重組質(zhì)粒pETPPLAI大腸桿菌的細(xì)胞破碎上清液(LAI粗酶液)與D-半乳糖40°C反應(yīng)過夜后的高效液相色譜圖。
具體實施方式下面結(jié)合具體的實施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例I.從戊糖片球菌中分離LAI的核苷酸序列按照Genbank中戊糖片球菌LAI的核苷酸序列設(shè)計上下游引物-引物I和引物2，并在上下游引物中分別加入BamH I和Hind III酶切位點，以方便后續(xù)的表達(dá)載體構(gòu)建。引物1:5' -CGGGATCCAAAAAAGTACAAGATTATG-3' (SEQ ID No :3)引物2:5' -CCCAAGCTTTCATTTGATGTTAACGTATGTC-3' (SEQ ID No :4)PCR 條件為94°C 5min，一個循環(huán)；94°C 30s，56°C 30s，72°C 90s，三十個循環(huán)，72°C 5min，一個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收。實施例2.大腸桿菌重組表達(dá)載體的構(gòu)建將上例中PCR回收產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的pET-2la，在T4連接酶作用下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)過質(zhì)粒提取和測序鑒定出陽性轉(zhuǎn)化子。質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果見附圖1，所構(gòu)建的含有該戊糖片球菌LAI基因的大腸桿菌質(zhì)粒命名為pETPPLAI。實施例3.重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞 取I μ g上例中的重組質(zhì)粒pETPPLAI轉(zhuǎn)化到用CaCl2法處理的大腸桿菌E. coliBL21(DE3)細(xì)胞中，在含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜。待轉(zhuǎn)化子長出后以菌落PCR檢測其正確性。實施例4 :生產(chǎn)LAI的工程菌的誘導(dǎo)表達(dá)與粗酶活性測定挑取上例中的陽性轉(zhuǎn)化子，接種于50ml含100 μ g/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C，200rpm過夜培養(yǎng)。以O(shè). 5%的接種量接入IL以上LB培養(yǎng)基中，37°C，200rpm繼續(xù)培養(yǎng)4h左右；待培養(yǎng)物O. D. = O. 8-1. O左右時，加入終濃度為O. 5mmol/L的IPTG，于20°C，IOOrpm過夜培養(yǎng)。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在此條件下重組蛋白以可溶性形式存在，幾乎沒有包涵體的生成，如附圖2所示。培養(yǎng)結(jié)束后，IOOOOrpm離心收集菌體，用20ml無菌水重懸菌體，超聲破碎，15000rpm離心30min收集上清液，即為粗酶液。粗酶活性測定的反應(yīng)體系為50mmol/L醋酸鈉緩沖液，其中含有1%半乳糖，lmmol/L Mn2+, O. 5mmol/L Co2+，加入一定量粗酶，最終反應(yīng)體積為1ml。分別于30°C和40°C反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后，于100°C處理5min滅活酶的活性。用O. 22 μ m的微孔濾膜過濾，濾液做高效液相分析。 實施例5 :高效液相色譜分析按如下條件進(jìn)行儀器為安捷倫高效液相色譜儀1200，分析柱Waters Sugar Pakl，流動相去離子水，流速0. 5ml/min，柱溫80°C，檢測器示差折光檢測器。以Sigma公司生產(chǎn)的D-半乳糖和D-塔格糖純品為標(biāo)準(zhǔn)品，將上例得到的樣品進(jìn)行分析，上樣量為20μ I。色譜分析結(jié)果見附圖3，圖3Α顯示D-半乳糖和D-塔格糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間，圖3Β和圖3C顯示的是LAI粗酶液與D-半乳糖分別于30°C和40°C過夜反應(yīng)后的生成物情況。通過與D-半乳糖和D-塔格糖標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間進(jìn)行比較鑒別出各個峰?？梢姳景l(fā)明中分離得到的LAI可以催化D-半乳糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖，且轉(zhuǎn)化率隨反應(yīng)溫度的增加而提高，400C反應(yīng)時轉(zhuǎn)化率約為33%。使用本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的食品級LAI可以實現(xiàn)D-塔格糖的生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)，并且具有很高的生物安全性，可以應(yīng)用于食品、保健品及醫(yī)藥品等諸多領(lǐng)域中，具有非常廣泛的應(yīng)用前景和競爭力。
權(quán)利要求
1.一種食品級L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(LAI)的核苷酸序列，其特征在于它是從戊糖片球菌中分離得到的，是SEQ ID No :1所示的核苷酸序列。
2.—種權(quán)利要求I所述的核苷酸序列編碼的多肽，其特征在于所述的多肽是SEQ IDNo 2所示的氨基酸序列的多肽。
3.—種重組表達(dá)載體，其特征在于它是由權(quán)利要求I所述的核苷酸序列與質(zhì)粒或病毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
4.按照權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于它是由pET-21a與引物I及引物2的PCR產(chǎn)物連接而構(gòu)建成的重組表達(dá)載體，命名為pETPPAI。其具體構(gòu)建過程如下 根據(jù)SEQ ID No :1所示的編碼區(qū)序列，設(shè)計出一對基因特異性擴(kuò)增引物，引物I和引物2，分離其潛在開放閱讀框序列引物 I : 5' -CGGGATCCAAAAAAGTACAAGATTATG-3'引物 2 :5' -CCCAAGCTTTCATTTGATGTTAACGTATGTC-3' PCR 條件為94°C 5min，一個循環(huán)；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，三十個循環(huán)，72°C5min，一個循環(huán)?；厥誔CR產(chǎn)物，經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和Hind III雙酶切，與經(jīng)過同樣雙酶切的pET-2la，在T4連接酶作用下進(jìn)行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)過質(zhì)粒提取和測序鑒定出陽性轉(zhuǎn)化子。
5.一種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于它是選自于下列一種宿主細(xì)胞 (a)它是用權(quán)利要求I所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞； (b)它是用權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
6.按照權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞。
7.按照權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞是攜帶表達(dá)載體pETPPAI的大腸桿菌細(xì)胞。
8.按照權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的方法，其特征在于，利用含有100μ g/ml的LB培養(yǎng)基于37°C、有氧條件下培養(yǎng)大腸桿菌4h，加入O. 5mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，20°C繼續(xù)培養(yǎng)20h。
9.權(quán)利要求I所述的核苷酸序列、權(quán)利要求2所述的氨基酸序列、權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體和權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞應(yīng)用于D-塔格糖生產(chǎn)的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種來源于食品級微生物戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶(LAI)及其應(yīng)用。該酶的核苷酸序列如SEQ ID No1所示，所編碼的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。本發(fā)明包括編碼LAI的核苷酸序列與表達(dá)載體連接而成的進(jìn)行功能性表達(dá)的重組表達(dá)載體，以及含有本發(fā)明重組表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞及其后代細(xì)胞。用上述的核苷酸序列或多肽序列或含有本發(fā)明重組表達(dá)載體的大腸桿菌細(xì)胞及其后代細(xì)胞生產(chǎn)D-塔格糖的方法。
文檔編號C12P19/24GK102827855SQ20111016271
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月17日 公開號201110162714.9
發(fā)明者孫媛霞, 朱玥明 申請人:天津工業(yè)生物技術(shù)研究所