專利名稱：一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用海藻糖(trehalose)誘導(dǎo)培養(yǎng)提高畢赤酵母菌種O0ZcAia cariMica)對水果采后病害防治效力的方法，屬于水果采后生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
水果在采摘、運(yùn)銷、儲(chǔ)藏過程中因腐爛造成的損失是巨大的，也是全球關(guān)注的問題。據(jù)報(bào)道，在發(fā)達(dá)國家有10% - 30%的新鮮產(chǎn)品由于采后病害導(dǎo)致腐爛，而在缺乏貯運(yùn)冷藏設(shè)備的發(fā)展中國家，果實(shí)采后腐爛率則高達(dá)40% — 50%。國外水果貯藏保鮮量占水果總產(chǎn)量60%以上，目前我國果品貯藏量800多萬噸，不到總量的15%，其中冷藏庫和氣調(diào)庫的貯藏量為70萬噸，僅占總產(chǎn)量的7%。我國水果采后損失一般在20% - 30%，高者甚至達(dá)到 50%。2007年3月國家統(tǒng)計(jì)局發(fā)布的《中華人民共和國2006年國民經(jīng)濟(jì)和社會(huì)發(fā)展統(tǒng)計(jì)公報(bào)》顯示，2006年我國水果總產(chǎn)量達(dá)17050萬噸。據(jù)此估算，我國水果采后的損失每年將達(dá)到數(shù)百億元人民幣的水平。水果腐爛的主要原因在于病原微生物的致病作用，這些病原微生物主要有灰葡 11 iBotrytis cinerea ) > ^1{Rhizopus s toloniger ) > iPenicillium spp.)、 毛霉 iMucor spp.)、鏈格孢(Al ternaria spp.)、曲霉(Aspergillus spp.)和軟腐細(xì)菌 (.Erwinia )等。病原微生物對采后水果的危害不僅在于其導(dǎo)致水果在數(shù)量上造成的嚴(yán)重?fù)p失，而且由于許多病原真菌能分泌產(chǎn)生許多次生代謝產(chǎn)物從而引起嚴(yán)重的食品安全問題，如擴(kuò)展青霉0°.權(quán)/？浙仰 )產(chǎn)生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢儀ci/^rea)產(chǎn)生的葡雙醛霉素(botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐爛的方法是低溫貯藏和化學(xué)殺菌劑處理。近年來低溫貯藏技術(shù)在我國得到了廣泛的發(fā)展和應(yīng)用，但已有的冷藏設(shè)備往往不能滿足大多數(shù)水果的需要。同時(shí)，在低溫條件下仍有相當(dāng)數(shù)量的致病菌能夠在水果上生長，并造成水果腐爛。 例如，能引起多種水果灰霉病的灰葡萄孢、BotiyriS cinerea)，也稱灰霉菌，在_0. 5°C時(shí)也能生長繁殖，引起許多水果腐爛變質(zhì)，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。而那些對低溫敏感的水果，因只能在不低于使產(chǎn)品受冷害的溫度下貯藏，病原物的生長、繁殖更不能得到有效地抑制，腐爛相當(dāng)嚴(yán)重。長期以來，控制水果采后病害的主要措施是使用殺菌劑?；瘜W(xué)殺菌劑對防治病害可以起到立竿見影的效果，但是，化學(xué)殺菌劑長期和大量的使用，不僅導(dǎo)致病原微生物產(chǎn)生抗藥性，同時(shí)嚴(yán)重污染環(huán)境，有損于人類健康。美國國家科學(xué)院(National Academy of Scinces)的一份報(bào)告顯示，在用于處理食品的全部農(nóng)藥中，殺菌劑構(gòu)成60%的致癌危險(xiǎn)。隨著國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展和消費(fèi)水平的提高，人們對食品安全和環(huán)境保護(hù)意識的日益增強(qiáng)，目前多種化學(xué)殺菌劑^WCaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果產(chǎn)品上限制使用，其直接的后果是目前許多水果采后病害已經(jīng)沒有殺菌劑能予以控制。因此，各國科學(xué)家都在積極地探索能代替化學(xué)殺菌劑的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。當(dāng)前國際上對用拮抗微生物進(jìn)行水果采后病害的生物防治的研究已經(jīng)取得了階段性的成果， 并認(rèn)為這是最有希望取代化學(xué)殺菌劑的方法之一。
隨著酵母分類、生態(tài)、生理、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的研究取得進(jìn)展，人們對果蔬貯藏中利用酵母的興趣日益提高。國內(nèi)外的研究表明，許多酵母菌應(yīng)用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，這些酵母被稱為拮抗酵母。酵母菌遺傳穩(wěn)定，抑菌譜廣、效價(jià)高，一般不產(chǎn)生對人和寄主植物有害的代謝產(chǎn)物，安全性高，且對營養(yǎng)要求低，生長快，并對多種脅迫、逆境具有較強(qiáng)的耐受力，對大多數(shù)殺菌劑不敏感，對其它化學(xué)和物理處理能夠相容。因此近年來拮抗酵母作為水果采后病害生防菌，受到國際上的廣泛關(guān)注。國外方面， Sansone等從蘋果表面分離得到的粘紅酵母對由召OiiTiis Cinerea引起的灰霉病有顯著的防治效果，在實(shí)驗(yàn)室條件下，其腐爛率與對照相比降低了 M%。Calvente等的研究也發(fā)現(xiàn)粘紅酵母對水果采后青霉病害有顯著的抑制效果。我國水果采后病害生物防治研究起步較晚，鄭曉冬等在體外和體內(nèi)抑菌試驗(yàn)中研究了粘紅酵母對由指狀青霉引起的柑桔青霉腐爛的抑制效果，發(fā)現(xiàn)粘紅酵母在控制由指狀青霉引起的柑桔腐爛中顯示出了很高的抑菌活性，在25°C條件下，對照的發(fā)病率為10096，而使用IX IO8個(gè)/mL的菌懸液的發(fā)病率僅為45 %,而且隨著酵母濃度的提高，發(fā)病率也有逐漸下降的趨勢。張紅印等研究了粘紅酵母對草莓采后灰霉病的抑制效果，對草莓進(jìn)行了前期的預(yù)處理后，接種IX IO9個(gè)/mL的菌懸液和IX IO5個(gè)/mL的病原菌孢子菌懸液分別在4°C下貯藏7天和20°C下貯藏2天后，發(fā)現(xiàn)接種粘紅酵母的草莓，其腐爛率與對照相比分別降低了 95%和94.7 %。范青O001)等對果實(shí)病害生物防治拮抗菌進(jìn)行了篩選和分離，結(jié)果表明季也蒙假絲酵母(Pandida guiliermondii), 檸檬形克勒克酵母iKloGckerei、漢遜德巴利酵母iPebaryomyces hansenii) 對甜櫻桃褐腐病都表現(xiàn)出顯著的抑制效果，季也蒙假絲酵母和檸檬形克勒克酵母能有效地防治核果類果實(shí)軟腐??；Tian (2004)等研究，在甜櫻桃采前噴灑1 X 108CFU/mL的絲孢酵母{Trichosporon / /"^肅)，羅倫隱球酵母{Cryptococcus laurentii)和紅酵母 (Mhodotorula glutinis)，分別在25°C ,0°C以及氣調(diào)貯藏下，絲孢酵母在果實(shí)上繁殖數(shù)量最高，抑菌效果最好；張紅印等000 研究了不同溫度下，羅倫隱球酵母對灰霉病的防治效果，結(jié)果表明，25°C下，梨灰霉病的發(fā)病率為16. 7%，結(jié)合CaCl2使用效果更顯著。從國內(nèi)外文獻(xiàn)中可知當(dāng)前以有效微生物取代化學(xué)殺菌劑用于采后水果病害的防治已顯示出巨大的應(yīng)用前景，水果采后病害的生物防治成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。但到目前為止，已實(shí)際應(yīng)用于生產(chǎn)的拮抗菌種類不多，只有Biosave和Aspire等少數(shù)幾種產(chǎn)品上市， 而我國目前尚沒有拮抗菌應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。主要原因在于商業(yè)生產(chǎn)條件下，目前已報(bào)道的拮抗微生物的防治效果往往不如化學(xué)殺菌劑的效果，從而達(dá)不到保鮮要求。這些因素影響了拮抗菌作為果蔬保鮮劑在生產(chǎn)中的使用。為了盡快地將拮抗微生物應(yīng)用于水果貯藏保鮮實(shí)際生產(chǎn)上，還需進(jìn)一步篩選拮抗效果好、抗病譜廣的微生物，并進(jìn)一步提高拮抗酵母的拮抗效力，從而將其應(yīng)用于水果貯藏保鮮。中國專利CN201010M0638公開了一種提高粘紅酵母對水果采后病害的生物防治效力的方法，該方法利用殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)粘紅酵母，提高粘紅酵母的生物防治效力，從而達(dá)到保鮮水果的目的。本發(fā)明利用海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)卡利比克畢赤酵母，提高卡利比克畢赤酵母的生物防治效力，與殼聚糖相比，海藻糖價(jià)格低廉，處理方法簡單，且具有較好的生物防治效果。海藻糖是Wiggers于1832年從黑麥的麥角菌中首次提取的，隨后發(fā)現(xiàn)它在自然界中的動(dòng)植物和微生物中廣泛存在，包括低等植物、藻類、細(xì)菌、真菌以及脊椎動(dòng)物，特別是酵母、霉菌、蘑菇等真菌中，有時(shí)含量竟高達(dá)干重的15%以上。海藻糖是由兩個(gè)葡萄糖分子通過半縮醛羥基以α -1，1糖苷鍵連接的非還原性雙糖，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，化學(xué)惰性，無毒性， 對熱、酸都非常穩(wěn)定，是天然雙糖中最穩(wěn)定的糖質(zhì)。它廣泛存在于自然界中，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性，可作為生物分子的保護(hù)劑。海藻糖的生物學(xué)功能使得其能在醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)、食品科學(xué)、分子生物學(xué)等具有廣闊而誘人的運(yùn)用前景。
本發(fā)明利用海藻糖來提高卡利比克畢赤酵母、Pichia caribbica )的拮抗效力，從而降低水果的腐爛率，進(jìn)而達(dá)到水果貯藏保鮮的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在培養(yǎng)基中添加不同濃度的海藻糖，對畢赤酵母進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，提供了一種提高畢赤酵母生物防治效力的方法。經(jīng)海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的畢赤酵母，可以明顯地抑制水果病原菌，防止水果采后腐爛。本發(fā)明具有安全、高效、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛地用于水果采后病害的生物防治過程中，減少水果采后病害造成的損失。本發(fā)明同時(shí)提供了一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，按照下述步驟進(jìn)行將卡利比克畢赤酵母G0ZcAia⑵riMica)活化，用NYTB培養(yǎng)基培養(yǎng)卡利比克畢赤酵母(Pichia caribbica),離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1 X IO8個(gè)/ mL的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡Imin后馬上取出，自然風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。其中所述的NYTB培養(yǎng)基中碳源為0. 2% 一 1%的海藻糖和0% — 0. 8%的葡萄糖，即酵母膏5g，牛肉浸膏8g，海藻糖2 — 10g，葡萄糖0 — 8g，純化水1000ml，pH自然。其中所述的卡利比克畢赤酵母iPichia caribbica )，保藏菌株編號為CGMCC No.3616。其中所述的水果優(yōu)選蘋果、桃或草莓。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)
(1)本發(fā)明所使用的卡利比克畢赤酵母G^idia caribbica)為本實(shí)驗(yàn)室篩選，其拮抗效力強(qiáng)，對人體無害。(2)本發(fā)明所使用的海藻糖來源廣泛，價(jià)格低廉，無毒無害。(3)本發(fā)明使用海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)畢赤酵母，能增加其內(nèi)源海藻糖含量的積累，從而提高畢赤酵母的拮抗活性。(4)本發(fā)明使用海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)畢赤酵母，與傳統(tǒng)的葡萄糖培養(yǎng)基相比較，可以顯著提高卡利比克畢赤酵母O0Zdia caribbica)的拮抗活性，從而降低水果的腐爛率，進(jìn)而達(dá)到水果貯藏保鮮的目的。(5)本發(fā)明使用海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)后的畢赤酵母可以代替化學(xué)殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學(xué)殺菌劑對人的危害，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。


其中圖1為不同濃度海藻糖誘導(dǎo)后的畢赤酵母對蘋果青霉病的抑制效果；注CK 對照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB:碳源用1%的海藻糖(用NYTB 表示)。發(fā)病率是20°C放置7d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖2為不同濃度海藻糖誘導(dǎo)后的畢赤酵母對蘋果灰霉病的抑制效果；注CK 對照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB 碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。發(fā)病率是20°C放置7d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖3為不同濃度海藻糖誘導(dǎo)后的畢赤酵母對桃果根霉病的抑制效果；注=CK 對照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB:碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。發(fā)病率是25°C放置5d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖4為不同濃度海藻糖誘導(dǎo)后的畢赤酵母對桃果青霉病的抑制效果；注CK 對照；0. 2 碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；0. 5 碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；0. 8 碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；NYTB 碳源用1%的海藻糖(用NYTB表示)。發(fā)病率是25°C放置5d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(p=0. 05)。圖5利用海藻糖和殼聚糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的畢赤酵母對草莓根霉病的抑制效果；注CK 對照；NYDB:用葡萄糖作為碳源培養(yǎng)的畢赤酵母；海藻糖碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；殼聚糖碳源用0.5%的殼聚糖和0.5%的葡萄糖。發(fā)病率是20°C放置3d后測定的結(jié)果。不同字母代表差異顯著性(P=O. 05)。
具體實(shí)施例方式通過借助以下實(shí)施實(shí)例將更加詳細(xì)的說明本發(fā)明。以下實(shí)施例僅是說明性的，本發(fā)明并不受這些實(shí)施實(shí)例的限制?？ɡ瓤水叧嘟湍窸0ZcAia caribbica)系本實(shí)驗(yàn)室篩選得到，現(xiàn)保存于位于中國北京的北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國科學(xué)院微生物研究所，中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏菌株編號為CGMCC No. 3616，于NYDA (NYDB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加洲的瓊脂(質(zhì)量計(jì)))培養(yǎng)基4°C低溫保存。NYDB培養(yǎng)基中酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，純化水1000ml,自然pH。培養(yǎng)程序?yàn)?1)固體活化將畢赤酵母接種于NYDA培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)48h ； (2)液體培養(yǎng)在250ml的三角瓶中裝入50 ml的NYDB種子培養(yǎng)基，用接種環(huán)接入一環(huán)活化好的畢赤酵母，在200rpm，28°C條件下培養(yǎng)20h ； (3)誘導(dǎo)培養(yǎng)將上述培養(yǎng)混合物7000Xg 條件下離心lOmin，無菌蒸餾水洗滌兩次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)，并用無菌蒸餾水重新懸浮酵母細(xì)胞，血球記數(shù)板調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5 X IO8個(gè)/mL。在250ml的三角瓶中分別裝入50ml NYDB 培養(yǎng)基或海藻糖補(bǔ)充培養(yǎng)基(碳源用0. 2%的海藻糖和0. 8%的葡萄糖；碳源用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖；碳源用0. 8%的海藻糖和0. 2%的葡萄糖；碳源用1%的海藻糖(用NYTB 表示))，并加入上述濃度的酵母細(xì)胞培養(yǎng)液lml，然后在200 rpmJ8°C條件下培養(yǎng)Mh ;(4) 離心分離再懸浮上述不同處理酵母培養(yǎng)混合物在7000 Xg條件下，離心10-15min，并用無菌蒸餾水洗滌2次，以去除培養(yǎng)介質(zhì)，用無菌蒸餾水重新再懸浮，并用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞濃度為1 X IO9個(gè)/mL，再用滅過菌的生理鹽水稀釋到所需濃度。
其中使用的海藻糖購自廣西南寧杰沃利生物制品有限公司。實(shí)施例1 海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)畢赤酵母對水果病害的抑制效果
一、試驗(yàn)方案
水果處理后，用消過毒的打孔器在每個(gè)果實(shí)表面赤道部位形成統(tǒng)一大小和深度的傷口。其中草莓的表面?zhèn)跒?mm (直徑)X 3mm (深)，桃果的表面?zhèn)跒?mm (直徑)X 3mm (深)，蘋果的表面?zhèn)跒?mm(直徑)X5mm(深)。每個(gè)傷口處等量加入30 μ 1( 1)經(jīng)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的酵母懸浮液；(2)經(jīng)海藻糖補(bǔ)充培養(yǎng)基(碳源用海藻糖和葡萄糖)培養(yǎng)的酵母懸浮液；(3)無菌水(作為對照)。；Bh后，在每個(gè)傷口處加入等量30 μ 1的病原菌孢子iM. cinerea 濃度為 1 X IO5 spores mr1 ；/7. expansum WM為 5 X IO4 spores/ mL, R. stolonifer ^c 度為IXlO4 spores/ mL)( spores/ mL表示Iml中霉菌孢子的個(gè)數(shù))。自然晾干后，將果實(shí)放入塑料筐并用保鮮膜密封，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(濕度95%)，桃果置于25°C，草莓和蘋果置于 20 0C ο每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)18個(gè)果實(shí)。整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。經(jīng)過若干天的培養(yǎng)， 記錄果實(shí)發(fā)病率，以此評價(jià)卡利比克畢赤酵母A ^riMica的抑菌效果。發(fā)病率的計(jì)算公式如下
發(fā)病率(%)=發(fā)病的果實(shí)/接種病原菌的果實(shí)總數(shù)X 100%
二、試驗(yàn)結(jié)果
按照上述步驟試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)水果的腐爛率結(jié)果如下 1.1對蘋果青霉病及灰霉病的抑制效果
從圖1和圖2中可以看出，畢赤酵母經(jīng)海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)后，其對青霉和灰霉的發(fā)病率顯著降低，特別是當(dāng)使用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖做為碳源培養(yǎng)酵母時(shí)，其青霉和灰霉的發(fā)病率僅為11. 11%和8. 34%，顯著地低于對照蘋果及不經(jīng)海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)的畢赤酵母處理的蘋果的青霉和灰霉病的發(fā)病率。
1. 2對桃果根霉病及青霉病的抑制效果
由圖3和圖4的試驗(yàn)結(jié)果表明，通過添加海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)能顯著提高畢赤酵母對蘋果及桃果由灰葡萄孢、葡枝根霉及擴(kuò)展青霉引起的病害的控制效力，最佳誘導(dǎo)量為0. 5%。實(shí)施例2 海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)畢赤酵母對水果貯藏品質(zhì)的影響一、試驗(yàn)方案
試驗(yàn)水果采摘后直接用以下處理浸泡果實(shí)lmin =(I)NYDB培養(yǎng)基培養(yǎng)的畢赤酵母懸浮液；(2)海藻糖補(bǔ)充培養(yǎng)基(用0. 5%的海藻糖和0. 5%的葡萄糖)培養(yǎng)的的酵母懸浮液；(3) 無菌水(作為對照)。然后將果實(shí)放在塑料筐內(nèi)，風(fēng)干后用保鮮膜密封，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) (濕度95%)，草莓，蘋果置于20°C，一段時(shí)間后進(jìn)行貯藏品質(zhì)分析。每處理重復(fù)3次，每次重復(fù)10個(gè)果實(shí)，整個(gè)試驗(yàn)重復(fù)2次。貯藏品質(zhì)分析方法如下
(1)失重率稱重法。失重率=(處理前質(zhì)量-儲(chǔ)藏后質(zhì)量)/處理前質(zhì)量X100%
(2)硬度采用TA-XT2i質(zhì)構(gòu)分析儀測試，探頭直徑為5mm，探頭測試前、測試中、測試后的運(yùn)行速度分別為4. Omm s^U.Omm Omm s—1，草莓測試深度為6 mm，蘋果測試深度為 10mm，探頭插入水果時(shí)所受的最大阻力(單位為牛頓)就被定義為水果的硬度。每個(gè)水果繞赤道處每120°測定3次。
(3)總可溶性固形物采用WYT (0-80%)手持糖量計(jì)進(jìn)行測定，測定結(jié)果表示為 g/100g 樣品。(4)可滴定酸度(％):采用滴定法，從6個(gè)果中稱取20 g果肉，加蒸餾水20ml勻漿，用40ml蒸餾水洗入IOOml容量瓶。置于80°C水浴浸提30min，每隔5min攪拌一次，取出冷卻，定容至刻度。過濾，取20 ml濾液置于IOOml小燒杯中，測定草莓時(shí)投入一片紅色石蕊試紙，測定蘋果時(shí)加入三滴酚酞指示劑，用0. 1 mol Γ1 NaOH進(jìn)行滴定。當(dāng)石蕊試紙變藍(lán)或溶液至微紅時(shí)為滴定終點(diǎn)。草莓以含檸檬酸百分含量表示，蘋果以含蘋果酸的百分含量表示。每處理3次重復(fù)。(5)維生素C含量的測定紫外快速測定法。從6個(gè)水果上取20g果肉樣品加20ml 1%鹽酸勻漿，50ml容量瓶定容至刻度。10000Xg，4°C條件下離心10 mim，上清用于測定。 取0. 4 ml提取液，放入盛有0. 8 ml 10% HCl的10 ml刻度試管中，用蒸餾水稀釋至刻度后搖勻。以蒸餾水為空白，在M3nm處測定吸光度。另吸取0.細(xì)1提取液，分別加入細(xì)1蒸餾水和1. 6 ml Imoir1 NaOH溶液至IOml至刻度試管，搖勻，靜置15min后。加入1. 6 ml 10%HC1，混勻，加蒸餾水定容至刻度。以蒸餾水為空白，在M3nm處測定吸光度。由待測液及堿處理待測液的A243值之差，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中維生素C的含量。每處理3次重復(fù)。(6)褐變度6個(gè)水果稱取20 g果肉組織，加入40ml蒸餾水勻漿，10000Xg，4°C條件下離心lOmim，取上清IOml加入95%乙醇15ml 10000 X g，4°C條件下離心lOmim，取上清液于420nm測定吸光度值，以此表示褐變程度。每處理3次重復(fù)。二、試驗(yàn)結(jié)果
按照上述步驟試驗(yàn)，統(tǒng)計(jì)蘋果貯藏品質(zhì)的結(jié)果如下 表1海藻糖誘導(dǎo)后的畢赤酵母對草莓儲(chǔ)藏品質(zhì)的影響
權(quán)利要求
1.一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于按照下述步驟進(jìn)行將卡利比克畢赤酵母G0Zdia⑵riMica)活化，用NYTB培養(yǎng)基培養(yǎng)卡利比克畢赤酵 mPichia caribbica),離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1 X IO8個(gè)/mL的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡Imin后馬上取出，自然風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的NYTB培養(yǎng)基中碳源為0. 2% - 1%的海藻糖和0% - 0. 8%的葡萄糖，即酵母膏 5g，牛肉浸膏8g，海藻糖2 — 10g，葡萄糖0 — 8g，純化水1000ml，pH自然。
3.根據(jù)權(quán)利要求1一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的卡利比克畢赤酵母O0ZcAia cariMica)，保藏菌株編號為CGMCC No. 3616。
4.根據(jù)權(quán)利要求1一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法，其特征在于其中所述的水果為蘋果、桃或草莓。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高畢赤酵母對水果采后病害生物防治效力的方法。屬于水果采后生物防治領(lǐng)域。將畢赤酵母活化，接種到添加有0.2%-1%海藻糖的NYTB培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，離心得到菌體；將菌體用無菌水稀釋制備成1×108個(gè)/ml的菌懸液；將水果放入菌懸液中，浸泡1min后馬上取出，自然風(fēng)干；放在塑料筐中，用保鮮膜密封后，放在室溫條件下存放。本發(fā)明使用海藻糖誘導(dǎo)培養(yǎng)提高畢赤酵母防治水果采后病害的效力，使用簡單，操作方便，效果好，成本低。誘導(dǎo)培養(yǎng)后的畢赤酵母可以代替化學(xué)殺菌劑防治水果采后病害，避免使用化學(xué)殺菌劑對人的危害，具有顯著的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
文檔編號C12R1/84GK102283281SQ20111016673
公開日2011年12月21日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者代春華, 任曉鋒, 劉偉民, 張曉云, 張紅印, 朱淑云, 趙利娜 申請人:江蘇大學(xué)