專利名稱：一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的清除試劑及其使用方法。
背景技術(shù)：
支原體是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的污染物，會干擾實驗結(jié)果，但是由于支原體的二分裂時間為1-6小時，所以支原體污染培養(yǎng)細(xì)胞后初期不易察覺。在細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染支原體來源于口腔支原體(M. orale)、精氨酸支原體(M. arginini)、豬鼻支原體 (M. hyorhinis)和萊氏無膽甾原體(A. Iaidlawii)。培養(yǎng)細(xì)胞污染支原體后依不同支原體的抗原性及生化代謝差別而會有不同的致病性，但大致表現(xiàn)是相同的，最開始引起實驗者注意的是培養(yǎng)的細(xì)胞生長變緩慢，之后培養(yǎng)液很快就變黃，而且細(xì)胞生長周期延長，繼而在某次傳代后出現(xiàn)細(xì)胞間大量黑點，細(xì)胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的細(xì)胞，細(xì)胞固縮，最終完全死亡。在細(xì)胞培養(yǎng)中，腫瘤系細(xì)胞一般為3η 如體，分裂時比2η體的原代細(xì)胞染色質(zhì)組蛋白合成量更多。而精氨酸作為組蛋白的主要構(gòu)成成分，在腫瘤系細(xì)胞分裂時所需的精氨酸量更大，所以相較于原代細(xì)胞，對支原體更敏感，所以黑點現(xiàn)象在腫瘤系細(xì)胞中更容易出現(xiàn)，出現(xiàn)后也更明顯。而原代細(xì)胞污染支原體后的表現(xiàn)主要是生長緩慢，細(xì)胞變形，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的空泡，逐漸出現(xiàn)巨細(xì)胞化及拉網(wǎng)現(xiàn)象，另外，有些懸浮生長的細(xì)胞在支原體污染后，除了生長緩慢外，經(jīng)常出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)集現(xiàn)象。支原體分類屬于柔膜體綱，支原體目，其中能通過0.22um濾膜污染培養(yǎng)細(xì)胞的有支原體科和無膽留原體科兩個科，包括支原體屬的約80個種和無膽留原體的8個種中的某些種。由于支原體分類與細(xì)菌有差異，故一般用于細(xì)菌的抗生素并不能很好的殺滅抑制支原體，由于其種類繁多，故需選用有針對性的廣譜抗生素聯(lián)合用藥才能達(dá)到最大限度的清除和抑制，而目前并沒有研究出能夠系統(tǒng)消除支原體污染的試劑及方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法， 能夠系統(tǒng)的檢測出支原體的種類并將清除，可以有效的清除支原體污染，并不會對細(xì)胞的本身代謝帶來影響。所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于1. 一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、 C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5% ；B液由喹諾酮類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹諾酮類衍生物質(zhì)量_體積百分比濃度為0.5% -1.5% ；C液由四環(huán)素類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合后四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量_體積百分比濃度為0. 25% -0. 75% ；所述A液、B液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2 ；所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。所述半合成截短側(cè)耳素衍生物選用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。所述喹諾酮類衍生物選用抗生素恩諾沙星或麻保沙星或單諾沙星。所述四環(huán)素類衍生物選用多西環(huán)素或二甲胺四環(huán)素。一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于包括以下步驟a、支原體檢測(1)提取細(xì)胞培養(yǎng)物中基因組DNA ；(2)將步驟⑴中提取的基因組DNA放入待測試管，使用設(shè)計的支原體檢測簡并引物，使用PCR方法擴(kuò)增提取的基因組DNA目的片段，所述檢測引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，
反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠上樣電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，根據(jù)產(chǎn)物片段判斷支原體種類；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用；(2)取半合成截短側(cè)耳素衍生物溶于0. OlMPBS配制成半合成截短側(cè)耳素衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的A液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取喹諾酮類衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的B液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌， 分裝，避光在-20°C凍存；取四環(huán)素類衍生物溶于0. OlMPBS配制成四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25%-0. 75%的C液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um —次性濾器過濾除菌， 分裝，避光在-20°C凍存；C、支原體清除步驟A中所檢測出來的支原體種類為同屬支原體，將配置好的A液、B液等體積混合，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過程中，每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器；步驟A中所檢測出來的支原體種類為不同屬的混合支原體，A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋333倍，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過程中，每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS 清洗培養(yǎng)容器。在步驟a中，觀察成像系統(tǒng)，如果觀察到結(jié)果中的PCR產(chǎn)物片段單一，則直接純化PCR產(chǎn)物后測序，檢測出支原體的種類；如果PCR產(chǎn)物片段為混合污染，多個條帶陽性，則將陽性片段克隆入T載體，挑取單克隆后測序，檢測出支原體的種類。所述A液、B液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物和喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。本發(fā)明中A液、B液均為無色透明液體，C液則為淡黃色透明液體。將A液和B液按照培養(yǎng)截短側(cè)耳素類藥物與氟喹諾酮類藥物濃度比為3 2混合稀釋后，加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，可以預(yù)防培養(yǎng)細(xì)胞的支原體污染。A液、B液、C液注意避光保存，低溫冷凍。-20°C避光保存2年有效，_70°C保存可長期保存，4°C避光一周有效，常溫4 有效。使用過程中也盡量避光。使用本發(fā)明試劑和方法，如污染不嚴(yán)重，可在一周內(nèi)顯效。如污染嚴(yán)重，至少要處理兩周，還可以用來預(yù)防污染。經(jīng)治處理的污染細(xì)胞，治療周期完成后，細(xì)胞間無黑點，細(xì)胞生長周期回復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，無團(tuán)聚生長。預(yù)防處理的培養(yǎng)基使用，在已經(jīng)清除污染源的情況下，可最大限度預(yù)防污染再次發(fā)生。


圖1是實施例一、二、三中使用清除試劑前后對照圖，A是A549細(xì)胞治療前的熒光照片，A’是A549細(xì)胞治療治療后的熒光照片；B是SH-SY細(xì)胞治療前的熒光照片，B’是SH-SY細(xì)胞治療后的熒光照片；C是HELA細(xì)胞的治療前的熒光照片，C，是HELA細(xì)胞治療后的熒光照片；圖2是實施例一、二、三PCR產(chǎn)物電泳圖，圖3是實施例二測序圖，圖4是實施例四中細(xì)胞接種及藥物加入示意圖，圖5是實施例四中反應(yīng)產(chǎn)物熔解曲線，圖6是實施例五中細(xì)胞接種及藥物加入示意圖，圖7是實施例五內(nèi)參照片段的反應(yīng)曲線圖，圖8是實施例五中目的片段的反應(yīng)曲線圖，圖9是實施例五中反應(yīng)產(chǎn)物片段熔解曲線圖。
具體實施例下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。實施例一所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液等體積混合而成，其中A液由泰妙菌素和0. OlMPBS混合而成，混合液中泰妙菌素的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由恩諾沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩諾沙星質(zhì)量_體積百分比濃度為；將A液、B液等體積混合，混合液中泰妙菌素與恩諾沙星質(zhì)量比為3 2。
一種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用A549細(xì)胞(人肺腺癌細(xì)胞)的培養(yǎng)作為實驗對象，其具體步驟如下a、支原體檢測(1)A549細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(美國公司GIBCO公司生產(chǎn))加入10% FBS (國產(chǎn)四季清胎牛，無支原體級)配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02， 20% 02，相對濕度100%的無菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)取步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測試管中，使用設(shè)計的支原體檢測引物，使用PCR方法擴(kuò)增，所述檢測引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；可以同時將兩種引物加入同一個待測試管，也可以分開放入兩個待測試管。(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)觀察，觀察結(jié)果如圖2，圖2中1、2、3泳道為A549細(xì)胞檢測條帶，樣品分別采集自不同的培養(yǎng)者，顯示和312bp處的無膽甾原體，分別代表萊氏無膽甾原體(Achol印Iasma laidlawii)禾口中度無膽留原體(Acholeplasma mocurum)；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用(2)分別配置A液、B液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為 1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液，分裝，_20°C凍存；C、支原體清除將配置好的A液、B液等體積混合制成清除試劑，其混合后泰妙菌素和恩諾沙星的濃度比為3 2。將清除試劑加入A549細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，稀釋后泰妙菌素和恩諾沙星的質(zhì)量-體積比分別為15ug/ml和lOug/ml，其中，每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理2周，待治療過程中A549細(xì)胞長滿至瓶底面積的 60% -80%時，胰酶消化傳代，轉(zhuǎn)新瓶培養(yǎng)2周。取上述AB液清除試劑處理后的A549細(xì)胞，再次進(jìn)行PCR檢測。未再檢測出陽性片段。將污染的未經(jīng)清除試劑處理的A549細(xì)胞用hoechst33258藍(lán)色染料染色(染料使用濃度300nM)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片A。同時將處理后的A549細(xì)胞也用 h0echst33258藍(lán)色染料(300nM)染色觀察照相，見圖1中照片A’。胞漿中的綠色熒光為針對 LC3 (microtubule associated protein 1 light chain 3-LC3)的一抗，F(xiàn)ITC 標(biāo)記的二抗免疫熒光顯色。將A549細(xì)胞治療前的熒光照片圖A與治療后的熒光照片圖A’對比，其結(jié)果為治療前可見細(xì)胞內(nèi)由支原體污染激活的吞噬泡；治療后細(xì)胞生理狀態(tài)明顯恢復(fù)，細(xì)胞內(nèi)無明顯空泡聚集。實施例二所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液等體積混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由麻保沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中麻保沙星的質(zhì)量_體積百分比濃度為；A液、B液等體積混合，混合液中沃尼妙林與麻保沙星質(zhì)量比為3 2。一種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用SH-SY-5Y細(xì)胞(人神經(jīng)母細(xì)胞瘤) 的培養(yǎng)作為實驗，其具體步驟如下a、支原體檢測(1) SH-SY-5Y細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBC0公司生產(chǎn))加入10% FBS (國產(chǎn)四季清太牛，無支原體級)配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02,20% 02，相對濕度100%的無菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)取步驟(1)中提取的基因組DNA分別放入兩個待測試管中，并在兩個PCR反應(yīng)管中分別放入下面兩種支原體檢測引物，使用PCR方法擴(kuò)增，其檢測引物序列為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，； (3)分別取兩個試管中的PCR產(chǎn)物以2 %瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，PCR產(chǎn)物成像結(jié)果如圖2，圖2中7、8、9泳道為SH-SY細(xì)胞檢測條帶，第7道未見無膽留原體片段，第8道可見472bp肺支原體(M. Pulmonis)片段產(chǎn)物，第9道為空白對眧.
/、、、 G) PCR產(chǎn)物切膠回收后，直接連接PMD19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染實驗室制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5ci株，涂板37°C培養(yǎng)過夜挑克隆，小提質(zhì)粒酶切鑒定后送測序；(5)測序結(jié)果如圖3，結(jié)果證實SH-SY-5Y細(xì)胞為實驗鼠呼吸道來源的支原體 (Mycoplasma pulmonis)污染；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12H20,0. 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用⑵)分別配置A液、B液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為 1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)麻保沙星溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成麻保沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液，分裝，-20°C凍存；C、支原體清除將配置好的A液、B液等體積混合制成清除試劑，其混合后沃尼妙林和麻保沙星的質(zhì)量比為3 2。將清除試劑加入SH-SY-5Y細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋500倍，稀釋后沃尼妙林和麻保沙星的質(zhì)量-體積比分別為15ug/ml和10ug/ml，每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理2周，待治療過程中SH-SY-5Y細(xì)胞長滿至瓶底面積的 60% -80%時，胰酶消化傳代，轉(zhuǎn)新瓶培養(yǎng)，處理1-2周。取上述AB液清除試劑處理后的中SH-SY細(xì)胞，提取基因組DNA，再次進(jìn)行PCR 檢測。未再檢測出陽性片段，將污染的未經(jīng)清除試劑處理的SH-SY-5Y細(xì)胞做熒光染色 hoechst和PI雙染，hoechst染料5ug/ml，PI染料0. 5ug/ml (含RNAase)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片B，用同種方法檢測處理后的SH-SY-5Y細(xì)胞觀察照相，見圖1中的照片B，。將SH-SY細(xì)胞治療前的熒光照片B與治療后的熒光照片B’對比，其結(jié)果為治療前PI染色可見細(xì)胞外花環(huán)狀排列的支原體集落；經(jīng)治療后PI染色未見明顯異常結(jié)構(gòu)。實施例三所述一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑由A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由沃尼妙林和0. OlMPBS混合而成，混合液中沃尼妙林的質(zhì)量_體積百分比濃度為1.5% ；B液由恩諾沙星和0. OlMPBS混合而成，混合液中恩諾沙星的質(zhì)量_體積百分比濃度為；C液由二甲胺四環(huán)素和0. OlMPBS混合而成，混合液中二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量_體積百分比濃度為0.5% ；A液、B液、C液等體積混合，混合液中沃尼妙林、恩諾沙星、二甲胺四環(huán)素質(zhì)量比為—種用以上試劑清除支原體污染的方法，選用HELA細(xì)胞的培養(yǎng)作為實驗，其具體步驟如下a、支原體檢測(I)HELA細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基以DMEM高糖培養(yǎng)基(GIBC0公司生產(chǎn))加入10% FBS(國產(chǎn)四季清太牛，無支原體級)配成完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞培養(yǎng)于37°C，5% C02,20% 02，相對濕度100%的無菌溫箱；按蛋白酶K法快速提取基因組DNA ；(2)將步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測試管，然后向試管中加入經(jīng)標(biāo)記的支原體檢測引物，使用PCR方法擴(kuò)增，所述檢測引物為支原體屬正向引物5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3，無膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠在TAE緩沖液中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，觀察結(jié)果如圖2，圖2中，4，5，6泳道為HELA細(xì)胞檢測條帶，第4道所示為萊氏無膽甾原體(A. Laidlawii)產(chǎn)物，第5道和第6到所示為混合污染的支原體屬產(chǎn)物；G) PCR產(chǎn)物切膠回收后，直接連接PMD19T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)染實驗室制備的感受態(tài)大腸桿菌DH5ci株，涂板37°C培養(yǎng)過夜挑克隆，小提質(zhì)粒酶切鑒定后送測序；
(5)檢測結(jié)果，測序證實HELA細(xì)胞為混合污染，既有血清來源的無膽留原體也有實驗動物來源的支原體多種；b、清除劑配置(1)取 8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用(2)分別配置A液、B液、C液；取1. 5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS 溶液中，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為1.5%的A液，分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為1 %的B液， 分裝，-20°C凍存；取二甲胺四環(huán)素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng) 0. 22um 一次性濾器過濾除菌配制成二甲胺四環(huán)素質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5%的C液， 分裝，-20°C凍存。C、支原體清除將配置好的A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，其混合后泰妙菌素、恩諾沙星和二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量比為3 2 1。將配置好的清除試劑加入HELA細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中稀釋333倍，稀釋后泰妙菌素、恩諾沙星和二甲胺四環(huán)素的質(zhì)量-體積比分別約為 15ug/ml、10ug/ml和5ug/ml。每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS洗瓶壁至少一次，處理 2周，待治療過程中HELA細(xì)胞長滿至瓶底面積的60% -80%時，胰酶消化傳代；傳代時收集消化下來的細(xì)胞，特別注意需吹散成單細(xì)胞懸液，然后用離心洗滌的方法傳代。(分散的支原體沉降系數(shù)小，常規(guī)的轉(zhuǎn)速下可以留在上清中棄去，減少培養(yǎng)物中的荷菌量，故轉(zhuǎn)速宜低速500-800r/min)棄去離心后的培養(yǎng)基后，以0. OlMPBS重懸細(xì)胞沉淀，吹勻后再次離心，重復(fù)至少1次，洗滌后的細(xì)胞轉(zhuǎn)入新瓶培養(yǎng)(舊瓶棄去)。經(jīng)上述處理程序后的HELA細(xì)胞恢復(fù)快速生長，細(xì)胞周期約Mh，故需頻繁傳代，同上述方法傳代，換液交替處理，至首次用藥處理的第14天終止。取上述ABC液清除試劑處理后的HELA細(xì)胞，再次進(jìn)行PCR檢測。未再檢測出陽性片段。將污染的未經(jīng)清除試劑處理的HELA細(xì)胞做hoechst33258染料染色(染料使用濃度300nM)，熒光顯微鏡觀察照相，如圖1中的照片C，同時將處理后的HELA細(xì)胞做 hoechst33258染料(300nM)染色觀察照相，如圖1中的照片C’。將HELA細(xì)胞的治療前的熒光照片C和治療后的熒光照片C’作為對比，其結(jié)果為 治療前白色箭頭示細(xì)胞核外藍(lán)染小點，為支原體陽性染色，圖片中橫線為20um;治療后視野背景清晰，無核外藍(lán)染小點，支原體染色陰性。實施例四本發(fā)明通過本實施例對于A液、B液、C液單獨效力進(jìn)行檢測，其具體操作如下(1) 分別配置A液、B液、C液；取1.5g(1500mg)泰妙菌素溶于IOOml 0. OlMPBS溶液中，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um 一次性濾器過濾除菌制成泰妙菌素質(zhì)量-體積百分比濃度為1. 5%的A液， 分裝，-20°C凍存；取Ig(IOOOmg)恩諾沙星溶于IOOmlO. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過濾除菌制成恩諾沙星質(zhì)量-體積百分比濃度為的B液，分裝，-20°C凍存；取二甲胺四環(huán)素0. 5g(500mg)溶于IOOml 0. 01MPBS，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過濾除菌配制成二甲胺四環(huán)素質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5%的C液，分裝，-20°C凍存。
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(2)將實施例二中污染單一種支原體的SH-SY細(xì)胞換用新鮮完全培養(yǎng)基培養(yǎng)；(3)將A、B、C液分別設(shè)4個2倍稀釋的濃度梯度，加入完全培養(yǎng)基，即終濃度分別為，A 液 16、8、4、2ug/ml ；B 液 16、8、4、2ug/ml ；C 液 8、4、2、lug/ml。(4)將上述污染的細(xì)胞接種入12孔板，依濃度梯度分別用藥物處理，處理組合方式見附圖4;(5)處理一周后，如實施例1方法提取基因組DNA，用于PCR檢測；(6)將測序構(gòu)建的PMD19T載體質(zhì)粒做10倍的梯度稀釋；(7)用檢測引物做熒光定量PCR檢測支原體模版的拷貝數(shù)，其檢測引物為(正向引物 5，GGAGCTGGTAATGCCCAAAGT 3，反向引物5，ACGTTCTCGTAGGGATACCTTG3，)(8)采用絕對定量法絕對定量以質(zhì)粒測濃度后作為標(biāo)準(zhǔn)品，10倍梯度稀釋，共6 個梯度，根據(jù)插入片段后質(zhì)粒分子量算出質(zhì)粒模板mol濃度，再換算成實際模板分子數(shù)，根據(jù)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖幻計算待測樣品的實際模板分子數(shù)，數(shù)據(jù)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計處理。結(jié)果見數(shù)據(jù)統(tǒng)計表1。表權(quán)利要求
1.一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5%-1.5% ；B液由喹諾酮類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5% -1.5% ；C液由四環(huán)素類衍生物和0. OlMPBS混合而成，混合液中四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25% -0. 75% ；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述A液、B液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液中半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述半合成截短側(cè)耳素衍生物選用延胡索酸泰妙菌素或沃尼妙林或瑞他帕林。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述喹諾酮類衍生物選用抗生素恩諾沙星或麻保沙星或單諾沙星。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑，其特征在于 所述四環(huán)素類衍生物選用多西環(huán)素或二甲胺四環(huán)素。
6.一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于包括以下步驟a、支原體檢測(1)提取細(xì)胞培養(yǎng)物中基因組DNA；(2)將步驟(1)中提取的基因組DNA放入待測試管，使用設(shè)計的支原體檢測簡并引物， 使用PCR方法擴(kuò)增提取的基因組DNA目的片段，所述檢測引物為支原體屬正向引物 5，ACACCATGGGAGYTGGTAAT3，反向引物 5，CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT3‘無膽甾原體屬正向引物5，GAAAGGGAGGGAGCCGTCAAG3，反向引物5，TGCCAAGGCATCCACTGTGTG3，；(3)將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物以2%瓊脂糖凝膠上樣電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察，根據(jù)產(chǎn)物片段判斷支原體種類；b、清除劑配置(1)取8gNaCl，0. 2gKCl，2. 87gNa2HP04 · 12Η20，0· 27gKH2P04 溶于 1000ml 去離子水或三蒸水，經(jīng)過121°C高溫103Kpa高壓滅菌，制成0. OlMPBS溶液，在4°C環(huán)境下冷藏備用；(2)取半合成截短側(cè)耳素衍生物溶于0.OlMPBS配制成半合成截短側(cè)耳素衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5%-1.5%的A液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取喹諾酮類衍生物溶于0. OlMPBS配制成喹諾酮類衍生物質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 5% -1. 5%的B液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；取四環(huán)素類衍生物溶于0. OlMPBS配制成四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量-體積百分比濃度為0. 25% -0. 75%的C液，在超靜臺內(nèi)經(jīng)0. 22um—次性濾器過濾除菌，分裝，避光在-20°C凍存；C、支原體清除步驟A中所檢測出來的支原體種類為同屬支原體，將配置好的A液、B液等體積混合， 然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋到一定濃度，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度為37°C、 5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過程中，每24h換液一次，換液時用0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器；步驟A中所檢測出來的支原體種類為不同屬的混合支原體，A液、B液、C液等體積混合制成清除試劑，然后加入完全培養(yǎng)基中稀釋一定濃度，培養(yǎng)7-14天，其中細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境為溫度為37°C、5% C02,20% 02、100%濕度；在培養(yǎng)過程中，每24h換液一次，換液時用 0. OlMPBS清洗培養(yǎng)容器。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于在步驟a中，觀察成像系統(tǒng)，如果觀察到結(jié)果中的PCR產(chǎn)物片段單一，則直接純化PCR產(chǎn)物后測序，檢測出支原體的種類；如果PCR產(chǎn)物片段為混合污染，多個條帶陽性，則將陽性片段克隆入T載體，挑取單克隆后測序，檢測出支原體的種類。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種使用權(quán)利要求1所述的清除試劑清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的方法，其特征在于所述A液、B液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物和喹諾酮類衍生物的質(zhì)量比為3 2;所述A液、B液、C液等體積混合后，混合液半合成截短側(cè)耳素衍生物、喹諾酮類衍生物和四環(huán)素類衍生物的質(zhì)量比為3 2 1。
全文摘要
本發(fā)明提供一種用于清除細(xì)胞培養(yǎng)中支原體污染的試劑及其使用方法。所述試劑由A液、B液等體積混合或A液、B液、C液等體積混合而成，其中A液由半合成截短側(cè)耳素衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.5％-1.5％；B液由喹諾酮類衍生物和0.01MPBS混合，混合溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃為0.5％-1.5％；C液由四環(huán)素類衍生物和0.01MPBS混合，混合后溶質(zhì)的質(zhì)量-體積百分比濃度為0.25％-0.75％。使用本發(fā)明試劑和方法，污染不嚴(yán)重，可在一周內(nèi)顯效。經(jīng)治處理的污染細(xì)胞，治療周期完成后，細(xì)胞間無黑點，細(xì)胞生長周期回復(fù)正常，細(xì)胞形態(tài)正常，無團(tuán)聚生長及拉網(wǎng)現(xiàn)象。
文檔編號C12Q1/04GK102409019SQ20111017139
公開日2012年4月11日 申請日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者胡曉鵬 申請人:胡曉鵬