專利名稱：一種辣椒疫霉菌誘導壞死蛋白Pcnpp1基因分離、體外突變及其沉默突變體制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬分子生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及一種辣椒疫霉菌誘導壞死蛋白基因分離、體外突變及其沉默突變體制備方法。此外，系證明了該基因編碼的農(nóng)桿菌瞬時表達蛋白誘導辣椒、煙草葉片組織細胞壞死乃至產(chǎn)生明顯癥狀的功能特性。
背景技術：
植物病原卵菌侵染寄主、破壞寄主防御系統(tǒng)乃至對寄主產(chǎn)生破壞或致病作用，其中效應蛋白是病原卵菌分泌的一類重要效應因子，如誘導壞死蛋白(necrosis-inducing protein,NPP)是植物病原卵菌侵染或與寄主互作過程中分泌的一種壞死效應蛋白，具破壞寄主免疫系統(tǒng)、誘導寄主組織細胞壞死乃至產(chǎn)生明顯癥狀的作用，因此該類效應蛋白是植物病原卵菌侵染寄主過程中分泌的一類重要的致病因子。誘導壞死蛋白(NPP)是由細菌、真菌及卵菌等分泌的一種重要蛋白因子，能誘導雙子葉植物組織細胞產(chǎn)生壞死反應，還能激發(fā)植物產(chǎn)生乙烯、MAP激酶活化、植保素合成、PR 基因誘導及胞質Ca2+釋放等防御反應。該類基因廣泛分布于不同生物中，但不同生物體的該類基因數(shù)量存在差異。研究表明多數(shù)細菌、真菌基因組中含2-4個NPP基因，而多數(shù)植物病原卵菌基因組中含多個NPP基因成員。根據(jù)辣椒疫霉(Phytophthora capsici)全基因組信息，辣椒疫霉基因組中約含27個NPP基因，而且資料表明NPP基因家族分布特性可能與病菌寄主范圍多樣性或功能特異性有關。研究表明，一些非致病性生物也含適宜數(shù)量的 NPP基因，由此推理NPP蛋白功能具多樣性，不同種菌NPP基因數(shù)量、結構及其功能特性存在差異。此外，不同物種的NPP基因氨基酸序列高度保守，絕大多數(shù)NPP基因氨基酸序列N端存在兩個半胱氨酸，中間部分均具GHRHDWE基序，該保守區(qū)與其它已知蛋白序列無同源性， 說明該類蛋白具功能特異性。另外，NPP基因成員廣泛存在于多數(shù)微生物體內，由此推斷該類基因在病原與寄主植物互作過程中可能起重要的作用。資料表明NPP蛋白在植物病原菌致病過程中扮演著重要的角色，已積累了一些有關植物病原細菌、真菌NPP基因克隆及其功能信息，但還沒有關植物病原卵菌NPP基因克隆及其功能研究的資料積累。在世界范圍內，植物病原卵菌易導致多種植物的病害，給農(nóng)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失，在此基礎上，選取重要物病卵菌材料，以重要致病因子基因為研究對象，借助基因與蛋白操作技術，探明關鍵基因功能特性，創(chuàng)建其技術操作體系，預期研究具重要的理論與實踐意義。目前無公開發(fā)表過辣椒疫霉NPP基因功能研究技術規(guī)程及其致病相關功能特性技術材料。

發(fā)明內容
基于上述的原因，本發(fā)明提供了 1個克隆自辣椒疫霉的誘導壞死蛋白基因Pcnppl 及其功能分析技術，特別涉及該蛋白基因的分離、體外突變及其沉默突變體制備方法，證明了該基因有效的參與了辣椒疫霉侵染寄主及其病程發(fā)展過程，利用體外基因突變技術界定了 4氨基酸為調控該蛋白酶活性的關鍵氨基酸，并立足于基因轉化和基因沉默技術證明了該基因具破壞寄主葉片組織細胞的性能，導致受害部位產(chǎn)生明顯的癥狀。因此，該基因是辣椒疫霉NPP基因家簇中的一個重要功能基因，本技術發(fā)明為深入開展植物病原卵菌致病基因功能特性研究提供了適宜的技術儲備，創(chuàng)建了其技術操作技術規(guī)程，充實植物病原卵菌與寄主互作的分子機制資料，利于建立卵菌病害綜合防控技術策略。本發(fā)明提供的npp基因，其基因序列如kq ID No :1所示；其蛋白質氨基酸序列為％(1 ID N0:2所示。該基因編碼的農(nóng)桿菌瞬時表達蛋白能夠導致辣椒、煙草葉片產(chǎn)生壞死。該基因有705個堿基，編碼一種含234個氨基酸的蛋白質，分子量為25. 5kDa,信號肽含有18個氨基酸(為kq ID NO :2序列中1-18的氨基酸)，無N-糖基化位點，無內含子。該npp基因與JGI中的，所有npp基因氨基酸序列進行比對，發(fā)現(xiàn)1個npp基因 (jgi/phycaf7/7756)與Pcnppl基因氨基酸同源性高達99. 57%，其它結構完全相同，因此可以確認該基因為辣椒疫霉一個npp基因。該基因的具體克隆制備方法為1、基因克隆具體步驟A 采用CTAB法提取辣椒疫霉DNA，參試菌株CBS121657，荷蘭菌種保藏中心提供；B:根據(jù)已報道的辣椒疫霉基因組誘導壞死蛋白基因序列，設計特異引物 pcnpplF(其序列如Seq ID No 3所示)和pcnpplR(其序列如Seq ID No 4所示)，利用 PCR技術擴增辣椒疫霉誘導壞死蛋白基因，陽性克隆測序獲得基因全長；2、辣椒疫霉誘導壞死蛋白Pcnppl基因在辣椒煙草內瞬時表達步驟A 根據(jù)上面獲得的Pcnppl基因序列，設計特異引物pvxF(其序列如kq ID No 5 所示)和pvxR(其序列如kq ID No 6所示)，構建Pcnppl基因瞬時表達載體(如附圖1 所示)，將目的基因克隆至表達載體PVX(pGR106)中。B 提取上述重組表達載體質粒，轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，篩選抗利福平及卡那霉素的農(nóng)桿菌轉化子。C:陽性農(nóng)桿菌化子利用LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，使其進行瞬時表達。3、Pcnppl基因活性位點突變及其突變基因瞬時表達方法具體步驟A 根據(jù)已報道的npp基因氨基酸序列結構，借助overlap-PCR方法，利用引物Seq ID No :3-14分別將其與其它同類基因比對分析界定的4個關鍵氨基酸(D112A，H120A, D123A，E125A)進行點突變及線性突變D112A/H120A/D123A/E125A，以驗證這4個氨基酸是否為該基因的酶活性中心關鍵氨基酸。B 突變序列經(jīng)測序驗證后，利用引物kq ID No 5和kq ID No 6構建 PVX(pGR106)表達載體。提取上述重組表達載體質粒，轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，篩選抗利福平及卡那霉素的農(nóng)桿菌轉化子。C 篩選的農(nóng)桿菌轉化子用LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片，使其進行適宜的瞬時表達，通過與對照癥狀比較，確定活性位點氨基酸突變效果。
4、辣椒疫霉誘導壞死蛋白Pcnppl基因沉默突變體獲得及致病性鑒定步驟A 根據(jù)Pcnppl基因序列，設計特異引物gsF(其序列如kq ID No :17所示)和 gsR(其序列如kq ID No :18所示)，構建Pcnppl基因沉默表達載體，將目的基因克隆至沉默表達載體PHAM34中。B 分別提取重組表達質粒以及標記質粒PHSPNpt，按比例混合后轉化辣椒疫霉原生質體，同時以野生型辣椒疫霉菌株及僅轉化標記質粒PHSPNpt的菌株為對照，篩選抗 G418的轉化子。C 轉化子再培養(yǎng)及表型生物學分析。D 分別提取轉化子菌株及其對照菌株基因組總RNA，設計Pcnppl基因特異引物 nppRTF (其序列如kq ID No :19所示)和nppRTR(其序列如kq ID No :20所示)；辣椒疫霉內參基因actinA基因特異引物actinAF(其序列如kq ID No :21所示)和actinAR(其序列如kq ID No :22所示)，然后分別借助反轉錄PCR(RT-PCR)及熒光定量PCR(Q-RT-PCR) 在基因水平檢測Pcnppl基因沉默效率。E 沉默轉化子菌株與對照組(野生型辣椒疫霉菌及轉化標記質粒PHSPN菌株)的游動孢子分別接種于辣椒葉片，觀察比較接種辣椒葉片的癥狀變化。本發(fā)明所用的載體和宿主菌均為常見，pUC19為Pcnppl基因宿主載體，DH5 α為宿主細胞，PVX(pGR106)為Pcnppl基因表達載體，農(nóng)桿菌GV3101為該基因的表達宿主菌， PHAM34為沉默表達載體，PHSPNpt為沉默表達的標記質粒。綜上所述，本發(fā)明提供了 1個克隆自辣椒疫霉的誘導壞死蛋白基因Pcnppl及其功能分析技術，特別涉及該蛋白基因的分離、體外突變及其沉默突變體制備方法。該基因是辣椒疫霉NPP基因家簇中的一個重要功能基因，本技術發(fā)明為深入開展植物病原卵菌致病基因功能特性研究提供了適宜的技術儲備，創(chuàng)建了其技術操作技術規(guī)程，充實植物病原卵菌與寄主互作的分子機制資料，利于建立卵菌病害綜合防控技術策略。


圖1. Pcnppl基因重組表達載體示意圖；圖中Kan為卡那抗性，Cla I和Not I為雙酶切位點，Pcnppl為目的基因；圖2. Pcnppl基因于煙草葉片中瞬時表達的組織細胞病變結果灰度圖；圖中A =Pcnppl基因農(nóng)桿菌轉化子接種煙草葉片3天后產(chǎn)生壞死斑；B 空載體 PGR106接種煙草葉片3天后無任何癥狀；C 雙蒸水接種煙草葉片3天后無任何癥狀，陽性對照；圖3. Pcnppl基因辣椒葉片中的瞬時表達結果灰度圖；圖中A =Pcnppl基因農(nóng)桿菌轉化子接種辣椒葉片3天后產(chǎn)生明顯壞死斑；B 空載體pGR106接種辣椒葉片3天后無任何癥狀；C 雙蒸水接種辣椒葉片3天后無任何癥狀，陽性對照；圖4. Pcnppl基因4個關鍵氨基酸點突變或線性突變后于煙草葉片內瞬時表達引起葉片的癥狀反應灰度圖；圖中A =Pcnppl野生型基因接種煙草葉片7天后產(chǎn)生壞死斑，B =PVX空載體接種煙草葉片7天后無任何癥狀；C 雙蒸水接種煙草葉片7天后無任何癥狀；D =PcnpplDl 12A接種煙草葉片7天后無任何癥狀；E :PcnpplH120A接種煙草葉片7天后無任何癥狀；F PcnpplD123A接種煙草葉片7天后無任何癥狀；G :PcnpplE125A接種煙草葉片7天后無任何癥狀；H :Pcnpplll2/120/123/125A接種煙草葉片7天后無任何癥狀，結果表明野生型基因能夠導致煙草葉片產(chǎn)生壞死斑，該基因4個關鍵氨基酸點突變或線性突變均使基因編碼的蛋白酶活性喪失；圖5. Pcnppl基因4個關鍵氨基酸點突變或線性突變后于辣椒葉片內瞬時表達引起葉片的癥狀反應灰度圖；圖中A =Pcnppl野生型基因接種辣椒葉片7天后產(chǎn)生壞死斑，B =PVX空載體接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；C 雙蒸水接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；D =PcnpplDl 12A 接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；E :PcnpplH120A接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；F PcnpplD123A接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；G :PcnpplE125A接種辣椒葉片7天后無任何癥狀；H :PCnpplll2/120/123/125A接種辣椒葉片7天后無任何癥狀，結果表明野生型基因能夠導致辣椒葉片產(chǎn)生壞死斑，4個關鍵氨基酸的分別突變或同時突變菌使其編碼的酶活性喪失；圖6. Pcnppl基因穩(wěn)定沉默RT-PCR檢測結果電泳圖；圖中顯示Pcnppl基因在沉默轉化子中的轉錄水平。M =DNA標準分子量，WT 野生型辣椒疫霉菌株，CK 轉標記質粒轉化子，A6 =Pcnppl基因沉默轉化子；辣椒疫霉持家基因 actinA為內參，actinA基因的表達水平在所有參試菌株中一致。Pcnppl基因在野生型和對照菌株中均呈現(xiàn)很高的表達量，而在沉默菌株中其表達量幾乎檢測不到；圖7. Pcnppl基因穩(wěn)定沉默熒光定量PCR檢測結果示意圖；WT 野生型辣椒疫霉菌株，CK 轉標記質粒轉化子，Pcnppl 目的基因沉默轉化子； 圖中顯示Pcnppl基因于沉默菌株中表達量很低，與對照相比減少80%，成功沉默；圖8. Pcnppl基因沉默轉化子致病性測定結果灰度圖；圖中顯示利用游動孢子接種法測定Pcnppl基因沉默轉化子致病性結果·Λ 沉默轉化子游動孢子接種3天后辣椒葉片癥狀；B 野生型辣椒疫霉菌株游動孢子接種3天后辣椒葉片癥狀；C 含標記質粒的辣椒疫霉菌轉化子游動孢子接種3天后辣椒葉片癥狀；D 雙蒸水處理葉片，野生型和對照菌株處理的辣椒葉片于第3天均產(chǎn)生嚴重水浸狀壞死乃至腐爛癥狀，而沉默轉化子菌株處理的辣椒葉片僅產(chǎn)生輕微的癥狀，說明Pcnppl基因沉默降低了辣椒疫霉對辣椒葉片的破壞作用，因此該基因屬辣椒疫霉的一個重要致病基因。
具體實施例方式本發(fā)明所提供的實例，均按照常規(guī)條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(New York Go Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989),或 Draper, J 等(Blackwell 禾斗學出版社，1988)所述的操作技術規(guī)程，或按照制造廠商建議的實驗條件。實施例1 (基因克隆及測序)選取的參試材料為強致病辣椒疫霉菌株CBS121657，荷蘭菌種保藏中心提供，根據(jù)已報道的NPP基因信息分析辣椒疫霉基因組序列，鑒定辣椒疫霉全基因組中NPP基因成員， 設計特異引物PcnpplF (其序列如kq ID No :3所示)和pcnpplR(其序列如kq ID No 4 所示)，利用PCR方法擴增篩選獲得目的基因。
1、采用CTAB法提取高質量辣椒疫霉菌基因組DNA辣椒疫霉菌株CBS121657移植于燕麥培養(yǎng)基平板，生化培養(yǎng)箱內培養(yǎng)3天后， 取3塊直徑為4mm的菌塊移植于盛有IOOmL液體燕麥培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫搖床振蕩培養(yǎng)5天，過濾菌絲，放研缽內加液氮研磨至粉末狀。然后按照以下步驟提取參試菌株基因組DNA (1)將菌絲粉末轉入1. 5mL離心管，加入700 μ L DNA提取緩沖液，輕輕混勻，置 65 °C 水浴鍋中 30-60min。(2)加入等體積氯仿異戌醇(24 1)，輕搖10-20min, 10000r/min離心IOmin0(3)取上清液于另一離心管內，加入等體積冰凍異丙醇，室溫下靜置20min， 10000r/min離心lOmin，去上清，無水乙醇沖洗1-2次，烘干，加入600 μ L TE緩沖液，輕搖 2-3 次。(4)加入等體積飽和酚氯仿異戊醇(25 24 1)，輕搖10-20min, IOOOOr/ min 離心 lOmin。(5)取上清液于另一離心管內，重復步驟2和3，但第3步用無水乙醇代替冰凍異丙醇。(6)倒掉上清液，加入70%乙醇沖洗2-3次，37°C下烘干，加入300 μ L TE溶液溶解。取5 μ L DNA樣品于1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測DNA片斷長度，D然后置于-20 V冰柜中長期保存、備用。2、PCR擴增目的基因反應體系為ddH20(32. 5 μ L)，10 Xbuffer (5 μ L)，MgCL2 0 μ L)，dNTP 0 μ L)，上下游引物，上游引物PcnpplF (其序列如kq ID No :3所示)，下游引物pcnpplR(其序列如kq ID No 4 所示)各 1 μ L，DNA (2 μ L)，TaqE (0. 5 μ L)。取10 μ L反應產(chǎn)物電泳，確定含目標基因單克隆、測序。借助NCBI中的BLAST程序對獲得的基因全長進行同源序列比對，確定目的基因，根據(jù)基因全長序列推測目的基因氨基酸序列，預測其蛋白質分子量約為25. 5kDa。PCR 反應程序為95°C 4min ；94°C lmin，55°C 30s, 72°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0實施列2 (Pcnppl基因在辣椒、煙草葉片內的瞬時表達)1、辣椒疫霉總RNA提取及反轉錄1. 1辣椒疫霉總RNA提取(1)辣椒疫霉CBS121657在液體燕麥培養(yǎng)基上于培養(yǎng)3天后，取0. Ig樣品經(jīng)液氮研磨，移入Iml Trizol溶液室溫靜置5min。(2)加入0. 2mL氯仿，充分混合混勻，4°C下12000rpm/min離心15min，吸取上清，
重復一至多次。(3)吸取上清，每Iml Trizol加入0. 25倍異丙醇和0. 25倍RNA沉淀劑，充分混勻，室溫放置 10min，4°C下 12000rpm/min 離心 lOmin。(4)收集RNA沉淀，用75%乙醇洗滌2次，重復離心。(5)吸盡殘存乙醇，或使殘余乙醇揮發(fā)。
(6)加50-100 μ 1 DEPC處理的水，將RNA溶液貯存于_70°C保存?zhèn)溆谩?. 2反轉錄合成cDNA第一鏈(1)取1-2 μ g總RNA，加入ddH20至9. 5 μ L，75°C變性5分鐘，冰浴5分鐘，稍微離心。(2)力口 IOX擴增緩沖液2 μ L。(3)力口 IOmmol/L dNTP 混合液 2 μ L。(4)力口 25mmol/LMgCl2 4 μ L0(5)加引物 01igo-dT lyL。(6)力口 RNA 酶抑制劑 0. 5 μ L。(7)加反轉錄酶 M-MLV 1 μ L。(8)加反應總體系20 μ L。(9)反應液混合后，室溫放置10分鐘，42°C溫浴60分鐘，85°C水浴放置10分鐘。(10)加入180 μ L ddH20混勻，稍微離心，_20°C下保存，陰性對照3個分別是① 加入第一鏈cDNA反應所需的所有試劑，不加模板RNA ；②加除反轉錄酶外的所有試劑；③加除引物外的所有試劑。2、Pcnppl基因成熟肽序列分離(1)根據(jù)已獲得的基因Pcnppl全長序列，以參試辣椒疫霉菌CBS121657的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得其cDNA全長。(2)根據(jù)其cDNA全長，設計表達引物，去除信號肽序列和3、、5、非編碼區(qū)序列，并在上游引物特異引物PvxF(其序列如kq ID No:5所示)引入Cla I酶切位點，下游引物 pvxR(其序列如kq ID No:6所示)引入Not I酶切位點，擴增產(chǎn)物含Pcnppl基因編碼的成熟蛋白序列。反應體系為50 μ L 擴增Pcnppl基因全長獲得cDNA模板QyL), 10 X buffer (5 μ L)，dNTP G μ L)，上下游引物各 1 μ L, TaqE (0. 5 μ L)，ddH20 (32. 5 μ L)。PCR 反應程序為94°C 4min ;94°C lmin,55°C 30s, 72°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0取10 μ L反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，送上海博亞生物有限公司測序，獲得 Pcnppl基因表達序列，然后目的基因回收連接pGEM-T Easy Vector，轉化大腸桿菌DH5 α， 藍白斑篩選、質粒DNA酶切鑒定，篩選陽性克隆質粒pGEM-T/Pcnppl。3、Pcnpp 1基因瞬時表達3. IPVX表達載體的構建(I)Cla I和Not I雙酶切pGEM-T/Pcnppl質粒，回收插入片斷。(2)與同樣雙酶切的PVX(pGR106)表達質粒連接，轉化大腸桿菌DH5 α。(3)轉化后的DH5 α經(jīng)卡那霉毒抗性篩選，獲得菌落經(jīng)37°C搖床過夜后提取質粒。(4)重組質粒pGR106/PCnppl酶切及測序鑒定。3. 2農(nóng)桿菌轉化首先根據(jù)以下步驟進行重組質粒提取(1)將含有質粒的大腸桿菌接種于含適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 °C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
(2)取ImL菌液至1. 5mL的離心管中，8000rpm,離心Imin0(3)去上清，收集菌體。(4)加入 200 μ L 預冷的溶液 I (50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8. 0)，
震蕩懸浮菌體。(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II (0. 2Μ NaCl, 1 % SDS)，顛倒離心管數(shù)次混勻， 12000rpm 離心 5min。(6)加入300 μ L預冷的溶液III (3Μ K+，5Μ Ac,)，顛倒混勻液體，置冰層5min， 12000rpm,離心5min，上清轉入另一只離心管中。(7)加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min。(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置lOmin， 12000rpm離心lOmin，去上清。(9)沉淀用70%乙醇洗2次，倒置干燥。(10)回溶于30yL TE(含20yg的RNA酶)中，取5yL電泳檢測，其余-20°C下保存。然后利用凍融法進行農(nóng)桿菌轉化，具體步驟如下(1)挑GV3101單菌落于:3ml LB液體培養(yǎng)基中(含利福平50mg/ml)，觀°C下， 200rpm震蕩培養(yǎng)Mh。(2)按1 100比例轉接IOOml LB液體培養(yǎng)基中(含利福平50mg/ml)，在相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6- 至OD = 0. 6左右，用于制備感受態(tài)。(3)取1. 5ml菌液13000rpm離心30s，棄上清，用800 μ 1 CaCl2重懸菌體，于冰層放置30min，而后13000rpm離心30s棄上清。(4)再用100 μ 1 CaCl2重懸菌體，冰層放置備用。(5)取10 μ 1質粒加入200 μ 1感受態(tài)細胞中，冰層放置30min，然后在液氮中放置 lmin，然后立刻轉至37°C水浴中熱擊5min。(6)迅速加入800μ1 LB液體培養(yǎng)基于下，200rpm震蕩培養(yǎng)2h。(7)然后稍試離心收集菌體，將其涂布于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各 50mg/ml)，28°C下，倒置培養(yǎng) 48h。(8)農(nóng)桿菌轉化子篩選，挑取平板上的單斑轉化子于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)， 然后提取質粒進行雙酶切和PCR驗證。3. 3農(nóng)桿菌陽性轉化子接種辣椒、煙草幼苗葉片(1)將篩選的轉化子于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml)
下，200rpm震蕩培養(yǎng)Mh后，離心收集菌體于等體積MMA (10mmol/LMgC12、10mmol/L MES和 100mmol/L AS)中繼續(xù)誘導培養(yǎng)3小時，誘導后的菌體接種于5_6葉期的辣椒和本生煙幼苗，用5mL的無針頭無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片葉脈中，空載體和雙蒸水處理作對照，每個處理重復3次，接種后的辣椒、煙草葉片于空氣濕度75%的22°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2天后，轉入人工氣候室培養(yǎng)，接種后每天觀察記錄癥狀變化，至第10天為止。 其結果如圖2和圖3所示。實施列3(Pcnppl活性位點氨基酸點突變及線性突變基因于辣椒、煙草葉片的瞬時表達)
1、活性位點突變(1)根據(jù)已獲得Pcnppl基因全長序列，以參試辣椒疫霉菌CBS121657的RNA為模板進行RT-PCR擴增，獲得其cDNA全長，補充RNA提取方法。(2)根據(jù)預測活性位點的4個氨基酸，4個關鍵氨基酸分別突變，D112A突變引物 其序列如Seq ID No :7_8，Seq ID No :9-10所示)；H120A突變引物其序列如Seq ID No 7-8, Seq ID No:9_10 所示)；D123A 突變引物其序列如 kq ID No :7-8, Seq ID No :11-12 所示)；E125A突變引物其序列如kq ID No :7-8, Seq ID No :13-14所示)；4個關鍵氨基酸 D112/H120/D123/E125/A 同時突變，突變引物序列如 kq ID No :13-14, Seq ID No: 15-16所示，以Pcnppl cDNA為模板，擴增突變序列，所采用的擴增技術為常規(guī)PCR技術，并將擴增產(chǎn)物測序驗證。反應體系為50 μ L 擴增Pcnppl基因全長獲得cDNA模板O μ L)， 10Xbuffer(5y L)，dNTPGy L)，上、下游引物各 1 μ L, TaqE (0. 5 μ L), ddH20 (32. 5 μ L)。PCR 反應程序為94°C 4min ；94°C lmin，55°C 30s, 72°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0(3)突變序列測序驗證后，用于PVX載體構建。2、PVX載體構建(I)Cla I和Not I雙酶切突變質粒，回收插入片斷。(2)與同樣雙酶切的PVX(pGR106)表達質粒連接，轉化大腸桿菌DH5 α。(3)轉化后的DH5 α經(jīng)卡那霉毒抗性篩選，獲得菌落經(jīng)37°C搖床過夜提取質粒。(4)提取質粒經(jīng)酶切及測序鑒證后用于轉化農(nóng)桿菌。3、農(nóng)桿菌轉化根據(jù)以下步驟進行重組質粒提取(1)將含有目的質粒的大腸桿菌接種于含適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。(2)取 ImL 菌液至 1. 5mL 離心管中，8000rpm，離心 Imin0(3)去上清，收集菌體。(4)加入 200μ L 預冷的溶液 I(50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8.0)，
震蕩懸浮菌體。(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II (0. 2Μ NaCl, 1 % SDS)，顛倒離心管數(shù)次混勻， 12000rpm 離心 5min。(6)加入300 μ L預冷的溶液III (3Μ Κ+，5Μ Ac,)，顛倒混勻液體，置冰層5min， 12000rpm,離心5min，上清轉入另一只離心管中。(7)加入等體積苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min。(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置lOmin， 12000rpm離心lOmin，去上清。(9)沉淀用70%乙醇洗2次，倒置干燥。(10)回溶于30yL TE(含20yg的RNA酶)中，取5yL電泳檢測，其余-20°C保存。然后按照如下步驟利用凍融法進行農(nóng)桿菌轉化(1)挑GV3101單菌落于3ml LB液體培養(yǎng)基中(含利福平50mg/ml)，在下，200rpm震蕩培養(yǎng)Mh。(2)按1 100比例轉接100ml LB液體培養(yǎng)基中(含利福平50mg/ml)，相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)6- 至OD = 0. 6左右，用于制備感受態(tài)。(3)取1. 5ml菌液13000rpm離心30s，棄上清，用800 μ 1 CaCl2重懸菌體，于冰層放置30min，而后13000rpm離心30s棄上清。(4)再用100 μ 1 CaCl2重懸菌體，冰層放置備用。(5)取10 μ 1質粒加入200 μ 1感受態(tài)細胞中，冰層放置30min后，在液氮中放置 lmin，然后立刻轉到37°C水浴中熱擊5min。(6)迅速加入800 μ 1 LB液體培養(yǎng)基于下，200rpm震蕩培養(yǎng)2h。(7)然后稍試離心收集菌體，將其涂布于LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各 50mg/ml)，28°C下，倒置培養(yǎng) 48h.(8)農(nóng)桿菌轉化子篩選，挑取平板上轉化子的單斑于LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)， 然后提取質粒進行雙酶切和PCR驗證。4、農(nóng)桿菌陽性轉化子接種辣椒、煙草幼苗葉片將篩選的轉化子在LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉毒和利福平各50mg/ml) ,28°C下， 200rpm震蕩培養(yǎng)Mh ；然后離心收集菌體在等體積MMA (10mmol/L MgCl2、10mmol/L乙酰丁香酮和100mmol/L AS)中繼續(xù)誘導培養(yǎng)池。誘導后的菌體接種5-6葉期辣椒幼苗葉片和本生煙幼苗葉片，用5mL的無針頭無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入葉片葉脈中，空載體和雙蒸水作對照。每個處理重復3次，接種后的辣椒、煙草幼苗于75%空氣濕度，22°C的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2天后，轉入人工氣候室培養(yǎng)，接種后每天觀察記錄癥狀變化，至到第10天為止，其結果如圖4和圖5所示。實施列4(Pcnppl基因菌體內沉默及其沉默轉化子菌株致病性測定)1、Pcnppl基因沉默表達載體的構建(1)根據(jù)已獲得的Pcnppl基因全長序列，以參試辣椒疫霉菌CBS121657的RNA為模板進行RT-PCR擴增，獲得其cDNA全長(RNA提取步驟)。(2)根據(jù)其cDNA全長，設計引物，在上游引物(其序列如kq ID No :7所示)引入Sma I酶切位點，下游引物(其序列如kq ID No 8所示)引入Sma I酶切位點用于擴增含Sma I酶切位點的Pcnppl基因全長序列，用于沉默表達載體構建。反應體系為50 μ L 擴增Pcnppl基因全長獲得cDNA模板QyL), 10 X buffer (5 μ L)，dNTP G μ L)，上下游引物各 1 μ L, TaqE (0. 5 μ L)，ddH20 (32. 5 μ L)。PCR 反應程序為94°C 4min ；94°C lmin，57°C 30s, 72°C lmin，共；35 個循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin0取10 μ L反應產(chǎn)物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，獲得Pcnpp 1基因，然后與同樣雙酶切的ΡΗΑΜ34表達質粒連接，轉化大腸桿菌DH5 α，經(jīng)Amp抗性篩選、質粒DNA酶切鑒定，得到陽性克隆質粒PHAM34/PCnppl，送上海博亞生物有限公司測序。2、質粒提取分別提取重組質粒PHAM34/PCnppl以及沉默標記質粒PHSPNpt，步驟如下(1)將含有重組質粒的大腸桿菌接種于含適量抗生素的LB培養(yǎng)基中，37°C， 220-250rpm震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
(2)取 ImL 菌液至 1. 5mL 離心管中，8000rpm，離心 Imin0(3)去上清，收集菌體。(4)加入 200μ L 預冷的溶液 I(50mM 葡萄糖，25mM Tris-HCl, IOmM EDTA，pH8.0)，
震蕩懸浮菌體。(5)加入400 μ L新鮮配制的溶液II (0. 2Μ NaCl, 1 % SDS)，顛倒離心管數(shù)次混勻， 12000rpm 離心 5min。(6)加入300 μ L預冷的溶液III (3Μ Κ+，5Μ Ac,)，顛倒混勻液體，置冰層5min， 12000rpm,離心5min，上清轉入另一只離心管中。(7)加入等體積的苯酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，12000rpm離心5min。(8)上層水相轉入另一只離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后室溫放置lOmin， 12000rpm離心lOmin，去上清。(9)沉淀用70%乙醇洗2次，倒置干燥。(10)回溶于30yL TE(含20yg的RNA酶)中，取5yL電泳檢測，其余-20°C保存。3、辣椒疫霉轉化3.1辣椒疫霉菌株培養(yǎng)(1)將參試辣椒疫霉菌CBS121657于V8培養(yǎng)基平板25°C下黑暗培養(yǎng)4d，從菌落邊緣切取2X 2mm菌絲塊重新轉移至NPB固體培養(yǎng)基，在同樣條件下培養(yǎng)4d。(2)從菌落邊緣切取10 X IOmm菌絲塊，與裝有50ml液體NPB培養(yǎng)基250ml三角瓶中，每瓶6塊菌絲塊，共培養(yǎng)三瓶，25°C下黑暗培養(yǎng)2d。3. 2辣椒疫霉原生質體轉化(1)開始轉化前2-池，配制40%聚乙二醇-4000溶液，完全溶解后，用細菌過濾器除去菌體后置冰層。(2)用包有紗布的燒杯過濾收集菌絲，將菌絲用20ml 0. 8M的甘露醇漂洗一次，然后將菌絲移入50ml離心管中并加入35ml 0. 8M甘露醇，室溫下?lián)u洗IOmin。(3)配制20ml酶解液，在滅菌燒杯中溶解后備用。(4)將洗過的菌絲加到酶解液中，在室溫下酶解，酶解40-50min后，鏡鑒酶解效^ ο(5)用包有雙層Hiicra-Cloth(Sigma)的50ml燒杯中過濾原生質體，然后將濾出液倒入50ml離心管中，4°C 1500rpm離心3min，棄上清液。(6)加入 6ml W5 solution (5mM KCl, 125mM CaCl2,154mM NaCl，177mM 葡萄糖)輕輕重懸原生質體，再加入W5 solution至:35ml，4°C 1500rpm離心％iin，棄上清液。(7)加入6ml W5 solution輕輕重懸原生質體，將濃度調至2X 106/ml，于冰層放置30min，然后于4°C 1500rpm離心4min，棄上清液。(8)加入等體積的 MMg solution(0. 4M 甘露醇，15mM MgCl2,4mM 2-(N-嗎啉)-乙基磺酸)重懸原生質體，室溫放置lOmin。(9)取若干50ml離心管，然后分別加入pHSPN(約5μ 1)及15_20μ 1待轉化質粒。(10)每支離心管中加入Iml原生質體，至于冰層5_10min。(11)每支離心管中加入三次580 μ 1的聚乙二醇-4000溶液，共1.7鈿1聚乙二醇-4000溶液，加入過程輕輕轉動離心管，確保聚乙二醇-4000與原生質體均勻混合，冰層放置20min。(12)于滅菌培養(yǎng)皿中加入IOml利馬豆培養(yǎng)液(PM)，再加入20 μ 1氨芐(Amp)貯液(50 μ g/ml)。(13)每支離心離心管中先加入aiil PM培養(yǎng)液，并緩慢顛倒一次，冰層放置aiiin 后，再向分別加入8ml PM培養(yǎng)液并緩慢顛倒一次，冰曾放置aiiin。(14)將離心管中的液體于25°C下靜置過夜培養(yǎng)。(15)從過夜生長的培養(yǎng)皿中取5μ 1于顯微鏡下檢查再生情況，并將皿中液體吸 Λ 50ml 離心管中，2000rpm 5min。(16)棄上清液，使管內液體剩5ml左右，使其懸浮，然后于43°C下，加入15ml含 20 μ g/ml G418的PM固體培養(yǎng)基，吹干水汽，在25°C下黑暗培養(yǎng)2d ；(17)觀察培養(yǎng)基表面菌絲生長情況，待有大量菌絲生長后，用IOml含50 μ g/ml G418的PM固體培養(yǎng)基覆蓋生長的菌絲，并繼續(xù)培養(yǎng)。(18)培養(yǎng)3-4d后，待覆蓋培養(yǎng)基長出菌絲，將最終生長的菌落初步定為轉化子， 并于10°C冰箱內長期保存，用于生物學性狀和基因型分析。3. 3Pcnppl基因沉默轉化子菌株生物學表型分析沉默轉化子進行生物學性狀分析，包括菌絲、菌落形態(tài)及生長速率，孢子囊形態(tài)大小及數(shù)量，游動孢子鞭毛有無、萌發(fā)率及數(shù)量等。3. 4Pcnppl基因沉默轉化子菌株沉默效率分析提取轉化子培養(yǎng)菌體總RNA后，進行沉默效率分析，設計RT-PCR反應引物(其序列如kq ID No :19和^^ ID No :20)。以辣椒疫霉actinA基因為內參(其序列如kq ID No :21和kq ID No 22)，以野生型菌株及轉化標記質粒菌株為對照。PCR 反應采用體系 % :ddH20 (32. 5 μ L), 10 X buffer (5 μ L), MgCL2 (4 μ L), dNTPGyL)，上下游引物各IyL, DNA(2 μ L), TaqE (0. 5 μ L) 0反應條件為94°C預變性 5min,然后進行以下循環(huán)；94°C變性lmin，55°C退火30s，72°C延伸30s，共進行30個循環(huán)， 最后72°C總延伸lOmin. PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳分析，其結果如圖6所示。同時利用STOR Green熒光定量PCR分析Pcnppl基因轉化子沉默效率，設計 RT-PCR反應引物(序列如kq ID No :19和kq ID No :20所示)，以辣椒疫霉actinA基因為內參(序列如ID No :21和kq ID No :22)，以野生型菌株及轉化標記質粒菌株為對照，反應體系2. 5XrealMasterMix及20XSTOR solution混合物9 μ L，上下游引物各 0. 5μ L, cDNA 2μ L, ddH20 SyL0利用Bio-Radi Cycler進行反應，條件如下95°C預變性2min，然后進行擴增；94°C變性15s，55°C退火15s，68°C延伸30s，共 45個循環(huán)，最后65-95°C制備溶解曲線。選擇actinA為內參基因，每個樣品重復三次，用 2_ΔΔα法對樣本基因進行表達差異相對定量分析，計算方法為Δ ACt= (CTtargetCTactinA)待測樣本 _ (CTtargetCTactinA)校準樣本， 其結果如圖7所示。4. 3. 5辣椒疫霉Pcnppl基因沉默轉化子致病性測定游動孢子誘導(1)將參試辣椒疫霉菌株轉移至10% V8培養(yǎng)基培養(yǎng)4d，從菌落邊緣挑取菌絲塊移至新鮮10% V8培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4d備用。(2)挑取菌落邊緣菌絲塊至10% V8培養(yǎng)基培養(yǎng)，25°C黑暗培養(yǎng)5_6d。(3)加滅菌水(以浸沒菌絲為宜)，每隔Id換水至游動孢子產(chǎn)生，并調節(jié)游動孢子濃度至IX IO5個/ml。利用游動孢子懸浮液進行致病性分析。按照如下步驟接種辣椒葉片進行致病性測定將誘導的游動孢子接種培育的自交系辣椒(5-6葉期)葉片，游動孢子濃度調至 IXlO5個/ml。將選取葉片消毒70%乙醇處理30s，0. 1 %升汞處理7min，于滅菌水中沖洗 3次，晾干備用，晾干后將葉片平鋪于預準備水瓊脂平板，每個平板放置3片，每個葉片接種 2μ1游動孢子懸浮液，每個樣品接10個葉片，野生型辣椒疫霉菌、標記質粒的轉化子游動孢子懸浮液及無菌水作對照，每個實驗重復3次，每天觀察記載癥狀變化，拍照記錄，其結果如圖8所示。
權利要求
1.一種辣椒疫霉誘導壞死蛋白基因Pcnppl，其特征在于其基因序列如kq ID No 1 所示；其氨基酸序列為SEQ ID NO :2所示，該基因編碼的農(nóng)桿菌瞬時表達蛋白能夠導致辣椒、煙草葉片產(chǎn)生壞死。
2.一種辣椒疫霉誘導壞死蛋白基因Pcnppl基因分離克隆及其在辣椒煙草內瞬時表達的方法，其特征在于其步驟如下DPcnppl基因分離克隆具體步驟 A 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA ；B 根據(jù)已報道的細菌、真菌、卵菌的誘導壞死蛋白基因序列信息，比較分析辣椒疫霉全基因組信息，正確鑒定其誘導壞死基因成員，并設計特異引物PcnpplF，其序列如kq ID No :3所示，和pcnpplR，其序列如^^ ID No :4所示，分離目的基因，陽性克隆測序獲得基因全長序列；2)Pcnppl基因在辣椒煙草內瞬時表達的具體步驟A =Pcnppl基因PVX表達載體構建設計特異引物pvxF (其序列如kq ID No 5所示) 和pvxR(其序列如kq ID No :6所示)，構建Pcnppl基因瞬時表達載體，將目的基因克隆至表達載體PVX(pGR106)；B 提取上述重組表達載體質粒，轉化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，利用抗生素利福平及卡那霉毒篩選陽性農(nóng)桿菌轉化子；C 將上步篩選出的陽性農(nóng)桿菌化子利用LB液體培養(yǎng)基，其中含卡那霉毒和利福平各 50mg/ml，震蕩培養(yǎng)，收集菌體后，用無菌注射器將農(nóng)桿菌懸浮液壓入辣椒、煙草葉片中，使其進行瞬時表達。
3.如權利要求1所述Pcnppl基因，其活性位點突變及其突變基因瞬時表達方法，其特征在于其步驟如下1)根據(jù)已報道的necrosis-inducing protein，NPP 蛋白結構，利用 overlap-PCR方法， 利用基因序列如^^ ID No :3-14的引物分別將其與其它同類基因比對分析界定的該類基因活性位點氨基酸的4個氨基酸D112A，H120A，D123A，E125A進行點突變及線性突變；2)突變序列測序驗證后，利用引物其基因序列分別如^^ID No:5的ID No 6的pvxR所示，構建PVX(pGR106)表達載體，提取上述重組表達載體質粒，然后轉化農(nóng)桿菌；3)篩選陽性農(nóng)桿菌轉化子接種辣椒、煙草，通過比較接種寄主葉片癥狀變化情況，比較活性位點突變效果。
4.如權利要求1所述的Pcnppl基因，其穩(wěn)定沉默表達載體構建及其沉默菌株制備方法，其特征在于其步驟如下A:根據(jù)kq ID No :1所示的Pcnppl基因序列，設計特異引物gsF，其序列如^^ ID No: 17所示，和特異引物gsR，其序列如^^ ID No 18所示，構建Pcnppl基因沉默表達載體，將目的基因克隆至沉默表達載體PHAM34中；B 將上述重組載體轉化辣椒疫霉原生質體，利用抗生素G418篩選陽性辣椒疫霉轉化子；C:所獲得的陽性農(nóng)桿菌轉化子培養(yǎng)，誘發(fā)產(chǎn)生游動孢子后接種辣椒葉片進行致病性測定。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術領域，特別提供了克隆自辣椒疫霉的1個誘導壞死蛋白基因Pcnpp1及其誘導組織細胞死亡的功能特性。依據(jù)現(xiàn)代基因操作技術，證明了該基因有效的參與了辣椒疫霉侵染辣椒寄主及其調控組織細胞死亡乃至導致受害部位產(chǎn)生明顯壞死癥狀的性能；證明了該基因氨基酸序列中4個氨基酸為蛋白酶活性關鍵氨基酸。因此，該技術發(fā)明提供了辣椒疫霉一個具誘導壞死性能的重要功能基因及其研究技術體系，相關技術規(guī)程為深入開展植物病原卵菌重要功能基因研究提供了的技術儲備。
文檔編號C12N15/10GK102268445SQ20111016297
公開日2011年12月7日 申請日期2011年6月16日 優(yōu)先權日2011年6月16日
發(fā)明者張修國 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學