專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法及所用培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增領(lǐng)域。本發(fā)明特別涉及用于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的培養(yǎng)基以及使用所述培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cell, NSC)是存在于胚胎和成體腦、脊髄等神經(jīng)組織中的ー種干細(xì)胞，是ー類(lèi)具有分裂潛能和自更新能力的母細(xì)胞，可通過(guò)不對(duì)等的分裂方式分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)組織的各類(lèi)細(xì)胞，也可轉(zhuǎn)分化成血細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞。在腦、脊髄等所有神經(jīng)組織中，不同的神經(jīng)干細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生的子代細(xì)胞種類(lèi)不同，分布也不同。目前的科學(xué)技術(shù)已經(jīng)可以在體外培養(yǎng)擴(kuò)增神經(jīng)干細(xì)胞，用于生命科學(xué)研究、藥物篩選測(cè)試、臨床應(yīng)用研究等領(lǐng)域。神經(jīng)干細(xì)胞通常的分離提取方法是，采用化學(xué)或機(jī)械方法將胚胎或成體的腦、脊髓等神經(jīng)組織分散成單細(xì)胞后，或者對(duì)培養(yǎng)的干細(xì)胞進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化后，對(duì)獲得的細(xì)胞混合液初步培養(yǎng)一段時(shí)間，由于神經(jīng)干細(xì)胞具有形成神經(jīng)球的特性，可以通過(guò)挑選神經(jīng)球的方法從中分離獲得少量神經(jīng)干細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞通常的培養(yǎng)擴(kuò)增方法是，將用前段所述方法獲得的神經(jīng)球作為初始種子，接種入含血清或不含血清的培養(yǎng)液，置于5% C02、37°C條件下培養(yǎng)，每培養(yǎng)到一定程度就挑選合適的神經(jīng)球進(jìn)行消化傳代，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增，以滿(mǎn)足研究或測(cè)試需求的數(shù)量和質(zhì)量。(《人胚神經(jīng)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定》，羅樹(shù)偉，謝常青，盧光，中南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2004，29 (2) : 129-131 ；《早期人胚神經(jīng)干細(xì)胞分布及分離培養(yǎng)》，呂海俠，翟偉，劉勇等，西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2003年4月第24卷第2期97-100 ；《胎鼠脊髄源性神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定》，李勇，敬曉棋，竇忠英，中國(guó)生物工程雜志，2005，25 (6)25-30 ；《誘導(dǎo)人臍血神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞分化的研究》，季旭東，高超，楊月景，河南醫(yī)學(xué)研究，2005年9月第14卷第3期215-219 ;《異體和自體骨髄源神經(jīng)干細(xì)胞周?chē)窠?jīng)移植實(shí)驗(yàn)研究》，李貴濤，徐如祥，姜曉丹等，中國(guó)矯形外科雜志，2007年7月第13卷第14期，1087-1089 ；《人和小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)的分化研究》，吳益民，喻紅，林麗珠等，復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002年2月第41卷第I期，57-62)。由于血清具有成分復(fù)雜、質(zhì)量不穩(wěn)定、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)，雖然有血清時(shí)培養(yǎng)擴(kuò)增效率較高，然而無(wú)血清培養(yǎng)仍然成為發(fā)展趨勢(shì)，目前一般采用添加了生長(zhǎng)因子、抗生素等成分的DMEM或者DMEM/F12培養(yǎng)液作為神經(jīng)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液(《體外血清預(yù)培養(yǎng)促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞増殖》，萬(wàn)虹，歷俊華，張紹東，中國(guó)臨床康復(fù)，2006，10 (45))。神經(jīng)干細(xì)胞有靜態(tài)培養(yǎng)和動(dòng)態(tài)培養(yǎng)兩種方式，前者是用細(xì)胞培養(yǎng)瓶放在溫箱中靜態(tài)條件下培養(yǎng)，在無(wú)血清條件下擴(kuò)增效率較低(《哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增技術(shù)研究進(jìn)展》，董良，齊瀚實(shí)，生物技術(shù)，2005，15(4));后者是利用細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器在旋轉(zhuǎn)等動(dòng)態(tài)條件下培養(yǎng)，擴(kuò)增效率較高，然而生物反應(yīng)器價(jià)格昂貴，并且部分情況下為了實(shí)驗(yàn)的方便或由于實(shí)驗(yàn)條件的要求，神經(jīng)干細(xì)胞不適合用生物反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)増。
此外，目前神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)還需要添加抗生素，有可能對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的進(jìn)ー步應(yīng)用造成影響。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種新的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，其對(duì)神經(jīng)球的挑選、培養(yǎng)液的配方和換液時(shí)機(jī)等接種培養(yǎng)エ藝進(jìn)行了改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)了在靜態(tài)培養(yǎng)條件下神經(jīng)干細(xì)胞10-15天的擴(kuò)增效率達(dá)到7-14倍，并且本發(fā)明所述方法不需要添加抗生素，更好的滿(mǎn)足科研和エ業(yè)化生產(chǎn)的需要。在ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，所述方法包括
(a)將神經(jīng)干細(xì)胞接種在包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(b)2、3或4天后在培養(yǎng)基中添加5-20%體積的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液并繼續(xù)培養(yǎng)，其中所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液是包含IXB27添加剤，IXN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM 的 N こ酰半胱氨酸(NAC)，50_150ng/ml 的 bFGF，50_150ng/ml 的 EGF以及l(fā)-15ng/ml的白血病抑制因子(LIF)的DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基；(c)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中形成的神經(jīng)球直徑，當(dāng)60%以上、優(yōu)選70%以上神經(jīng)球直徑高于閾值吋，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球，消化后收獲，其中所述閾值為200-500 u m,例如為 250 u m、300 u m、350 u m、400 u m 或 450 u m ；(d)未挑中的直徑小于所述閾值的剰余細(xì)胞保留在原培養(yǎng)基中，將培養(yǎng)基移除1/2-1/4體積，然后添加與移除體積相同體積的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培養(yǎng)基繼
續(xù)培養(yǎng)；(e)在(a)接種神經(jīng)干細(xì)胞10、11、12、13、14或15天后通過(guò)合并(C)中收獲的細(xì)胞和(d)繼續(xù)培養(yǎng)所得的細(xì)胞而收獲細(xì)胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過(guò)本發(fā)明方法可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞的高效擴(kuò)増，10-15天的擴(kuò)增效率達(dá)到7-14倍。本發(fā)明所述擴(kuò)增效率是指擴(kuò)增后細(xì)胞數(shù)與擴(kuò)增前細(xì)胞數(shù)的比值。本發(fā)明所述神經(jīng)干細(xì)胞可以是不同動(dòng)物例如哺乳動(dòng)物例如靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物例如人、嚙齒類(lèi)動(dòng)物例如鼠等的神經(jīng)干細(xì)胞，而且所述神經(jīng)干細(xì)胞可以得自不同來(lái)源，例如可以是商購(gòu)獲得的神經(jīng)球凍存液或神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞系，或者自行從動(dòng)物神經(jīng)組織或其他組織(如臍帶血、臍帶)中分離提取，或者是由其他細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化而來(lái)，比如體細(xì)胞(通過(guò)iPSC技術(shù)誘導(dǎo))，間充質(zhì)干細(xì)胞，胚胎干細(xì)胞(包括極小類(lèi)胚胎干細(xì)胞)，亞全能干細(xì)胞，人類(lèi)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞等。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)方向誘導(dǎo)獲得的神經(jīng)干細(xì)胞。本發(fā)明(a)中所述的培養(yǎng)可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，例如參見(jiàn)(《干細(xì)胞原理、技術(shù)與臨床》第21章第2節(jié)，趙春華主編，化學(xué)エ業(yè)出版社，2006年5月第一版)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是包含bFGF和EGF的DMEM/F12培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基還可以包含其他本領(lǐng)域已知用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的物質(zhì)，例如丙酮酸鈉、谷氨酰胺、NAC和LIF。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，(a)中使用的培養(yǎng)基為包含IXB27添加剤，IXN2添加劑，I. 0-3. OmM 的 L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM 的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的bFGF, 5-30ng/ml的EGF以及l(fā)_15ng/ml的LIF的DMEM/F12培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，(a)的培養(yǎng)基中所述bFGF的濃度為5-30ng/ml，例如20ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，(a)的培養(yǎng)基中所述EGF的濃度為5-30ng/ml，例如20ng/ml。本發(fā)明中所用DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基是本領(lǐng)域熟知的培養(yǎng)基，可以購(gòu)自任何商業(yè)來(lái)源。例如，所述培養(yǎng)基可以購(gòu)自Invitoogen，其配方可以例如參見(jiàn)Invitrogen 公司網(wǎng)站。例如，DMEM 配方可參見(jiàn) http://www. invitrogen. com/ site/us/en/home/support/Product-TechnicaI-Resourc es/media_formuiation. 11,html ；DMEM/F12 配方可參見(jiàn) http://www. invitrogen. com/site/us/en/home/support/Product-Technical-Resources/media_formulation. 59. html。本發(fā)明所述的B27添加劑購(gòu)自Invitrogen公司(貨號(hào)17504-044)，其包含生物素，腎上腺皮質(zhì)酮，孕酮，こ酸維生素A，人重組胰島素，三碘甲腺原氨酸，維生素E，こ酸維生素E，還原谷胱甘肽，過(guò)氧化物歧化酶，鹽酸肉堿，鹽酸こ醇胺，D-半乳糖，鹽酸腐胺，亞油 酸，亞麻酸，牛血清白蛋白(無(wú)脂肪酸)，轉(zhuǎn)鐵蛋白，亞硒酸鈉。本發(fā)明所述的N2添加劑包含5mg/L胰島素,20nM孕酮，IOOuM腐胺，30nM亞硒酸鈉和100mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白。N2添加劑是培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的常用公知添加劑，例如可購(gòu)自 Invitrogen 公 ロ],其酉己萬(wàn) ロ」.以參見(jiàn) http://www. invitrogen. com/site/us/en/home/support/Product-Technica丄-Resources/media_fo rmulation. 166. html。本發(fā)明所述Nこ酰半胱氨酸(NAC，分子式=C5H9NO3S,分子量163. 20)是ー種氧自由基清除劑，具有抗氧化作用，可以保護(hù)細(xì)胞不受氧化損傷，阻止氧化張力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腦損傷條件下神經(jīng)細(xì)胞的存活。本發(fā)明所述堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是本領(lǐng)域已知的一種細(xì)胞因子，其對(duì)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種細(xì)胞具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性。本發(fā)明所述表皮生長(zhǎng)因子(EGF)是本領(lǐng)域已知的一種細(xì)胞因子，其可刺激上皮細(xì)胞和多種細(xì)胞増殖。本發(fā)明所述白血病抑制因子(LIF)是本領(lǐng)域已知的一種細(xì)胞因子，其屬于IL-6家族細(xì)胞因子家族，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和表型等。本文所述培養(yǎng)是在本領(lǐng)域已知的任何合適的培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的條件下進(jìn)行，例如300C -37°C>5% CO2以及100%的濕度。在ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所述神經(jīng)干細(xì)胞在37°C、5% CO2以及環(huán)境濕度下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在將神經(jīng)干細(xì)胞接種在(a)中所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、3或4天后，向該神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)物中加入 5-20%例如 5%、10%、11 %、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%體積的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液是DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基，其包含1XB27添加劑，1XN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM的NAC,50-150ng/ml 的 bFGF，50_150ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF。在一個(gè)實(shí)施方案中，添加10%體積的所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液是DMEM/F12培養(yǎng)基，其包含I XB27添加劑，1XN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM的NAC,50-150ng/ml 的 bFGF, 50-150ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中bFGF的濃度為80-120ng/ml，例如IOOng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中EGF的濃度為80-120ng/ml，例如100ng/ml。本發(fā)明所述監(jiān)測(cè)神經(jīng)球直徑可以在(a)至(e)的整個(gè)培養(yǎng)擴(kuò)增期間中的任何階段進(jìn)行。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在添加所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液后監(jiān)測(cè)培養(yǎng)液中形成的神經(jīng)球直徑，當(dāng)60%以上神經(jīng)球直徑高于閾值時(shí)，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球并消化、收獲，其中所述閾值為 200-500 iim，例如為 250iim、300iim、350iim、400iim_450iim。在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)70%、75%、80%、85%、90%或95%以上神經(jīng)球直徑達(dá)到閾值時(shí)，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述閾值為250 iim。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述閾值為300 Um0在一個(gè)實(shí)施方案中，所述閾值為350 iim。而未挑中的小于所述閾值的剩余細(xì)胞則留在培養(yǎng)基中。 本發(fā)明中測(cè)量神經(jīng)球直徑的方法可以使用本領(lǐng)域所已知的任何合適方法進(jìn)行，例如使用解剖鏡、顯微鏡測(cè)量方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述神經(jīng)球直徑使用解剖鏡測(cè)量。
可以使用本領(lǐng)域已知的合適方法分離具有所需直徑例如大于200iim、250iim、300 u m、350 u m、400 u m、450 u m或者500 u m的神經(jīng)球，例如使用吸管、移液管、微量移液器將神經(jīng)球吸取出以進(jìn)行分離。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用微量移液器分離直徑大于250 u m、300 u m或者350 u m的神經(jīng)球。本文中，消化神經(jīng)干細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的任何合適方法，例如酶消化法，例如使用胰蛋白酶、Dnase I進(jìn)行消化。本文中，所述“收獲”細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域已知的任何收獲神經(jīng)細(xì)胞的合適方法進(jìn)行。例如，收獲細(xì)胞可以使用離心的方法，例如在IOOOrpm離心10分鐘,然后去除上清,獲得細(xì)胞沉淀，再根據(jù)需要將細(xì)胞沉淀溶解于培養(yǎng)液、生理鹽水、凍存液或其他溶液中而獲得培養(yǎng)擴(kuò)增的細(xì)胞，以用于繼續(xù)培養(yǎng)擴(kuò)增、鑒定測(cè)試、誘導(dǎo)分化、注射動(dòng)物、凍存保藏或者其他目的。在一個(gè)實(shí)施方案中，在添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液繼續(xù)培養(yǎng)2、3或4天后分離大于閾值的神經(jīng)球。在一個(gè)實(shí)施方案中，在添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液繼續(xù)培養(yǎng)3天后分離大于閾值的神經(jīng)球。在一個(gè)實(shí)施方案中，在添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液繼續(xù)培養(yǎng)2天后分離大于閾值的神經(jīng)球。所述未挑中的小于所述閾值的并被留在培養(yǎng)基中的剰余細(xì)胞在將培養(yǎng)液移除1/2-1/4體積、例如1/3體積或者30%的體積并添加與移除體積相同體積的(a)中所述包含bFGF和EGF的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。本文中所述“將培養(yǎng)液移除”可以采用本領(lǐng)域已知的任何方法進(jìn)行，例如可以利用神經(jīng)干細(xì)胞密度比培養(yǎng)液大、一般沉在培養(yǎng)瓶底部的原理將培養(yǎng)瓶豎起后小心吸去部分上清液。在(a)接種10、11、12、13、14或15天后通過(guò)合并(C)中所述通過(guò)消化神經(jīng)球獲得的細(xì)胞和(d)中所述繼續(xù)培養(yǎng)小于所述閾值的剰余細(xì)胞所得的細(xì)胞而收獲細(xì)胞。在ー個(gè)實(shí)施方案中，在(a)接種后10-13天收獲細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在(a)接種后11天收獲細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在(a)接種后12天收獲細(xì)胞。本發(fā)明方法擴(kuò)增的細(xì)胞可以使用本領(lǐng)域任何方法計(jì)數(shù)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)用臺(tái)盼藍(lán)染色，活細(xì)胞染色后用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀掃描是透亮的圈，死細(xì)胞染成藍(lán)色不透亮，從而用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)活細(xì)胞。在本發(fā)明中，除非另外說(shuō)明，計(jì)數(shù)的細(xì)胞數(shù)均是活細(xì)胞數(shù)。根據(jù)本發(fā)明方法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞可以通過(guò)本領(lǐng)域已知方法檢測(cè)其細(xì)胞性質(zhì)，例如用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀對(duì)細(xì)胞濃度數(shù)量進(jìn)行測(cè)定，用ICC(免疫細(xì)胞化學(xué))、IHC(免疫組化)、RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、染色體核型檢測(cè)等方法檢測(cè)細(xì)胞的種類(lèi)、類(lèi)型，用PCR法(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))或DNA熒光染色法檢測(cè)支原體污染情況，用鱟試驗(yàn)檢測(cè)內(nèi)毒素，用直接接種法檢測(cè)無(wú)菌性。對(duì)于培養(yǎng)擴(kuò)增后收獲的神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任何方法進(jìn)行，例如通過(guò)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原nestin (巢蛋白)的表達(dá)進(jìn)行特異性鑒定，通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)分化然后檢測(cè)P -TubulinW -微管蛋白，神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志)、 GFAP (膠質(zhì)纖維酸性蛋白，星形膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志)、04抗原(一種細(xì)胞表面抗原，少突膠質(zhì)細(xì)胞早期特異性識(shí)別標(biāo)志)的表達(dá)情況鑒定細(xì)胞的多向分化潛能。在本發(fā)明的ー個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)了用本發(fā)明所述擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞的巢蛋白表達(dá)情況和誘導(dǎo)分化后￠-微管蛋白、GFAP, 04抗原表達(dá)情況，檢測(cè)結(jié)果表明本發(fā)明方法收獲的細(xì)胞表達(dá)巢蛋白抗原，經(jīng)誘導(dǎo)后可分化成神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞等神經(jīng)細(xì)胞，符合神經(jīng)干細(xì)胞特征。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的組合物，其是包含I X B27添加剤，I X N2添加劑，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，
0.5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的 bFGF，5_30ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF 的 DMEM/F12或DMEM培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的組合物中bFGF的濃度為5-30ng/ml，例如20ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的組合物中EGF的濃度為 5_30ng/ml,例如 20ng/ml。在另ー個(gè)方面，本發(fā)明還提供了一種營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物，其是包含1XB27添加劑，1XN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM的NAC,50-150ng/ml 的 bFGF，50-150ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF 的 DMEM/F12 或 DMEM 培養(yǎng)基。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物中bFGF的濃度為80-120ng/ml，例如IOOng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物中EGF的濃度為80-120ng/ml，例如100ng/ml。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的組合物或者營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物中L-谷氨酰胺的濃度為1.6-2. 4mM，例如2mM。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述兩種組合物中丙酮酸鈉的濃度為0. 8-1. 2mM，例如ImM。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述兩種組合物中NAC的濃度為
0.8-1. 2mM，例如ImM。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述兩種組合物中LIF的濃度為8_12ng/ml，例如 10ng/ml。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述用于培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的組合物是包含B27添加劑(1X)、N2 添カロ劑(IX)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC(ImM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及 LIF(lOng/ml)的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物是包含B27添加劑(IX)、N2 添加劑(I X )、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC(ImM)、bFGF (100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及 LIF(10ng/ml)的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。在本發(fā)明的ー個(gè)具體實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充組合物是包含B27添加劑(IX)、N2 添加劑(I X )、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC(ImM)、bFGF (100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及 LIF(5ng/ml)的 DMEM/F12 培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的組合物可以是液體、固體粉末等任何本領(lǐng)域通常使用的形式。當(dāng)本發(fā)明所述組合物是液體形式時(shí)，其可以配制為原液，在使用時(shí)稀釋為所需的濃度。當(dāng)本發(fā)明的組合物是固體粉末形式時(shí)，其可以通過(guò)添加溶劑例如水而形成所需濃度的液體形式。除非特別指出，本文使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的含義。另外除非特別需要，則單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)，復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括単數(shù)。前述技術(shù)和方法通常根據(jù)本領(lǐng)域熟知的及在本說(shuō)明書(shū)引用的參考文獻(xiàn)所述的常規(guī)方法進(jìn)行。除非特別指出，本文列出的濃度是在周?chē)h(huán)境條件(即25°C和大氣壓)下的濃度。


圖I:該圖為采用本發(fā)明方法對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增后所收獲的細(xì)胞巢蛋白(神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物)表達(dá)情況的免疫檢測(cè)結(jié)果，Ia中的熒光表示抗巢蛋白抗體結(jié)合的位置， Ib中的突光表不細(xì)胞核的位置。圖2 :該圖為采用本發(fā)明方法所收獲的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后04抗原(少突膠質(zhì)細(xì)胞早期分化標(biāo)志物)的免疫檢測(cè)結(jié)果，2a中的熒光表示抗04抗體結(jié)合的位置，2b中的熒光表示細(xì)胞核的位置。圖3 :該圖為采用本發(fā)明方法所收獲的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后GFAP(星型膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物)的免疫檢測(cè)結(jié)果，3a中的熒光表示抗GFAP抗體結(jié)合的位置，3b中的熒光表示細(xì)胞核的位置。圖4:該圖為采用本發(fā)明方法所收獲的細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后￠-微管蛋白(神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物)的免疫檢測(cè)結(jié)果，4a中的熒光表示抗￠-微管蛋白抗體結(jié)合的位置，4b中的突光表不細(xì)胞核的位置。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明通過(guò)下述實(shí)施例進(jìn)ー步闡明，但任何實(shí)施例或其組合不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的范圍或?qū)嵤┓绞降南拗?。本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書(shū)限定，結(jié)合本說(shuō)明書(shū)和本領(lǐng)域一般常識(shí)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以清楚地明白權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行任何修改或改變，這種修改和改變也包含在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例本發(fā)明使用的試劑除NAC購(gòu)自SIGMA外,其余試劑均購(gòu)自Invitrogen。實(shí)施例II培養(yǎng)液組成培養(yǎng)液A組成為DMEM/F12溶液，含有B27添加劑(I X)、N2添加劑(I X)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC(ImM)、bFGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)以及 LIF(10ng/ml) o營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液組成為DMEM/F12溶液，含有B27添加劑(1X)、N2添加劑(IX)、L_谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC (ImM)、bFGF (100ng/ml)、EGF (100ng/ml)以及 LIF(10ng/ml) o上述試劑NAC購(gòu)自SIGMA公司，其余試劑均購(gòu)自Invitrogen公司。
II培養(yǎng)步驟復(fù)蘇人胎兒神經(jīng)干細(xì)胞凍存產(chǎn)品(Cyagen公司，貨號(hào)HUXNF-0 1 001) 1.0X 106個(gè)細(xì)胞(凍存管包裝，干冰運(yùn)輸)獲得8. 2 X IO5個(gè)細(xì)胞。以I. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種到2個(gè)含有4ml培養(yǎng)液A的T25cm2培養(yǎng)方瓶中，37°C、5% CO2條件下體外培養(yǎng)48小時(shí)。添加0. 5ml營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)后70%神經(jīng)球直徑大于300 u m,分離直徑大于300 u m神經(jīng)干細(xì)胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、計(jì)數(shù)，該細(xì)胞可以?xún)龃婊蛞?. 0X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于新鮮培養(yǎng)液A另行培養(yǎng)。未挑中的直徑小于300 的細(xì)胞留在原培養(yǎng)液中，移除30%體積(1.5ml)原培養(yǎng)液，加入同樣體積新鮮培養(yǎng)液A后繼續(xù)培養(yǎng)。6天后收獲培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞并計(jì)數(shù)，兩次計(jì)數(shù)共計(jì)獲得同一代次的神經(jīng)干細(xì)胞
7.IX IO6個(gè)。11天實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞擴(kuò)增8. 66倍。
將上述收獲的細(xì)胞以2. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于含有36ml培養(yǎng)液A的T175cm2培養(yǎng)方瓶中在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)。添加3. 6ml營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，繼續(xù)在37°C>5% CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)后70%神經(jīng)球直徑大于300 u m,分離直徑大于300 y m神經(jīng)干細(xì)胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、計(jì)數(shù)，該細(xì)胞可以?xún)龃婊蛞?. 0X IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于新鮮培養(yǎng)液A另行培養(yǎng)。未挑中的直徑小于300 u m的細(xì)胞留在原培養(yǎng)液中，移除1/3體積(12ml)原培養(yǎng)液，加入同樣體積新鮮培養(yǎng)液A后繼續(xù)培養(yǎng)。7天后收獲培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞并計(jì)數(shù)，兩次計(jì)數(shù)共計(jì)獲得同一代次的神經(jīng)干細(xì)胞7. 9X IO7個(gè)。12天實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增10. 97倍。實(shí)施例2I培養(yǎng)液組成培養(yǎng)液A組成為DMEM/F12溶液，含有B27添加劑(1X)、N2添加劑(1X)、L_谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC (ImM)、bFGF (20ng/ml)、EGF (20ng/ml)以及 LIF (5ng/ml)。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液組成為DMEM/F12溶液，含有B27添加劑(1X)、N2添加劑(IX)、L_谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC (ImM)、bFGF (100ng/ml)、EGF (100ng/ml)以及 LIF(5ng/ml) o上述試劑NAC購(gòu)自SIGMA公司，其余試劑均購(gòu)自Invitrogen公司。II培養(yǎng)步驟從人臍帶血(上海血液中心臍帶血庫(kù))中用密度梯度離心法分離單核細(xì)胞層，然后貼壁培養(yǎng)獲得間充質(zhì)干細(xì)胞，誘導(dǎo)分化成為神經(jīng)干細(xì)胞(通過(guò)在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子EGF和bFGF各20ng/ml誘導(dǎo))，經(jīng)計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量5. OX IO5個(gè)細(xì)胞。以I. OX 105/ml個(gè)細(xì)胞接種在含有5mL培養(yǎng)液A的T25cm2培養(yǎng)方瓶中，37°C、5% CO2條件下體外培養(yǎng)48小時(shí)。添加0. 5ml營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，繼續(xù)在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)72小時(shí)后觀(guān)測(cè)到70%神經(jīng)球直徑大于250 iim，分離直徑大于250 iim神經(jīng)干細(xì)胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化、計(jì)數(shù)，該細(xì)胞可以?xún)龃婊蛞?.0X105個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于新鮮培養(yǎng)液A中另行培養(yǎng)。未挑中的直徑小于250 ii m的細(xì)胞留在原培養(yǎng)液中,移除30%體積(1.5ml)原培養(yǎng)液,加入同樣體積新鮮培養(yǎng)液A后繼續(xù)培養(yǎng)。6天后收獲培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞并計(jì)數(shù)，兩次計(jì)數(shù)共計(jì)獲得同一代次的神經(jīng)干細(xì)胞4. 14X IO6個(gè)。11天實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增8. 28倍。實(shí)施例3I培養(yǎng)液組成
培養(yǎng)液A組成為DMEM溶液，含有B27添加劑(I X)、N2添加劑(I X)、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC (ImM)、bFGF (20ng/ml)、EGF (20ng/ml)以及 LIF (10ng/ml)。營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液組成為DMEM溶液，含有B27添加劑(I X)、N2添加劑(I X )、L-谷氨酰胺(2mM)、丙酮酸鈉(ImM)、NAC(ImM)、bFGF(100ng/ml)、EGF(100ng/ml)以及 LIF(10ng/ml) o上述試劑NAC購(gòu)自SIGMA公司，其余試劑均購(gòu)自Invitrogen公司。II培養(yǎng)步驟從ICR鼠腦組織皮層獲得密度為3. 4X107個(gè)細(xì)胞的P3代神經(jīng)球懸液(參考文獻(xiàn)尹國(guó)才，架佐，屈素清等，新生鼠大腦皮層神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及其在同胞鼠的細(xì)胞替代作用，中華圍產(chǎn)醫(yī)學(xué)雜志，2005年7月第8卷第4期，255-258)，接種于含有170ml培養(yǎng)液A的CELLSTACK-636培養(yǎng)方瓶中(接種密度2. 0 X IO5個(gè)/ml)。在37°C、5% CO2條件下體外培養(yǎng) 48小時(shí)。添加17ml營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，繼續(xù)在37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)后觀(guān)測(cè)到70%神經(jīng)球直徑大于350 u m,挑選分離直徑大于350 u m神經(jīng)球,用胰蛋白酶和Dnase I消化,該細(xì)胞可以?xún)龃婊蛞?. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于培養(yǎng)液A中繼續(xù)培養(yǎng)。未挑中的直徑小于350 u m的剩余細(xì)胞留在原培養(yǎng)液中，移除1/3體積(57ml)原培養(yǎng)液，補(bǔ)充同樣體積新鮮培養(yǎng)液A后繼續(xù)培養(yǎng)。7天后收獲培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞并計(jì)數(shù)，兩次計(jì)數(shù)共計(jì)獲得同一代次的神經(jīng)干細(xì)胞4. 4X IO8個(gè)。11天實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增12. 94倍。將上面收獲的細(xì)胞以2. OX IO5個(gè)/ml分別接種于13個(gè)含有170ml培養(yǎng)液A的CELLSTACK-636中，37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)48小時(shí)。每瓶添加17ml營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液，37°C,5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后觀(guān)測(cè)到70%神經(jīng)球直徑大于350 u m,分離直徑大于350 u m神經(jīng)干細(xì)胞球，用胰蛋白酶和Dnase I消化，該細(xì)胞可以?xún)龃婊蛞?. OX IO5個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于新鮮培養(yǎng)液A中繼續(xù)培養(yǎng)。未挑中的直徑小于350 u m的剩余細(xì)胞留在原培養(yǎng)液中，移除1/3體積(57ml)原培養(yǎng)液，補(bǔ)充同樣體積新鮮培養(yǎng)液A后繼續(xù)培養(yǎng)。8天后收獲原培養(yǎng)液中的神經(jīng)干細(xì)胞并計(jì)數(shù)，兩次計(jì)數(shù)共計(jì)獲得同一代次的神經(jīng)干細(xì)胞6. 2X109個(gè)。12天實(shí)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量擴(kuò)增14. 09倍。實(shí)施例4 :用實(shí)施例1-3方法獲得的擴(kuò)增的神經(jīng)干細(xì)胞的鑒定A.神經(jīng)干細(xì)胞特異性抗原巢蛋白的檢測(cè)(I)用吸管取少量細(xì)胞懸液滴于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的多孔板上，置37°C培養(yǎng)箱2h，使細(xì)胞粘附于載玻片上(2)用4%多聚甲醛+0. 3%戊ニ醛固定15min，計(jì)2次(3)用PBS漂洗3次后，用含5%正常山羊血清的PBS (含0. I % Triton X-100)在37°C溫育30min進(jìn)行封閉(4)吸去封閉液,加抗巢蛋白單克隆抗體(購(gòu)自BD Pharmingen), 37 °C溫育3h后，用含 0. 1% Triton X-100 的 PBS 漂洗 3 次，各 IOmin(5)加突光標(biāo)記第二抗體(購(gòu)自 Jackson)和 DAPI 染色液(2_ (4_Amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride, 一種細(xì)胞核染色劑)，37°C溫育 45min(6)用PBS漂洗3次，用封片液封片，熒光顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖I所示，其中Ia中的熒光表示抗巢蛋白抗體的結(jié)合位置，Ib中的熒光表示細(xì)胞核的位置，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物巢蛋白。
B.多向分化潛能的鑒定I、誘導(dǎo)分化取培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞接種于用多聚賴(lài)氨酸(PLL)包被的多孔板中，培養(yǎng)液為DMEM/F12+1 XB27+20ng/ml bFGF,培養(yǎng) 5-7 天。2、與抗04抗體反應(yīng)(I)移去培養(yǎng)液，每孔加鼠抗04IgM抗體(購(gòu)自Millipore)，室溫反應(yīng)30min(2)移去抗04抗體，每孔加PHEM 固定液(60mM PIPES, 25mM HEPES, IOmM EGTA, 2mMMgS04, pH 7. 0)，反應(yīng)lOmin，移去PHEM固定液，用PBS洗滌3次(3)每孔加入熒光標(biāo)記的第二抗體(DyLight 549標(biāo)記的猴抗鼠IgM (購(gòu)自 Jackson)),室溫反應(yīng)45min,移去第二抗體,用PBS洗漆5次(4)每孔加入封閉血清，室溫封閉lh，用PBS洗滌3次(5)每孔加入DAPI染色液，室溫反應(yīng)lh，，用PBS洗滌5次(6)用熒光倒置顯微鏡在不同波長(zhǎng)下拍照，檢測(cè)抗04抗體結(jié)合情況和DAPI結(jié)合情況。3、與抗GFAP抗體反應(yīng)(I)移去培養(yǎng)液，每孔加 PHEM 固定液(60mM PIPES, 25mM HEPES, IOmM EGTA, 2mMMgS04, pH 7. 0)，反應(yīng)lOmin，移去PHEM固定液，用PBS洗滌3次(2)每孔加入封閉血清，室溫封閉Ih(3)移去封閉血清，每孔加入400ul兔抗GFAP IgG抗體(購(gòu)自Dako)，室溫反應(yīng)45min，用PBS洗滌三次(4)姆孔加入突光標(biāo)記的第二抗體(羊抗兔IgG(購(gòu)自Invitrogen))和DAPI染色液，室溫反應(yīng)Ih，用PBS洗滌五次(5)用熒光倒置顯微鏡在不同波長(zhǎng)下拍照，檢測(cè)抗GFAP抗體結(jié)合情況和DAPI結(jié)合情況。4、與抗P -微管蛋白抗體反應(yīng)(I)移去培養(yǎng)液，每孔加 PHEM 固定液(60mM PIPES, 25mM HEPES, IOmM EGTA, 2mMMgS04, pH 7. 0)，反應(yīng)lOmin，移去PHEM固定液，用PBS洗滌3次(2)每孔加入封閉血清，室溫封閉Ih(3)移去封閉血清，每孔加入鼠抗￠-微管蛋白IgG2b抗體(購(gòu)自Sigma)，4°C反應(yīng)12-16h，用PBS洗滌三次(4)姆孔加入突光標(biāo)記的第二抗體(羊抗鼠IgG2b (購(gòu)自Invitrogen))和DAPI染色液，室溫反應(yīng)Ih,用PBS洗漆五次(5)用熒光倒置顯微鏡在不同波長(zhǎng)下拍照，檢測(cè)抗￠-微管蛋白抗體結(jié)合情況和DAPI結(jié)合情況。5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2至圖4所示，2a、3a、4a中的熒光部分分別表示抗04抗體、抗GFAP抗體、抗運(yùn)-微管蛋白抗體結(jié)合位置，213、313、仙中的熒光部分表示細(xì)胞核位置，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明誘導(dǎo)后的細(xì)胞表達(dá)少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元標(biāo)志物04抗原、GFAP和P -微管蛋白，分別說(shuō)明細(xì)胞被誘導(dǎo)后向少突膠質(zhì)細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞方向發(fā)生了分化。
權(quán)利要求
1.一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，所述方法包括 (a)將神經(jīng)干細(xì)胞接種在包含堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)2、3或4天； (b)添加5-20%體積的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液并繼續(xù)培養(yǎng)，其中所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液是包含IXB27添加劑，1XN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM的Nこ酰半胱氨酸(NAC), 50_150ng/ml 的 bFGF, 50_150ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的白血病抑制因子(LIF)的DMEM或DMEM/F12培養(yǎng)基； (c)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)基中形成的神經(jīng)球直徑，當(dāng)60%以上、優(yōu)選70%以上神經(jīng)球直徑高于閾值時(shí)，分離直徑高于所述閾值的神經(jīng)球，消化后收獲，其中所述閾值為200-500 u m,例如為.250 u m、300 u m、350 u m、400 u m 或 450 u m ； (d)留在原培養(yǎng)基中的直徑小于所述閾值的剰余細(xì)胞在將培養(yǎng)基移除1/2-1/4體積并添加與移除體積相同體積的(a)中所述的包含bFGF和EGF的培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)； (e)在(a)接種神經(jīng)干細(xì)胞后第10、11、12、13、14或15天通過(guò)合并(C)收獲的細(xì)胞和(d)繼續(xù)培養(yǎng)所得的細(xì)胞而收獲細(xì)胞。
2.權(quán)利要求I的方法，其中(a)的培養(yǎng)基為包含1XB27添加剤，1XN2添加剤，I.0-3. OmM 的 L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM 的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的 bFGF，.5-30ng/ml 的 EGF 以及 l_15ng/ml 的 LIF 的 DMEM 或 DMEM/F12 培養(yǎng)基。
3.權(quán)利要求2的方法，其中(a)的培養(yǎng)基中bFGF的濃度為16_24ng/ml，例如20ng/ml。
4.權(quán)利要求2的方法，其中(a)的培養(yǎng)基中EGF的濃度為16_24ng/ml，例如20ng/ml。
5.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法,其中所述(a)的培養(yǎng)基中或者所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中L-谷氨酰胺的濃度獨(dú)立地為I. 6-2. 4mM，例如2mM。
6.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法,其中所述(a)的培養(yǎng)基中或者所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中丙酮酸鈉的濃度獨(dú)立地為0. 8-1. 2mM，例如ImM。
7.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法,其中所述(a)的培養(yǎng)基中或者所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中NAC的濃度獨(dú)立地為0. 8-1. 2mM，例如ImM。
8.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法,其中所述(a)的培養(yǎng)基中或者所述營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中LIF的濃度獨(dú)立地為8_12ng/ml,例如10ng/ml。
9.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法，其中(b)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中bFGF的濃度為80-120ng/ml，例如 100ng/ml。
10.權(quán)利要求1-4任ー項(xiàng)的方法，其中(b)的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液中EGF的濃度為80-120ng/ml，例如 100ng/ml。
11.權(quán)利要求I或2的方法，其中在(a)中神經(jīng)干細(xì)胞在包含bFGF和EGF的培養(yǎng)基中培養(yǎng)2或3天。
12.權(quán)利要求I或2的方法，其中在(b)中添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液后繼續(xù)培養(yǎng)2或3天后分離神經(jīng)球。
13.—種組合物，其是包含I XB27添加剤，I XN2添加剤，1. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺，0. 5-1. 5mM 的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM 的 NAC，5_30ng/ml 的 bFGF, 5-30ng/ml 的 EGF 以及l(fā)-15ng/ml 的 LIF 的 DMEM/F12 或 DMEM 培養(yǎng)基。
14.權(quán)利要求13的組合物，其中bFGF的濃度為16-24ng/ml，例如20ng/ml。
15.權(quán)利要求13的組合物，其中EGF的濃度為16-24ng/ml，例如20ng/ml。
16.一種組合物，其是包含1XB27添加剤，IXN2添加剤，I. 0-3. OmM的L-谷氨酰胺， 0.5-1. 5mM 的丙酮酸鈉，0. 5-1. 5mM 的 NAC，50_150ng/ml 的 bFGF, 50-150ng/ml 的 EGF 以及l(fā)-15ng/ml 的 LIF 的 DMEM/F12 或 DMEM 培養(yǎng)基。
17.權(quán)利要求16的組合物，其中bFGF的濃度為80-120ng/ml，例如100ng/ml。
18.權(quán)利要求16的組合物，其中EGF的濃度為80-120ng/ml，例如100ng/ml。
19.權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中L-谷氨酰胺的濃度為I.6-2. 4mM，例如2mM。
20.權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中丙酮酸鈉的濃度為0.8-1. 2mM，例如ImM。
21.權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中NAC的濃度為0.8-1. 2mM，例如ImM。
22.權(quán)利要求13-18任一項(xiàng)的組合物，其中LIF的濃度為8-12ng/ml，例如10ng/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增方法，包括將不同來(lái)源的神經(jīng)干細(xì)胞用本發(fā)明所述培養(yǎng)液培養(yǎng)、添加營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液、更換新鮮培養(yǎng)液、挑選一定大小的神經(jīng)球傳代等步驟，還提供了相關(guān)的培養(yǎng)液、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充液等組合物的配方。本發(fā)明所述方法顯著提高了靜態(tài)培養(yǎng)下神經(jīng)干細(xì)胞的增殖效率，并且不使用抗生素，成本較低，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/0797GK102839154SQ20111017382
公開(kāi)日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月23日
發(fā)明者金宜強(qiáng), 劉軍, 楊立敏 申請(qǐng)人:上海安集協(xié)康生物技術(shù)有限公司