專利名稱：鴨瘟病毒 gG截段重組蛋白及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及鴨瘟病毒抗體的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
鴨瘟(Duck Plague, DP)是由皰疹病毒科中的鴨瘟病毒(Duck plague virus, DPV) 引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性、熱性、接觸性傳染的敗血性傳染病。該病可導(dǎo)致商品水禽產(chǎn)蛋量下降及死亡，對野生水禽也有不同的致死率。DP的臨床表現(xiàn)為精神沉郁，高熱稽留，兩腿麻痹、下痢、流淚，部分病鴨頭頸腫大，是一種廣泛嗜全身性感染的傳染病，臨床以急性敗血癥過程為特征；病理剖解特征是血管損傷，組織器官出血，消化道出血、炎癥和壞死，消化道粘膜某些特定部位有疹狀損害，淋巴器官受損以及實質(zhì)器官的退行性變化，其發(fā)病率和死亡率都甚高。近年來，隨著養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)向集約化、規(guī)?；姆较虬l(fā)展，鴨瘟作為威脅養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的接觸性傳染病之一，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。過去對鴨瘟病毒血清抗體的檢測方法主要是利用全病毒作為抗原進(jìn)行檢測，但傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法大約需要4 5天，方法繁瑣，費時費力，且純化后的病毒中會摻雜有許多宿主細(xì)胞成分，導(dǎo)致假陽性結(jié)果出現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供一種鴨瘟病毒gG截段重組蛋白，該蛋白能作為鴨瘟病毒抗體的捕獲劑。為實現(xiàn)上述方案，本發(fā)明的技術(shù)方案為
鴨瘟病毒gG截段重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的DNA序列如SEQ ID NO: 2所示。本發(fā)明的目的之二在于提供鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備方法，該方法可用于鴨瘟病毒gG截段重組蛋白大規(guī)模生產(chǎn)。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為
所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備方法，具體包括以下步驟
A、以DPV基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR擴(kuò)增得鴨瘟病毒gG截段基因片段，與pMDIS-T的連接，得pMD18_gGM;
B、限制性內(nèi)切酶BamHI和Bio I分別雙酶切pMD18_gGM質(zhì)粒和原核表達(dá)載體 pET32a(+),并連接，得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM;
C、并將上述提取的重組質(zhì)粒pET3h-gGM轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨瘟病毒gG 截段重組蛋白粗品。進(jìn)一步，將步驟C所得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白粗品經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后，得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白；
進(jìn)一步，步驟C中的宿主菌為菌株BL21 (DE3)，在IPTG濃度彡0. 2mmol/L,誘導(dǎo)溫度為 30 0C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)2小時，得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白。
本發(fā)明的有益效果在于鴨瘟病毒gG截段重組蛋白是選取鴨瘟病毒(DPV)gG基因編碼蛋白的主要抗原域(68aa-377aa)，并命名為gGM;然后利用基因工程技術(shù)，將其進(jìn)行克隆的基礎(chǔ)上，將其與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE!3)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)的基因工程產(chǎn)品。該蛋白的表達(dá)形式是gGM/His融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白分子量為50kDa，將產(chǎn)品設(shè)計為融合表達(dá)一是考慮便于純化，二是能增加表達(dá)蛋白的免疫原性。經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后的產(chǎn)品經(jīng)Western blot進(jìn)行鑒定后表面具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。采用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的產(chǎn)品可用于
①本產(chǎn)品可作為檢測鴨瘟病毒抗體的間接ELISA方法的檢測抗原。②可作為預(yù)防鴨瘟病毒感染的基因工程亞單位疫苗。本發(fā)明的產(chǎn)品優(yōu)點體現(xiàn)在
①由于該檢測抗原是鴨瘟病毒gG截段重組蛋白，并非全病毒，以此應(yīng)用該檢測抗原進(jìn)行檢測時無散毒危險。②作為ELISA抗原檢測鴨瘟病毒抗體，特異性強(qiáng)，無交叉反應(yīng)。③性能穩(wěn)定、生產(chǎn)成本低，適合工廠化生產(chǎn)，市場應(yīng)用前景廣。更多有益效果，將在實施例中體現(xiàn)。

圖1為gG截段基因的PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1為gG截段基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性DNA條帶，M為DNA Marker.圖2為重組質(zhì)粒pMD18-gGM的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M為DNA Marker, 1為重組質(zhì)粒pMD18-gGM用BamH I和Bio I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。圖3為pET3h_gGM的酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中，M為DNA Marker, 1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM用B10 I單酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的一條特異性條帶，2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM用BamH I和)(h0 I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM表達(dá)的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的SDS-PAGE 電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h_gGM用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果，2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM 用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果，3 為重組表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM未用IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，4為重組表達(dá)質(zhì)粒 pET3^i-gGM用IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，5為空載體pET_32a(+)未用IPTG 誘導(dǎo)，經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果，6為空載體pET-32a(+)用IPTG誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE電泳所得結(jié)果。圖5為不同IPTG濃度下含有重組質(zhì)粒pET3h-gGM的宿主菌E. coli BL21 (DE3) 表達(dá)鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為蛋白質(zhì)Marker，1為IPTG的終濃度為1. 2 mmol/L，2為IPTG的終濃度為1. 0 mmol/L，3為IPTG的終濃度為0. 8 mmol/ L，4為IPTG的終濃度為0. 5 mmol/L, 5為IPTG的終濃度為0. 2 mmol/L, 6為IPTG的終濃度為 0mmol/Lo圖6為不同溫度下含有重組質(zhì)粒pET3h_gGM的宿主菌E. coli BL21 (DE3)表達(dá)鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中，M為蛋白質(zhì)Marker，1為誘導(dǎo)溫度為 25°C，2為誘導(dǎo)溫度為30°C，3為誘導(dǎo)溫度為37°C。圖7為不同誘導(dǎo)時間下含有重組質(zhì)粒pET3h-gGM的宿主菌Ε. coli BL21 (DE3)表達(dá)鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中M為蛋白質(zhì)Marker，1為誘導(dǎo)12h， 2為誘導(dǎo)6h，3為誘導(dǎo)5h，4為誘導(dǎo)4h，5為誘導(dǎo)3h，6為誘導(dǎo)2h，7為誘導(dǎo)Oh。圖8為鎳瓊脂糖凝膠(Ni2+-NAT)親和層析純化后的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白 SDS-PAGE電泳圖，其中M為蛋白質(zhì)Marker，l為經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后的gG截段重組蛋白。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進(jìn)行詳細(xì)描述。優(yōu)選實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學(xué)出版社，2002年)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進(jìn)行。部分氨基酸相應(yīng)的縮寫如下
谷酰胺gin Q;甘氨酸gly G ；絲氨酸ser S ；丙氨酸ala A ；蘇氨酸t(yī)hr T ；纈氨酸 val V ；異亮氨酸ile I ；亮氨酸leu L ；酪氨酸t(yī)yr Y ；苯丙氨酸phe F ；組氨酸his H ；脯氨酸pro P ；天冬酰胺asn N ；甲硫氨酸met M ；谷氨酸glu E ；色氨酸t(yī)rp W ；賴氨酸Iys K;半胱氨酸cys C;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D。
實施例1鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備一材料準(zhǔn)備 1菌株、質(zhì)粒和毒株
質(zhì)粒pMD18-T，購自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h (+)，Novagen公司產(chǎn)品；克隆宿主菌E. coli DH5a、表達(dá)宿主菌E. coli BL21(DE3)和DPV CHv強(qiáng)毒株，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。羊抗鴨IgG-HRP (辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗鴨IgG)和四甲基聯(lián)苯胺(TMB)均購自美國KPL公司，羊抗鴨IgG-HRP的為凍干劑，分裝為0. Img/瓶，使用時按說明書溶解為lmL。2試驗動物
10日齡鴨胚，其種鴨DPV和抗體均為陰性。3實驗方法
3. 1 DPV gG基因的克隆 3. 1.1引物設(shè)計
根據(jù)gG基因編碼的氨基酸序列主要抗原域(68aa-377aa并命名為gGM)，利用 Primer Premier5. O軟件設(shè)計一對引物。如SEQ ID N0:3所示的上游引物5，-RRatcccacacaRRacRatatRaR _3’(劃線部分為 BamH I 位點)；如 SEQ ID N0:4所示的下游引物5，- CtCRaRatRaRRRtRattRtRRtaR _3，(劃線部分為Β ο I位點)。引物合成后， 以適量滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，_20°C保存?zhèn)溆谩?br> 3. 1. 2 DPV基因組DNA的提取
a、正常鴨胚成纖維細(xì)胞(DEF)的制作方法取IOd日齡健康鴨胚，分別用體積分?jǐn)?shù)為 5%碘酒和體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒蛋殼表面。無菌操作條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗凈，剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟，PBS沖洗后將胚體剪成Imm3大小的小塊，加PBS適量，之后置于三角瓶內(nèi)，加細(xì)胞分散劑(體積分?jǐn)?shù)為2. 5%胰蛋白酶)150 μ L/胚，于37°C水浴中消化;3min。立即將細(xì)胞懸液以4000r/min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用6層紗布過濾，向濾液中加入體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清和100IU/mL雙抗后，分裝于 IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，水平靜置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。b、DPV增殖取剛剛長成致密單層的DEF，棄生長營養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì)胞表面2次后，加入DPV病毒液2-3mL覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附Ih后棄病毒液，然后加含3%小牛血清和100IU/mL雙抗的MEM維持營養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)。同時做未接毒的DEF 對照。c、DNA提取方法直接從感染的DEF中提取DPV基因組DNA，具體步驟如下(1) 選取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變(CPE)達(dá)80%的DEF ；同時選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對照；(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 μ L的細(xì)胞裂解液，同時加蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度為200 μ g/mL,輕輕混勻后，37°C孵育10分鐘；(3)將細(xì)胞懸浮液倒入EP離心管中，并用 500 μ L的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶內(nèi)的裂解物，倒入離心管中；(4)用飽和酚氯仿及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；(5)加1/10倍體積3mol/L NaAC,混勻后，加入2倍體積冷無水乙醇，_20°C放置30-60分鐘；(6) 13000r/分鐘離心20分鐘，沉淀用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗滌兩次；(7)真空抽干后，溶于適量TE緩沖液中，加入IyL RNA酶，37°C 作用30分鐘，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> 權(quán)利要求
1.鴨瘟病毒gG截段重組蛋白，其特征在于其氨基酸序列如SEQID N0:1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白，其特征在于其DNA序列如SEQ ID NO:2 所示。
3.權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備方法，其特征在于A、以DPV基因組DNA為模板，采用核苷酸序列分別如SEQID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下游引物PCR擴(kuò)增得鴨瘟病毒gG截段基因片段，與pMDIS-T的連接，得pMD18_gGM;B、限制性內(nèi)切酶BamHI和Bio I分別雙酶切pMD18-gGM質(zhì)粒和原核表達(dá)載體 pET32a(+),并連接，得重組原核表達(dá)質(zhì)粒pET3h-gGM;C、并將上述提取的重組質(zhì)粒pET3h-gGM轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)，得鴨瘟病毒gG 截段重組蛋白粗品。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備方法，其特征在于將步驟 C所得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白粗品經(jīng)鎳瓊脂糖凝膠親和層析純化后，得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鴨瘟病毒gG截段重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟C 中的宿主菌為菌株BL21(DE3)，在IPTG濃度彡0. 2mmol/L,誘導(dǎo)溫度為30°C條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)2小時，得鴨瘟病毒gG截段重組蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，特別涉及鴨瘟病毒gG截段重組蛋白及其制備方法,其氨基酸序列如SEQIDNO1所示，核苷酸序列如SEQIDNO2所示;然后利用基因工程技術(shù)，將其核苷酸序列進(jìn)行克隆的基礎(chǔ)上，將其與原核表達(dá)載體pET-32a(+)連接，成功轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)、表達(dá)的基因工程產(chǎn)品;該蛋白的表達(dá)形式是gGM/His融合蛋白，表達(dá)的融合蛋白分子量為50kDa，將產(chǎn)品設(shè)計為融合表達(dá)一是考慮便于純化，二是能增加表達(dá)蛋白的免疫原性;經(jīng)原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)后的產(chǎn)品經(jīng)Westernblot進(jìn)行鑒定后表面具有與天然蛋白相似的免疫反應(yīng)活性。
文檔編號C12N15/70GK102250224SQ201110177128
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者楊曉圓, 汪銘書, 程安春, 陳孝躍 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗動物工程技術(shù)中心