專利名稱：參與羊駝毛色形成的CDK5-A的cDNA的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及從羊駝皮膚分離的細胞周期素依賴蛋白激酶5 (命名為⑶K5-A)的cDNA，將此⑶K5-A基因轉染到羊駝黑色素細胞系后，調控羊駝毛色的重要關鍵基因的表達均發(fā)生變化。因此，CDK5-A參與羊駝毛色形成，可成為通過轉基因技術改變羊駝毛色的基因資源。
背景技術：
細胞周期素依賴蛋白激酶5(Cyclin_d印endent Kinase 5，⑶肪)屬于細胞周期素 (cyclin)依賴性蛋白激酶(CDK)家族成員，CDK5最早利用生物化學方法從牛腦組織中分離出來，于1992年被發(fā)現。CDK5是由脯氨酸引導的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對真核細胞的細胞分裂周期起磷酸化/脫磷酸化的調控作用。就結構而言，CDK5作為CDK家族的一員，與 ⑶K2相比較，氨基酸序列相似性可達20%，相同性高達60%，同時⑶K5也包含了全部的保守的蛋白激酶區(qū)域，并在第III區(qū)域中含有CDK家族成員共有的PSTAIRE結構域。p35是一種相對分子量為35kDa的蛋白質，其穩(wěn)定性較低，易通過依賴于泛素的蛋白水解途徑降解。計算機模擬P35的三級結構，發(fā)現p35蛋白的催化部位可以折疊成與細胞周期蛋白A催化部位相似的結構。以前認為p35激活CDK5-A的機制與細胞周期蛋白A 激活CDK2的機制并不完全相同CDK2的激活需要和細胞周期蛋白A結合，但細胞周期蛋白 A/⑶K2的蛋白激酶活性很低，只有在激活的CAK(cdk-activating kinase)作用下，其蛋白激酶活性才能完全被激活；而CDK5的完全激活只需要和p35蛋白結合，并不需要CAK的作用。最近有報道指出，⑶K5的Ser-159位點被酪蛋白激酶I (CKI)磷酸化后，激酶活性可明顯增強，提示CDK5的完全激活，除需與p35結合外，可能還需要激酶的作用。研究表明⑶K5主要在神經元表達，與神經系統(tǒng)發(fā)育和神經元的正常功能密切相關。但近來發(fā)現CDK5在非神經元的組織或細胞中表達，如在鼠晶狀體和兔角膜的上皮細胞中可調節(jié)細胞與基質及細胞間的粘附和遷移。Lee等人發(fā)現，CDK5在鼠的卵巢中表達，可能對卵巢內某些細胞的分化和凋亡起作用。近來有研究發(fā)現，CDK5是一個新發(fā)現的能使體內外酪氨酸羥化酶(TH)發(fā)生磷酸化的激酶，TH被CDK5磷酸化后，TH的蛋白水平和活性均增加。TH是酪氨酸酶(TYR)的活性酶之一，在許多位點被不同的激酶磷酸化后，不同程度地影響著TH酶的活性。酪氨酸酶是在黑色素合成的起始過程中一種關鍵的起催化作用的限速酶，至少具有酪氨酸羥化酶和多巴氧化酶2種活性。TYR催化酪氨酸產生真黑素和褐黑素，而真黑素和褐黑素的量決定哺乳動物的毛色。CDK5以通過調節(jié)酪氨酸酶的活性來影響真黑素和褐黑素的產生，從而影響毛色。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種從羊駝皮膚分離的細胞周期素依賴蛋白激酶5 (CDK5-A) 的cDNA，以通過該基因調控羊駝的毛色。
本發(fā)明的技術方案包括從羊駝皮膚cDNA文庫中篩選到的⑶K5-A。利用Southern Blotting雜交方法，將CDK5-A引物用地高辛標記后，與已構建的羊駝皮膚cDNA文庫雜交，所得陽性信號(圖1)說明CDK5-A在羊駝皮膚中表達。將陽性信號對應的斑點進行質粒提取，經測序，驗證是羊駝⑶K5-A。通過PCR手段獲?、荎5-A完整的編碼區(qū)，得到一種羊駝⑶K5-A完整編碼區(qū)的cDNA (電泳圖見圖2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所述。羊駝⑶K5-A基因，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。圖3是羊駝CDK5-A氨基酸序列與其他動物氨基酸序列的比較。從圖中可以看出， 羊駝CDK5-A基因的完整編碼區(qū)核苷酸大小為879bp，編碼292個氨基酸，與人、牛、馬、豬等的同源性較高。羊駝⑶K5-A氨基酸的特征如下根據分析，羊駝⑶K5-A蛋白質的3D結構呈螺旋狀，且具有多個結合位點。通過結構域分析，羊駝CDK5-A蛋白質在第10-203位氨基酸間含有多個激活位點如ATP結合位點以及底物結合位點(見圖4)。第1-9位氨基酸和第 204-292位氨基酸均為非活性部位，其中在第1-9位氨基酸中，賴氨酸含量較高(33%)，而在第204-292位氨基酸中，亮氨酸含量最高(11個)，而且每隔14個氨基酸就出現1個氨基酸， 連續(xù)出現4次，還有4個亮氨酸呈成對排列。此外，有4個谷氨酸也成對排列。本發(fā)明構建了包括有上述羊駝⑶K5-A完整編碼區(qū)的cDNA的重組表達載體。具體地，是構建了包括有上述羊駝⑶K5-A完整編碼區(qū)的cDNA的重組表達載體PVAXl-⑶K5-A。由于羊駝⑶K5-A完整的⑶S區(qū)中沒有合適的雙酶切位點，本發(fā)明采用如圖5的構建策略構建重組表達載體。利用RT-PCR技術，將羊駝皮膚組織總RNA反轉錄并擴增以獲取羊駝⑶K5-A基因，再將其亞克隆至pMD18-T Vector,構建出pMD-⑶K5-A。利用EcoR I和 Hind III雙酶切pMD-⑶K5-A和pVAX-Ι，以產生粘性末端，回收二者的雙酶切產物，利用T4 DNA連接酶將酶切產物⑶K5-A基因連接到pVAX-Ι的EcoR I和Hind III之間，產生重組表達載體 PVAX卜CDK5-A (圖 5)。將上述重組表達載體PVAXl-⑶K5-A轉化到DH5 α中，在培養(yǎng)基上生長，產生的陽性克隆即為重組質粒，命名為PVAX1-OTK5-A。本發(fā)明將此重組質粒pVAXl-⑶Κ5-Α通過脂質體轉染到羊駝黑色素細胞系后(圖 6)，羊駝毛色重要關鍵基因的表達均受到調控，如TYR (圖7)和MClR (圖8)顯著升高，與對照組相比，分別呈差異顯著和極顯著。因此，CDK5-A參與羊駝毛色形成，成為改變羊駝毛色的基因資源。


圖1顯示了從羊駝皮膚cDNA文庫中篩選到的⑶K5-A。圖2為從分離的羊駝總RNA中通過RT-PCR (逆轉錄酶-聚合酶鏈式反應)得到的 ⑶K5-A的1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜。圖3顯示了羊駝⑶K5-A編碼的氨基酸序列與其他動物氨基酸序列的比較。圖4顯示了羊駝⑶K5-A的結構域。圖5為重組表達載體pVAX-⑶K5-A的構建流程示意圖。圖6顯示了⑶K5-A在羊駝黑色素細胞中轉染后的表達。
圖7顯示了⑶K5-A對羊駝黑色素細胞中TYR的調節(jié)作用。圖8顯示了⑶K5-A對羊駝黑色素細胞中MClR的調節(jié)作用。
具體實施例方式實施例1 羊駝CDK5-A完整編碼區(qū)cDNA的獲取。羊駝CDK5-A完整編碼區(qū)的cDNA及其編碼的氨基酸序列見序列表，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO. 1所述，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。通過BLAST比對其他哺乳動物⑶K5基因的同源性，在其保守區(qū)用I^rimerf+軟件設計引物，所用的引物如下
上游5，-ATGCAGAAATACGAGAAACTG-3，； 下游5，-CTAGGGAGGGCAGAAGTCGGA-3，。取液氮凍存的羊駝皮膚，按照試劑盒說明書操作提取羊駝皮膚總RNA。將提取的羊駝皮膚總RNA取1 μ L，用核酸測定儀測定Α260/Α^0、Α260/Α230，并計算其濃度，然后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量。對RNA 進行反轉錄，10 μ L 反應體系中含 5XPrime Script Buffer 2 μ L, Prime Script RT Enzyme Mix 0. 5 μ L, Oligo dT Primer 25pmol，弓L 50pmol， Total RNA luL, DEPC水加至10 μ L。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應條件為37 °C 15min, 85°C k。RT產物保存于20°C備用。根據以下反應體系進行PCR 擴增Taq 酶 0. 2μ L (2U)、10XReaction Buffer 2. 5μ L.cDNA 1 μ L (500_1000ng)、dNTPs (各 2· 5mM)2 μ L、上下游引物(10 μ Μ)各 0· 5 μ L， ddH20加至25μ L。擴增程序:94°C預變性:3min ；94°C變性30s，50°C退火30s，72°C延伸80s， 35循環(huán)；72°C延伸5min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到圖2所示的圖譜，圖中，第1條泳道上的條帶為⑶K5-A基因，M泳道上的條帶為Marker，從圖2中可以看出，⑶K5-A的大小約為 900bpo實施例2 構建在黑色素細胞系中轉染的重組表達質粒PVAXl-⑶K5-A。1、將上述實施例1中獲得的PCR產物(一 20°C保存時間不能太長)連接入克隆載體 pMD18-T Vector,并進行轉化，制備 pMD_CDK5_A。1)連接反應。根據以下反應體系進行連接反應，PMD18-T Vector 1 μ L、PCR產物1 μ L、加水至 5 μ L,再力卩入 Ligation Solution I 5 μ L, 16°C 反應 30min。2)轉化。取一管DH5 α感受態(tài)細胞(商業(yè)購買)放在冰浴中融化，無菌條件下，加入一定量的連接DNA (取10 μ L放入100 μ L感受態(tài)細胞)，輕輕混勻后，冰浴上放置30min，同時可設置另一管感受態(tài)細胞；42°C水浴熱激90s，迅速置冰浴中IOmin ；往管中加入800 μ L無Amp 的LB液體培養(yǎng)基，37°C搖床上溫育45min，使細菌復蘇；每管加入150 μ L X-gal和60 μ L IPTG ；每個平板加入100 μ L細菌液，涂布均勻；待液體完全浸入培養(yǎng)基后，倒置平板，37°C 培養(yǎng)，12-16h后形成單菌落，有白色、藍色菌落。3)質粒DNA的提取。
挑選白色菌落，2mL LB + Amp的試管中(通氣良好)接入一單菌落，于37°C劇烈振搖下培養(yǎng)過夜；將1. 5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管中，于4°C，12000rpm離心30s，其余培養(yǎng)物貯存于4°C;吸去培養(yǎng)液，使細菌沉淀盡可能干燥；加入100 μ L用冰水預冷的質粒提取溶液 I，劇烈振蕩，以溶解細菌；加入200 μ L新配制的質粒提取溶液II ；加入150 μ L用冰預冷的質粒提取溶液III ；4°C，12000rpm離心lOmin，將上清移入另一離心管中；加等量酚氯仿， 振蕩混勻，4°C，12000rpm離心IOmin ；吸上清，加等體積氯仿，以去除多余酚；2倍體積的乙醇和少量3M NaAc,以沉淀DNA ；用70%乙醇洗滌DNA，于4°C，12000rpm離心IOmin ；棄上清， 用 50 μ L 水溶解 DNA，即為 pMD-CDK5-A。2、將上述1中獲得的pMD-⑶Κ5-Α ( 一 20°C保存)與pVAX_l連接，并進行轉化，制備 pVAX-CDK5-A。 1)分別雙酶切 pMD-CDK5-A 和 pVAX-Ι。根據以下反應體系進行酶切反應pMD18-CDK5/pVAX-I 5 μ L、dH20 8 μ L、 IOXBuffer 4μ L, EcoR I lyL.Hind III 2yL。輕輕混勻后短暫離心，37°C 水浴 10h。1% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收目的片段。2)連接和轉化。根據以下反應體系進行連接上述1)中獲得的pMD-⑶K5-A酶切產物和pVAX_l酶切產生分別為 7μ L和 lyL、10X Τ4 DNA Ligase Buffer 2 μ L、T4 DNA Ligase lyL，力口水至 20 μ L。22°C孵育 10min，65°C熱激 lOmin。取5 μ L連接產物，加入100 μ L DH5 α感受態(tài)細胞，輕輕振蕩混勻，冰浴30min， 42°〇熱激9()8，然后再冰浴；31^11，加入9001^ LB培養(yǎng)基，37°C振蕩培養(yǎng)lh。取100 μ L培養(yǎng)液，涂布在含有IPTG和X-gal的氨芐青霉素(終濃度為100yg/L)的LB瓊脂平板上，37°C 培養(yǎng)過夜。挑選白色菌落，PCR法鑒定和酶切鑒定后，提取質粒，方法同1中步驟3)，即為重組表達質粒PVAX-CDK5-A。實施例3 ⑶K5-A轉染黑色素細胞及其對黑色素細胞內基因表達的影響。1)CDK5-A轉染羊駝黑色素細胞。在6孔板的每孔中加入大約2mL正常生長培養(yǎng)基，接種第五代黑色素細胞 1-3X105個。在37°C條件下培養(yǎng)細胞約60-90%滿；在滅菌離心管中準備試劑A和B (試劑A 對每孔細胞，使用125 μ L不含血清的培養(yǎng)基稀釋2 μ g DNA ；試劑B 對每孔細胞，使用 125 μ L不含血清的培養(yǎng)基稀釋7 μ L DNA fectin試劑)；將試劑A和B混合，室溫條件下孵育20min以促進DNA-脂質體復合體的形成；移去細胞中培養(yǎng)基，加入800 μ L不含血清的培養(yǎng)基；將DNA fectin與pVAX-⑶K5-A加入細胞中，輕柔搖動培養(yǎng)板，確保混勻；在37°C條件下保溫15h ；移去培養(yǎng)基，每孔加入2mL含血清的黑色素細胞培養(yǎng)基；在37°C條件下培養(yǎng)細胞36h ；收集細胞。對收集的細胞用免疫組織化學檢測CDK5-A在轉染后羊駝黑色素細胞中的表達， 結果如圖6。圖中，A為陰性對照；B為⑶K5-A在轉染黑色素細胞中的表達(4X)，黃褐色為陽性反應物；C為⑶K5-A在轉染黑色素細胞中的表達(20 X )，黃褐色為陽性反應物。2)檢測轉染后黑色素細胞中毛色基因的表達變化。 通過脂質體介導將pVAX-⑶K5-A轉染黑色素細胞7 后，收集所有細胞，并提取其總RNA，RT反應反轉錄為cDNA。以cDNA為模板，對MClR和TYR進行PCR擴增，擴增時收集SYRB-GREEN染料信號以示產生目的基因的產量。同時，用ISSrRNA做內參，用Δ CT計算相
對產量。RT 反應體系10yL 反應體系中含 5Χ Prime Script Buffer 2 μ L, Prime Script RT Enzyme Mixl 0. 5 μ L, Oligo dT Primer 25pmol，弓L 50pmol， Total RNA 1 μ L，DEPC水加至10 μ L。上述成分混勻后置于PCR儀器中，反應條件為37°C 15min, 85°C k。RT產物保存于一 20°C備用。以RT產物為模板，根據基因庫內目標基因在哺乳動物中的同源性分析其保守區(qū)， 設計如下引物
權利要求
1.一種羊駝⑶K5-A完 整編碼區(qū)的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所述。
2.一種羊駝⑶K5-A基因，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
3.包括有權利要求1的cDNA的重組表達載體PVAXl-⑶K5-A。
4.權利要求3重組表達載體的構建方法，是將⑶K5-A克隆至pMD18-TVector，構建出 PMD-CDK5-A，用EcoR I和見11(1111雙酶切卩]\ -0)1(5-4和卩￥4乂-1，回收二者的雙酶切產物，利用T4 DNA連接酶連接產生重組表達載體PVAXl-⑶K5-A。
5.轉化權利要求4重組表達載體PVAXl-⑶K5-A獲得的重組質粒PVAXl-⑶K5-A。
6.權利要求5重組質粒PVAXl-⑶K5-A轉染黑色素細胞后對TYR和MClR的調節(jié)作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種從羊駝皮膚分離的，參與羊駝毛色形成的CDK5-A的cDNA，其完整編碼區(qū)的核苷酸大小為879bp，編碼292個氨基酸。本發(fā)明還涉及構建包括有上述羊駝CDK5-A完整編碼區(qū)的cDNA的重組表達載體PVAX1-CDK5-A，以及轉化得到的重組質粒。本發(fā)明將上述重組質粒轉染到羊駝黑色素細胞系后，羊駝毛色重要關鍵基因的表達均受到調控，如TYR和MC1R的基因表達水平顯著升高，因此，CDK5-A參與羊駝毛色形成，成為改變羊駝毛色的基因資源。
文檔編號C12N15/66GK102286499SQ20111016272
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者張瑞娜, 白俊明, 范瑞文, 董常生, 賈小云 申請人:山西農業(yè)大學