專利名稱：一種游離rna提取方法及試劑盒的制作方法
一種游離RNA提取方法及試劑盒技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從生物樣本中提取游離RNA的方法和一種游離RNA提取試劑盒。
背景技術(shù)：
游離RNA是指存在于血清、血漿、肺泡灌洗液、尿液、胸腹水等體液中的細(xì)胞外游離RNA，循環(huán)RNA是特指血清或血漿中游離RNA。傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷需要依賴于有創(chuàng)性操作獲取胎兒組織(如羊膜腔穿刺和絨毛取樣等)，均對(duì)胎兒有潛在的風(fēng)險(xiǎn)。1997年，Lo等首次發(fā)現(xiàn)，妊娠婦女血漿和血清中存在胎兒 DNA。這位無創(chuàng)診斷提供了一種有效的途徑。但血漿中母體來源的DNA占總DNA的比例非常高，一定程度上提高了檢測胎兒DNA的難度。目前，游離DNA在臨床上主要用于對(duì)父源性 DNA檢測，如SRY基因型鑒定胎兒性別、檢測RhD血型及其它父源性遺傳性疾病檢測。產(chǎn)前診斷最常見的是21三體等非整倍體疾病檢測，它要求對(duì)染色體拷貝數(shù)量進(jìn)行精確定量，這對(duì)于游離DNA來說是個(gè)挑戰(zhàn)。2000年，Poo等發(fā)現(xiàn)妊娠婦女血漿存在游離的胎兒RNA。同游離DNA相比，游離RNA的優(yōu)勢在于前者主要依靠Y染色體相關(guān)基因檢測判斷，不適應(yīng)于女性胎兒的檢測，而游離RNA能擴(kuò)大其檢測范圍；同時(shí)，游離DNA在母體血漿中含量低，而游離RNA能夠排除母體背景干擾，檢測更適用于產(chǎn)前診斷。研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤患者腫瘤組織中腫瘤相關(guān)基因表達(dá)與體液中游離腫瘤相關(guān)性基因RNA表達(dá)密切相關(guān)，游離RNA作為腫瘤標(biāo)志物鑒別良惡性病變具有較好的特異性和敏感性。具有轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞在術(shù)前或術(shù)時(shí)脫離原發(fā)灶，以非常少的數(shù)量轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)、 骨髓、血液或遠(yuǎn)處器官中，普通的檢測手段不能發(fā)現(xiàn)，腫瘤的微轉(zhuǎn)移是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的重要起始步驟，及時(shí)診斷微轉(zhuǎn)移有助于對(duì)臨床治療方案選擇和預(yù)后的判斷，游離RNA是腫瘤微轉(zhuǎn)移、監(jiān)測療效、預(yù)后判斷的有效標(biāo)志物。游離RNA作為一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，許多方法和技術(shù)尚處于探索階段。它作為一種非侵入性的早期檢測手段，能在許多領(lǐng)域廣泛地應(yīng)用，目前的研究中已顯示出了良好的發(fā)展前景。本發(fā)明擬提供一種從血清、血漿等無細(xì)胞體液中提取游離RNA的方法及提取試劑盒，可以應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明的提取方法是按照以下步驟完成的1)化學(xué)法釋放核酸；2)酚氯仿抽提； 3) RNA在特定條件下吸附于二氧化硅表面；4)洗滌去除雜質(zhì)；5)洗脫得到RNA。本發(fā)明提供的游離RNA提取方法，其特征在于1)釋放核酸所用裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)釋放核酸所用裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是 Triton X-100、Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為PH小于7. O的飽和酚； 4) RNA吸附介質(zhì)可以是玻璃粉、玻璃纖維及其它表面包覆有SiO2的材料；5)洗滌時(shí)所用洗滌液中含有5% -100%的乙醇；6)洗滌時(shí)所用洗滌液中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。7)洗脫時(shí)所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。本發(fā)明提供的提取試劑盒，包括以下幾種組份裂解液、酚氯仿抽提液、洗滌液1、 洗滌液2、洗脫液、硅膠柱、使用說明書。本發(fā)明提供的提取試劑盒，其特征在于1)裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X_100、 Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為pH小于 7. 0的飽和酚；4)洗滌液1中含有5% -100%的乙醇和異丙醇中的一種或兩種；5)洗滌液1中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。6)洗滌液2中含有5% -100%的乙醇；7)洗脫時(shí)所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。本發(fā)明所提供的游離RNA提取方法及試劑盒具有簡便、快速、得率高、產(chǎn)物純度高、便宜等優(yōu)勢，適用于從血清、血漿等無細(xì)胞體液中快速分離RNA，所得RNA可以直接應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施方式盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實(shí)例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明專利的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)或修飾，這些改動(dòng)或修飾形式同樣屬本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1試劑成分裂解液2.4M GuSCN, IOOmM Tris (pH 7. 5) ,0. 5% Triton X-100酚氯仿抽提液苯酚氯仿等體積混勻。洗滌液1 1. 75M GuSCN, 25mM Tris (pH 7. 5)，15% 乙醇洗滌液2 :25mM Tris (pH 7. 5)，70% 乙醇洗脫液DEPC處理水實(shí)施例2游離RNA提取方法1)取300yL新鮮分離的血漿或血清，加入等量裂解液，振蕩混勻。2)冰上放置 5min。3)加入等體積酚氯仿抽提液，蓋上蓋子，劇烈振蕩30 60s。4) 12000g 離心 lOmin。5)轉(zhuǎn)移上層水相至新的離心管中，加入1. 25倍體積的無水乙醇，渦旋混勻。6)將步驟5的混合液加到硅膠柱中，IOOOOg離心30s。7)棄去濾過液，將硅膠柱放回到原來的收集管中。
8)加入500 μ L洗滌液1，IOOOOg離心30s，棄去濾過液，將硅膠柱放回到原來的收
集管中。9)加入600 μ L洗滌液2，IOOOOg離心30s，棄去濾過液，將硅膠柱放回到原來的收
集管中。10)重復(fù)步驟9 一次。11) IOOOOg離心lmin，以除盡殘留的醇類。12)將硅膠柱放置在一個(gè)新的1. 5mL離心管中，加50 100 μ L預(yù)熱(95°C )的洗脫液到硅膠柱的濾膜中央。13) IOOOOg 離心 lmin，，收集濾液(純化的 RNA)，_20°C或 _80°C保存。實(shí)施例3效果比較1)分別用Ambion的mirVana PARIS Kit和本發(fā)明所述的游離RNA提取試劑盒提取同一份血漿樣本，操作步驟分別參照Mirvana PARIS Kit說明書及實(shí)施例2中所述方法；2)產(chǎn)物用100 μ L洗脫液洗脫，對(duì)所得產(chǎn)物進(jìn)行OD值檢測，比對(duì)其純度和濃度；3)每個(gè)樣品取5 μ L進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測；4)逆轉(zhuǎn)錄采用 TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。表1逆轉(zhuǎn)錄體系
權(quán)利要求
1.一種從無細(xì)胞體液中提取RNA的方法，該提取方法是按照以下步驟完成的1)化學(xué)法釋放核酸；2)酚氯仿抽提；3) RNA在特定條件下吸附于二氧化硅表面；4)洗滌去除雜質(zhì)； 5)洗脫得到RNA。
2.如權(quán)利1所述提取RNA的方法，其特征在于1)釋放核酸所用裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)釋放核酸所用裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是Triton X-100, Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提中所用的酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為PH小于7. 0的飽和酚；4)RNA吸附介質(zhì)可以是玻璃粉、玻璃纖維及其它表面包覆有SiO2的材料；5)洗滌時(shí)所用洗滌液中含有5%-100%的乙醇；6)洗滌時(shí)所用洗滌液中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。7)洗脫時(shí)所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。
3.一種從無細(xì)胞體液中提取RNA的試劑盒，該包括以下幾種組份裂解液、酚氯仿抽提液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、硅膠柱、使用說明書。
4.如權(quán)利3所述提取RNA的試劑盒，其特征在于1)裂解液中含有高濃度的胍鹽，可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍中的一種或兩種。2)裂解液中含有0.05-50%的表面活性劑，該表面活性劑可以是TritonX-100,Tween 20、SDS、CTAB、NP-40 中的一種或幾種；3)酚氯仿抽提液中，苯酚與酚氯仿的比率為1 0.5-1 3，所述苯酚為pH小于7.0 的飽和酚；4)洗滌液1中含有5%-100%的乙醇和異丙醇中的一種或兩種；5)洗滌液1中含有0-8M鹽酸胍或者0-6M異硫氰酸胍，或者兩者皆有。6)洗滌液2中含有5%-100%的乙醇；7)洗脫時(shí)所用洗脫液可以是水，還可以是含有低濃度鹽離子的水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種從生物樣品中提取游離RNA的方法，其具體步驟包括用化學(xué)試劑將生物樣品中的核酸釋放出來；酚氯仿抽提出游離RNA；抽提出的游離RNA在高鹽條件下與硅膠柱結(jié)合；洗滌去除雜質(zhì)；低鹽條件下洗脫，得到高純度的游離RNA。本發(fā)明還提供了一種游離RNA提取試劑盒。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102286462SQ201110177638
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日 公開號(hào)201110177638.9
發(fā)明者朱海, 李富榮, 李金峰, 林季敏, 湯順清, 齊暉 申請(qǐng)人:暨南大學(xué), 深圳市易瑞生物技術(shù)有限公司