專利名稱：一種檢測無乳鏈球菌的方法和試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類致病菌的檢測技術(shù)，特別是無乳鏈球菌的檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
羅非魚(Tilapia)為一種中小形魚，它是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)培養(yǎng)的淡水養(yǎng)殖魚類， 且被譽(yù)為未來動物性蛋白質(zhì)的主要來源之一，但是隨著羅非魚的高密度養(yǎng)殖，細(xì)菌性疾病的發(fā)生日益嚴(yán)重。無乳鏈球菌(Sti^ptococcus agalactiae)為 B 群鏈球菌(group B Streptococcus, GBQ，具有廣泛的宿主范圍，能感染人和多種動物，對水產(chǎn)動物感染性很強(qiáng)，可引起羅非魚、虹鱒、海鯉和鯔魚等魚類敗血癥和腦膜炎，具有較高的致病率和致死率。 近年來，由無乳鏈球菌引起的羅非魚爆發(fā)性疾病時有發(fā)生，且爆發(fā)范圍廣，死亡率極高。目前，臨床上對無乳鏈球菌的檢測方法主要依靠對患病樣品中病原微生物學(xué)分離、培養(yǎng)和生化試驗(yàn)等進(jìn)行鑒定，但這種方法操作繁瑣，檢測周期長，不利于臨床上人們對患病魚的快速診斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)在檢測水產(chǎn)動物致病菌方面得以廣泛應(yīng)用， 現(xiàn)已有使用PCR技術(shù)檢測無乳鏈球菌的方法?！半p重PCR快速鑒別無乳鏈球菌和海豚鏈球菌”，黎炯等，湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010 年第4卷第36期第449-452頁公開了通過特異性的擴(kuò)增無乳鏈球菌的cfb基因和海豚鏈球菌16s rRNA基因來檢測無乳鏈球菌和海豚鏈球菌的方法，用該方法擴(kuò)增無乳鏈球菌和海豚鏈球菌可分別獲得474bpJ92bp的特異性片段，擴(kuò)增嗜水氣單胞菌和銅綠假單胞菌則無特異性片段。但是該檢測方法僅擴(kuò)增無乳鏈球菌的一段基因序列，易出現(xiàn)假陽性，且該文章沒有報(bào)道該方法檢測其他魚類致病菌，如，金黃色葡萄球菌、鮰愛德華氏菌殺鮭氣單胞菌、 豚鼠氣單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌的結(jié)果，難以保證該檢測方法的準(zhǔn)確性和特異性。莢膜多糖(capsularpoly-saccharide cps)為無乳鏈球菌的主要致病因子，其血清型較多，現(xiàn)已有十種血清型(Ia，lb, II IX)被確認(rèn)，其中l(wèi)a、讓和III型為目前確定的水生動物源血清型，而這三中血清型均包含cpsF基因，而且親源性為98% 100%。目前還沒有通過擴(kuò)增無乳鏈球菌cpsF基因檢測無乳鏈球菌的方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的檢測無乳鏈球菌的試劑盒和方法。首先，本發(fā)明提供了一種檢測魚類致病菌的試劑盒，其包含序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物對1，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因；或者/和包含序列如SEQ ID N0:3 4所示的引物對2，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因。本發(fā)明又提供了一種檢測魚類致病菌的方法，包括如下步驟a，提取樣本DNA 提取待檢樣本中的DNA ；
b，基因擴(kuò)增用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增；C,結(jié)果檢測對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。前述步驟a所述的樣本為魚體或養(yǎng)殖水體；所述的魚體為魚體的肝臟或者腎臟。本發(fā)明還提供了 SEQ ID NO :1 2所示的寡核苷酸序列或者/和SEQ IDNO 3 4所示的寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于擴(kuò)增或檢測來自無乳鏈球菌的基因。本發(fā)明提供的試劑盒和方法可以特異的擴(kuò)增無乳鏈球菌基因組中的cpsF基因和 cfb基因序列，而不會擴(kuò)增得到其他魚類致病菌的基因片段，可以準(zhǔn)確、有效的檢測出待檢樣本是否感染無乳鏈球菌，同時，敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時短，檢測快速，可以用于魚病的快速檢測和預(yù)測，預(yù)防魚病的發(fā)生，提高經(jīng)濟(jì)效益。


圖1 HN0201批次Gimsa染色肝組織觸片圖2 HN0201批次革蘭氏染色結(jié)果圖3 HN0201分離的無乳鏈球菌負(fù)染電鏡觀察呈鏈狀(X 17000)圖4分離株與鏈球菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹圖5分離株與鏈球菌屬細(xì)菌的序列相似性比較，其中，1-8為分離株；9為 S. dysgalctiae 停乳鏈球菌；10 為 S. s.halichoeri ；11 為 S. hyiontestinalis 豬腸鏈球菌； 12 為 S. thoraltensis ； 13 為 S. agalactiae 無乳鏈球菌；14 為 S. phocae ； 15 為 S. uberis 乳房鏈球菌；16為S. canis狗鏈球菌；17為S. iniae海豚鏈球菌；18為S. porcinus豕鏈球菌； 19 為 S. didelphis ；20 為 S. castoreus ；21 為 S. pyogenes 釀膿鏈球菌；22 為 S. ictaluri 鮰
；23 % S. parauberis圖6單一引物PCR擴(kuò)增結(jié)果泳道M為Marker DL2000,泳道1為cfb基因，泳道 2為cpsF基因。圖7 CpsF基因測序比對結(jié)果圖8 cfb基因測序比對結(jié)果圖9雙重PCR條件優(yōu)化結(jié)果泳道M為Marker DL2000,泳道1為cpsF基因和cfb 基因的雙重PCR產(chǎn)物。圖10雙重PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果泳道M為Marker DL2000,泳道1表示模板為無乳鏈球菌陽性菌株基因組，泳道2表示模板為無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組，泳道3為陰性對照，泳道4表示模板為鮰愛德華氏菌基因組，泳道5表示模板為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌基因組， 泳道6表示模板為海豚鏈球菌基因組，泳道7表示模板為殺鮭氣單胞菌基因組，泳道8表示模板為嗜水氣單胞基因組，泳道9表示模板為金黃色葡萄球菌基因組，泳道10表示模板為豚鼠氣單胞菌基因組。圖11雙重PCR敏感度實(shí)驗(yàn)結(jié)果泳道M為Marker DL2000,泳道1表示模板為濃度為7. 632ng/ μ L的樣品DNA，泳道2表示模板為濃度為7. 632 X KT1ng/ μ L的樣品 DNA,泳道3表示模板為濃度為7. 632X 10 / μ L的樣品DNA，泳道4表示模板為濃度為 7. 632Χ 10_4ng/ μ L的樣品DNA，泳道5表示模板為濃度為7. 632 X 10 / μ L的樣品DNA。圖12雙重PCR對人工感染羅非魚組織中無乳鏈球菌檢測結(jié)果泳道M為Marker DL2000，泳道1為陰性對照，泳道2、4、6、8、10為無乳鏈球菌人工感染羅非魚腎臟組織DNA檢測，泳道3、5、7、9、11為人工感染無乳鏈球菌羅非魚肝臟組織DNA檢測，泳道12 無乳鏈球菌陽性對照。圖13雙重PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果泳道M為Marker DL2000,泳道1表示模板為無乳鏈球菌HN0303基因組，泳道2表示模板為無乳鏈球菌HN0302基因組，泳道3表示模板為無乳鏈球菌HN0203基因組，泳道4表示模板為無乳鏈球菌HN020基因組，泳道5表示模板為無乳鏈球菌HN0201基因組，泳道6示模板為無乳鏈球菌HN0101基因組，泳道7表示模板為無乳鏈球菌陽性對照，泳道8為陰性對照。
具體實(shí)施例方式一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器1、試驗(yàn)菌株無乳鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株購于ATCC菌種庫，編號51487 ；無乳鏈球菌分離株HN0101、 HN0201、HN0202、HN0203、HN0302、HN0303、HN0401來源于羅非魚，由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并保存；海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、鮰愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，購買于ATCC。2、主要試劑細(xì)菌DNA抽提試劑盒購于TaKaRa，批號DV810A ；組織中細(xì)菌DNA抽提試劑盒購于 Takara，批號:DV811A ;dNTP、MgC12、10XPCR Buffer、Taq 酶和 Gold View 購于 Tiangen ；瓊脂糖購于Sigma。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1病原菌的分離與鑒定1、試驗(yàn)動物發(fā)病羅非魚海南多處發(fā)病地區(qū)采集的羅非魚病料；健康羅非魚崇州通威苗種繁育場。2、方法2. 1病料采集對海南省文昌市的馮坡鎮(zhèn)、文教鎮(zhèn)、華僑農(nóng)場和海南省西南部的興隆鎮(zhèn)等地采集的八批病料，用于病原學(xué)研究。病料采集自發(fā)病魚池，從每個魚池采集具有典型發(fā)病癥狀的鮮活羅非魚10 30尾，典型發(fā)病癥狀為旋游，側(cè)翻，眼凸癥狀不明顯，腦部充血，膽囊腫大， 肝腎出血，采集的病魚部分用于現(xiàn)場剖檢和臟器檢測，部分病料采用迅速冰凍，低溫冰凍空運(yùn)送往四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心實(shí)驗(yàn)室診斷，病料來源和編號如下編號HN0101，2009年8月27日來自海南省文昌市某發(fā)病羅非魚養(yǎng)殖場；編號HN0201，2009年8月5日來自海南省華僑農(nóng)場八隊(duì)養(yǎng)殖戶王建偉處；編號HN0202，2009年9月5日來自海南省文昌市文教鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶吳利貴處；編號HN0203，2009年9月5日來自海南省文昌市馮坡鎮(zhèn)養(yǎng)殖戶柯群喜處；編號HN0301，2009年9月沈日來自海南省興隆鎮(zhèn)朱秋生處；編號HN0302，2009年9月沈日來自海南省興隆鎮(zhèn)李玉良處；
編號HN0303，2009年9月沈日來自海南省興隆鎮(zhèn)某魚塘；編號HN0401，2009年9月18日來自海南送樣。2. 2病原學(xué)檢測2. 2. 1寄生蟲檢測取病料的鰓絲和腸道黏液進(jìn)行水壓片，光學(xué)顯微鏡觀察。2. 2. 2細(xì)菌學(xué)檢測組織觸片檢測在無菌條件下，取病料的肝和眼球的小塊組織，于潔凈載玻片上制備組織觸片，采用Gimsa染色后對觸片進(jìn)行觀察。細(xì)菌分離檢測無菌采取病樣的肝臟和大腦，劃線接種于腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上， 30°C培養(yǎng)24h 4 后，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，通過對單個菌落革蘭氏染色鏡檢，直至獲得純菌株；對分離純化的菌株進(jìn)行透射電鏡形態(tài)觀察；對分離到的菌株進(jìn)行低溫保種和斜面保種進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2. 2. 3病毒檢測在無菌條件下，取病料的組織臟器肝、脾、腎、腦，進(jìn)行反復(fù)凍融研磨，制備組織勻漿，將組織勻漿離心后取上清過除菌濾器，并添加雙抗得到疑似帶毒液。將疑似帶毒液進(jìn)行魚的活體攻毒，觀察魚體是否發(fā)病。2. 2. 4動物回歸試驗(yàn)將8株分離菌株接種腦心浸液肉湯，恒溫水浴振蕩器30°C培養(yǎng)Mh后，用麥?zhǔn)媳葷峁苷{(diào)節(jié)細(xì)菌濃度至108cfu/mL，0. 2mL/尾，每株細(xì)菌攻毒5尾健康羅非魚(健康羅非魚分別來自海南興隆某養(yǎng)殖場，體重100士5g和四川崇州某養(yǎng)殖場，體重450士20g)，以無菌肉湯接種作為陰性對照，具體分組見表1?；貧w實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在30°C和35°C兩個水溫下同時進(jìn)行。表1動物實(shí)驗(yàn)分組情況
權(quán)利要求
1.一種檢測魚類致病菌的試劑盒，其特征在于包含序列如SEQ ID NO :1 2所示的引物對1，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因；或者/和包含序列如SEQ ID NO :3 4所示的引物對2，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因。
2.一種檢測魚類致病菌的方法，其特征在于包括如下步驟 a，提取樣本DNA 提取待檢樣本中的DNA ；b，基因擴(kuò)增用權(quán)利要求1所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進(jìn)行擴(kuò)增； c,結(jié)果檢測對DNA擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測。
3.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于步驟a所述的樣本為魚體或養(yǎng)殖水體。
4.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的魚體為魚體的肝臟或者腎臟。
5.SEQ ID NO :1 2所示的寡核苷酸序列或者/和SEQ ID NO :3 4所示的寡核苷酸序列的用途，其特征在于其用于擴(kuò)增或檢測來自無乳鏈球菌的基因。
全文摘要
一種檢測魚類致病菌的方法和試劑盒，涉及一種無乳鏈球菌的檢測技術(shù)。本發(fā)明提供了一種檢測魚類致病菌的試劑盒，其包含序列如SEQ ID NO1～2所示的引物對1，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因；或者/和包含序列如SEQ ID NO3～4所示的引物對2，擴(kuò)增來自無乳鏈球菌的基因。本發(fā)明還提供利用上述試劑盒檢測魚類致病菌的方法。本發(fā)明提供的檢測試劑盒和檢測方法可以準(zhǔn)確、有效的檢測無乳鏈球菌，且敏感性高、特異性強(qiáng)、耗時短，檢測快速，可以用于魚病的快速檢測和預(yù)測，預(yù)防魚病的發(fā)生，提高經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12Q1/04GK102242202SQ20111016983
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月28日
發(fā)明者劉天強(qiáng), 康琦, 汪開毓, 王均, 肖丹, 陽濤 申請人:通威股份有限公司