專利名稱：一種產(chǎn)富馬酸根霉菌的發(fā)酵過程調(diào)控方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種產(chǎn)富馬酸根霉菌的發(fā)酵過程調(diào)控方法，具體涉及一種基于代謝組學(xué)技術(shù)調(diào)控根霉菌生物合成富馬酸的方法。
背景技術(shù)：
富馬酸是一種含有雙鍵的二元羧酸，可以通過氨化、水合、加氫及異構(gòu)等工藝生產(chǎn) L-天冬氨酸、蘋果酸、琥珀酸、1，4-丁二醇、馬來酸等化合物，同時(shí)，作為重要的有機(jī)化工原料和精細(xì)化工產(chǎn)品也被廣泛應(yīng)用于材料(樹脂、涂料及增塑劑等)、醫(yī)藥、化工、食品及飼料添加劑等領(lǐng)域(李學(xué)坤，張昆，高振等.富馬酸的合成及應(yīng)用[J].現(xiàn)代化工，2005， 25(suppll): 81-84.)。目前，富馬酸主要通過石油衍生物馬來酸酐轉(zhuǎn)化而來，然而，隨著石油資源的枯竭和價(jià)格的不斷上升，研究者越來越重視用發(fā)酵技術(shù)代替石油化工轉(zhuǎn)化技術(shù)從可再生資源中生物煉制富馬酸。諸如米根霉(脅辦印狀oryzae)等根霉屬絲狀真菌，其發(fā)酵產(chǎn)物可提取富馬酸， 是目前生物法合成富馬酸的主要菌種。但由于根霉菌的重組基因不易表達(dá)，特異性重組頻率低，利用基因工程手段來提高根霉菌生產(chǎn)富馬酸的轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)能力仍很困難。傳統(tǒng)的誘變方法是提高根霉菌發(fā)酵富馬酸生產(chǎn)能力的重要工具。但是，由于傳統(tǒng)的誘變方法對(duì)細(xì)胞是全局性的改變，很難通過定點(diǎn)分析的方法全面深入理解高產(chǎn)富馬酸根霉菌菌株的代謝特征以及根霉菌高產(chǎn)富馬酸的機(jī)理，不能有效的指導(dǎo)進(jìn)一步菌種改造和工業(yè)發(fā)酵過程的優(yōu)化。根霉菌胞液中的TCA還原途徑是積累富馬酸的主要途徑，在富馬酸有氧條件下的積累過程中，TCA循環(huán)和TCA還原途徑是同時(shí)起作用的。TCA循環(huán)為細(xì)胞提供生長(zhǎng)及基礎(chǔ)代謝所需的中間代謝產(chǎn)物與能量ATP，還為TCA還原途徑提供必需的還原力NADH。(Kenealy W, Zaady E, Dupreez JC, et al, Biochemical aspects of fumaric acid accumulation by Rhizopus arrhizus . Appl Environ Microbiol, 1986, 52: 128-133.)上述兩條富馬酸代謝途徑間通過能量及還原力相互偶聯(lián)。相對(duì)以上較多的研究根霉菌生物合成富馬酸的生理過程，卻少有報(bào)道根霉菌生物合成富馬酸的分子機(jī)理。代謝組是細(xì)胞內(nèi)各種各樣生理變化產(chǎn)生的終端代謝物的集合，被認(rèn)為是對(duì)基因或環(huán)境變化響應(yīng)的一種放大。隨著越來越多的絲狀真菌被測(cè)序，科學(xué)家需要將這些數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄信息和代謝輪廓分析信息結(jié)合起來以全面系統(tǒng)理解根霉菌胞內(nèi)代謝組特征(Mei jer，S. ； Panagiotou, G.; Olsson, L.； Nielsen, J. , Physiological characterization of xylose metabolism inAspergillus niger under oxygen-limited conditions. Biotechnology and Bioengineering 2007, 98 (2)，462-475.)，這些信息有利于理解因菌種改造和環(huán)境因素變化導(dǎo)致的代謝網(wǎng)絡(luò)以及胞內(nèi)代謝物的響應(yīng)特性。對(duì)根霉菌來說，目前還沒有報(bào)道基于代謝組學(xué)技術(shù)分析基礎(chǔ)上的調(diào)控其生物合成富馬酸發(fā)酵過程的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明技術(shù)目的是提供一種產(chǎn)富馬酸根霉菌的發(fā)酵過程調(diào)控方法，該方法能利用代謝組學(xué)技術(shù)原理，系統(tǒng)、定量測(cè)定根霉菌高產(chǎn)富馬酸菌株胞內(nèi)代謝物，并通過多元統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析方法確定生物標(biāo)記物和顯著變化的胞內(nèi)代謝物，并結(jié)合根霉菌代謝網(wǎng)絡(luò)比較分析獲得根霉菌高產(chǎn)富馬酸的代謝特征，將獲得的信息指導(dǎo)根霉菌生物合成富馬酸發(fā)酵過程的調(diào)控。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下?！N產(chǎn)富馬酸根霉菌的發(fā)酵過程調(diào)控方法，其特征在于包括以下步驟 (1)同步培養(yǎng)
將根霉菌的原始菌株和其高產(chǎn)突變株用同樣的培養(yǎng)條件分別同步培養(yǎng)發(fā)酵富馬酸，并每12 16 h對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行取樣。以米根霉為例，在本發(fā)明中，具體培養(yǎng)條件為在400 rpm、溫度35°C的NBS發(fā)酵罐中，以10%的接種量接入裝液量為5 L的7 L發(fā)酵罐中，發(fā)酵周期為72 h，每12 1 對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行取樣分析。(2)根霉菌胞內(nèi)代謝物的提取
將取樣得到的發(fā)酵液中的根霉菌細(xì)胞用冷甲醇溶液滅活，并將淬滅后的根霉菌細(xì)胞在液氮中搗碎；將甲醇、氯仿、水的預(yù)冷溶液加入到細(xì)胞粉末中，同時(shí)，加入核糖醇作為內(nèi)標(biāo)物，振蕩混均。(3) GC-TOF-MS測(cè)定和胞內(nèi)代謝物分析
將步驟(2)得到的樣品分別加入甲氧基銨鹽酸鹽的吡啶溶液和三甲基硅烷基三氟乙酰 (MSTFA)后，用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)分析，定性定量檢測(cè)出根霉菌細(xì)胞內(nèi)所有代謝物。以米根霉為例，在本發(fā)明中，具體的分析方法為i yL的樣品的以分流比1:1比例注入氣相色譜里；質(zhì)譜的掃描范圍為m/z50-800，分析軟件為Masslynx (version4. 1， Waters);GC-MS的分析峰利用NIST MS數(shù)據(jù)庫(kù)及Golm Metabolome數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析確定。(4)多元統(tǒng)計(jì)分析
利用主成分分析法(PCA)對(duì)步驟(3)確定的胞內(nèi)代謝物進(jìn)行分析，確定生物標(biāo)記物和顯著變化因素。(5)高產(chǎn)富馬酸根霉菌突變株的機(jī)理分析
將步驟(4)分析得到的生物標(biāo)記物和顯著變化因素結(jié)合根霉菌的代謝功能區(qū)進(jìn)行比對(duì)，分析高產(chǎn)富馬酸突變株細(xì)胞內(nèi)的代謝特征，從代謝水平理解突變株高產(chǎn)富馬酸的機(jī)理。其中所述的比對(duì)并不局限于糖代謝、氮代謝、嘌呤嘧啶代謝以及脂肪酸代謝等中心碳代謝網(wǎng)絡(luò)，也包括質(zhì)譜檢測(cè)出來的其它任何相關(guān)代謝功能區(qū)。(6)根霉菌生物合成富馬酸的發(fā)酵調(diào)控
結(jié)合根霉菌高產(chǎn)突變菌株的胞內(nèi)代謝特征，通過有針對(duì)性的改變發(fā)酵過程參數(shù)，以實(shí)現(xiàn)調(diào)控根霉菌生物合成富馬酸的發(fā)酵過程。其中，所述的發(fā)酵過程參數(shù)主要包括溶氧、pH、轉(zhuǎn)速等；培養(yǎng)基成分，如碳源、氮源，無(wú)機(jī)鹽等；培養(yǎng)方式，如分步發(fā)酵、連續(xù)發(fā)酵、補(bǔ)料發(fā)酵等；以及外源添加輔助因子等發(fā)酵技術(shù)以實(shí)現(xiàn)強(qiáng)化高產(chǎn)菌株的胞內(nèi)代謝特征。本發(fā)明所述的根霉菌包括米根霉或者少根根霉。本發(fā)明的有益效果在于本發(fā)明將代謝組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于指導(dǎo)調(diào)控根霉菌生物合成富馬酸的發(fā)酵過程。通過對(duì)高產(chǎn)富馬酸菌株的代謝組分析，全面獲得根霉菌高產(chǎn)富馬酸胞內(nèi)代謝特征信息，從而為發(fā)酵過程控制優(yōu)化提供重要指導(dǎo)。與其它發(fā)酵調(diào)控策略相比，該方法能對(duì)細(xì)胞所有代謝物進(jìn)行無(wú)偏分析，對(duì)發(fā)酵調(diào)控更具有針對(duì)性，效率更高，可以為發(fā)酵過程控制優(yōu)化提供一種高效、系統(tǒng)的方法。


圖1是本發(fā)明所述的調(diào)控方法示意圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)施例1
本實(shí)施例說明產(chǎn)富馬酸米根霉(脅辦印狀oryzae)的發(fā)酵過程調(diào)控方法。菌株(1)原始菌株米根霉(ATCC 20344)。(2)高產(chǎn)富馬酸突變菌株采用波長(zhǎng)為800 nm、重復(fù)頻率為76 MHz的飛秒激光， 在照射功率為5 40 mW、照射時(shí)間為5 30 s的條件下對(duì)上述原始菌株進(jìn)行處理，獲得了一株米根霉高產(chǎn)富馬酸菌株；其中所用的優(yōu)化飛秒激光誘變方法，來自專利
發(fā)明者于守智, 徐晴, 李霜, 聞建平, 黃和 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué), 天津大學(xué)