專利名稱：一種以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域和食品領(lǐng)域，具體地說本發(fā)明涉及一種以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，利用真菌強大的物質(zhì)分解能力，去除白果毒性成分白果酸和酚類物質(zhì)。
背景技術(shù)：
金耳別名金木耳、黃金銀耳、黃木耳、金黃銀耳、金銀耳等，拉丁學(xué)名Tremella aarmiidh，金耳的藥用最早記載在陶弘景的《名醫(yī)別錄》中，明代《本草綱目》菜部第二十八卷對其形態(tài)、藥用部位及性味功能有描述。金耳性味甘平，滋陰潤肺，止咳化痰，生津。金耳寄生在毛脈高山櫟或光葉高山櫟樹干上，與毛韌革菌(份評洲 Air仰to )伴生生活，野生分布稀有，為中國特有種。完整的金耳擔(dān)子果腦狀，剖面外層為橙黃色膠質(zhì)，裂片中間為白色的肉質(zhì)區(qū)，有的不充實，呈中空的網(wǎng)狀，內(nèi)部白色肉質(zhì)為寄主毛韌革菌絲區(qū)。金耳這一珍貴中國特色藥用真菌資源由于生活的特殊性決定了其必須與寄主毛韌革菌相伴存在，共同形成異質(zhì)復(fù)合體，因此少量寄主毛韌革菌的存在是金耳賴以正常生長發(fā)育的基礎(chǔ)。由于毛韌革菌強大的分解和利用木質(zhì)纖維素等碳水化合物的能力，在金耳的生長發(fā)育史中極易處于生長優(yōu)勢，采用傳統(tǒng)的營養(yǎng)體繁殖手段得到的往往是毛韌革菌絲培養(yǎng)物，但可能被誤認(rèn)為是金耳菌絲，采用這種毛韌革菌培養(yǎng)物進(jìn)行深層發(fā)酵難以獲得真正意義上的金耳產(chǎn)物。針對金耳生活史的特殊性，中國專利CN101225361 B、CN101831369 A、CN101822373 A和CN101182562 A均未對使用的金耳菌種進(jìn)行鑒定，難以保證專利實施后的效果。中國專利89100117. 4報道了金耳代料栽培方法，該專利為了保證能夠獲得金耳的有效菌種，采用直接將金耳的組織塊作種子進(jìn)行接種培養(yǎng)，但金耳資源極其珍貴難獲得， 限制了專利的實施。中國專利200410022377. 3報道了金耳酵母狀孢子發(fā)酵生產(chǎn)食品和食品添加劑的方法，該專利單純使用金耳的酵母狀孢子作菌種，去掉了寄主毛韌革菌菌體，不能代表完整的金耳藥用品種。金耳的酵母狀孢子的真菌深層培養(yǎng)液中含有豐富的具有提高免疫力、降血糖和延緩衰老，以及抗炎和抗腫瘤等多種藥理活性的胞外多糖。金耳寄主菌毛韌革菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的橙黃色菌液中含有一系列具有廣譜抗病原菌和體外抗腫瘤活性的乙炔基芳香族化合物和三環(huán)倍半萜烯類，這些物質(zhì)具有良好的抗癌作用。銀杏俗稱白果，為傳統(tǒng)中藥，也是滋補佳品，異名靈眼、佛指甲、大佛指、佛指柑。 《中國藥典》(2000年版)收錄藥用白果仁和炒白果仁，用時搗碎，斂肺氣，定咳喘，止帶濁。 《本草再新》記載白果補氣養(yǎng)心，益腎滋陰，止咳除煩，生肌長肉，排膿拔毒，消瘡疥疽瘤。白果仁每100克含蛋白質(zhì)6. 4克，脂肪2. 4克，碳水化合物36克，鈣10毫克，鐵1毫克，磷218 毫克，核黃素50微克，胡蘿卜素3. 2微克。利用金耳與毛韌革菌共同深層發(fā)酵白果制成的銀杏金耳保健果酒，在現(xiàn)有技術(shù)中尚未見相同或相似的報道
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，所制得的銀杏金耳果酒外觀晶瑩剔透，酒香清雅， 酒體純凈，圓潤爽口，余味悠長，具有抗輻射保健功能。本發(fā)明的一種以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，是將金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌分別培養(yǎng)后得種子液，然后將金耳酵母狀孢子種子液與寄主菌毛韌革菌的種子液混合發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，再將發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合后進(jìn)行發(fā)酵制得銀杏金耳果酒。本發(fā)明以金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌為出發(fā)菌株，分別進(jìn)行金耳酵母狀孢子的搖瓶種子培養(yǎng)、金耳酵母狀孢子的種子罐培養(yǎng)、寄主菌毛韌革菌的搖瓶種子培養(yǎng)、寄主菌毛韌革菌的搖瓶擴大培養(yǎng)、寄主菌毛韌革菌的種子罐培養(yǎng)，以及金耳酵母狀孢子的種子罐種子與寄主菌毛韌革菌的種子罐種子混合發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液；金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合進(jìn)行后發(fā)酵制得銀杏金耳果酒。具體地，本發(fā)明所述的制備方法中，在金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)之前，首先將金耳酵母狀孢子的斜面菌種、毛韌革菌的斜面菌種分別接入斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，金耳酵母狀孢子的斜面菌種培養(yǎng)溫度1848°C，培養(yǎng)時間48-120小時， 毛韌革菌的斜面菌種培養(yǎng)溫度23-28°C，培養(yǎng)時間120-148小時；所述的斜面培養(yǎng)基為PDA 培養(yǎng)基，此類培養(yǎng)基的組成和所用參見中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心， 中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，1991版93頁。進(jìn)一步地，本發(fā)明所述的制備方法中，所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20-50、麩皮50-100、磷酸二氫鉀0. 2-2、硫酸鎂0. 1-2, 加水至適當(dāng)體積，起始PH為5. 8-7. 0 ；所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23-28°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間36-75小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為 (單位為克/升)葡萄糖20-50、麩皮10-50、黃豆10-80、磷酸二氫鉀0. 2-2、硫酸鎂0. 1-2, 加水至適當(dāng)體積，起始PH為5. 8-7.0 ；所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23-28°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間40-120小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的金耳酵母狀孢子的種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20-5、黃豆30-60、磷酸二氫鉀1-2、硫酸鎂0. 1-0. 5、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的金耳酵母狀孢子種子罐培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23- °C，種子罐壓力0. 05Mpa,攪拌速率100-250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量 1: (0. 3-1. 0)v/v/m，培養(yǎng)時間 36-60 小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20-50、黃豆10-80、玉米粉10-50、磷酸二氫鉀1_2、硫酸鎂 0. 1-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始PH為5. 8-7. 0 ；所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23- °C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間60-80小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的寄主菌毛韌革菌種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20-50、黃豆30-60、玉米粉10-50、磷酸二氫鉀1_2、硫酸鎂 0. 1-0. 5、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始PH為5. 8-7. 0 ；所述的寄主菌毛韌革菌種子罐培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23-28°C，種子罐壓力0. 05Mpa,攪拌速率50-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量按體積百分比5-10%，通風(fēng)量1: (0. 3-1. 0)v/v/m，培養(yǎng)時間48-120小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的金耳酵母狀孢子的種子罐種子與寄主菌毛韌革菌的種子罐種子混合發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)白果100-200、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的混合發(fā)酵培養(yǎng)的條件是兩種菌的種子罐種子按體積百分比各5-10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23- °C，發(fā)酵罐壓力0. 05Mpa,攪拌轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量 1: (0. 3-1. 0)v/v/m, 72-180 小時。本發(fā)明所述的制備方法中，所述的白果淀粉基質(zhì)的組成為(單位為克/升)白果淀粉、礦泉水，比重為1:1 ；金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌的混合發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合進(jìn)行后發(fā)酵的制酒工藝是將白果淀粉用礦泉水浸透，蒸煮25-40分鐘， 冷卻至50-65°C，按質(zhì)量百分比0. 5%-1. 0%加入米曲進(jìn)行保溫糖化1-2小時，升溫殺菌滅酶， 糖化后，冷卻至15-18°C，按照糖化料總重量的2-3倍加入所述的發(fā)酵液混勻，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在15-18°C，后發(fā)酵時間為7-15天，發(fā)酵后對醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在65-80°C進(jìn)行殺菌處理15秒-15分鐘，再進(jìn)行貯存，貯存期為20-100天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾兌、殺菌、過濾、包裝即制得銀杏金耳果酒。更具體地，本發(fā)明以金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌混合發(fā)酵銀杏白果生產(chǎn)銀杏金耳果酒的方法，包括以下步驟
(1)將金耳酵母狀孢子的斜面菌種接入新配制的PDA培養(yǎng)基(中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，1991版93頁)中，培養(yǎng)溫度1848°C，培養(yǎng)時間48-120小時；
(2)將寄主菌毛韌革菌的斜面菌種接入新配制的PDA培養(yǎng)基(中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，1991版93頁)中，培養(yǎng)溫度2348°C，培養(yǎng)時間120-148小時；
(3)將步驟(1)得到的金耳酵母狀孢子斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于23-28°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間36-75小時；
(4)將步驟(2)得到的毛韌革菌斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于 23-280C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間40-120小時；
(5)將步驟(3)得到的金耳酵母狀孢子的搖瓶種子按5-10%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23-28°C，種子罐壓力0. 05Mpa,攪拌速率100-250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0. 3-1. Ov/v/m，培養(yǎng)時間36-60小時；
(6)將步驟(4)得到的寄主菌毛韌革菌搖瓶菌種按5-10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴大培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度2348°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間 60-80小時；
(7)將步驟(6)得到的寄主菌毛韌革菌的搖瓶擴大種子按5-10%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度2348°C，種子罐壓力0. 05Mpa, 攪拌速率50-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量5-10% (體積百分比)，通風(fēng)量1:0. 3-1. Ov/v/m，培養(yǎng)時間48-120小時；
(8)將銀杏果去外殼及內(nèi)皮，再去除內(nèi)胚芽，加5-10倍體積水浸泡打漿，將步驟(5)和步驟(7)得到的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌的種子罐種子各按5-10% (體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入白果發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23-28°C，發(fā)酵罐壓力 0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速 50-250 轉(zhuǎn) / 分鐘，通風(fēng)量 1:0. 3-1. Ov/v/m, 72-180 小時；
(9)將白果淀粉用礦泉水浸透，蒸煮25-40分鐘，冷卻至50-65°C，按0.5%_1. 0% (質(zhì)量百分比)加入米曲進(jìn)行保溫糖化1-2小時，升溫殺菌滅酶，糖化后，冷卻至15-18°C，按照糖化料總重量的2-3倍加入步驟(8)獲得的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液，混勻，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在15-18°C，后發(fā)酵時間為7-30天；
(10)將步驟(9)獲得的發(fā)酵后醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在65°C-80°C進(jìn)行殺菌處理15 秒-15分鐘，再進(jìn)行貯存，貯存期為20-100天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾調(diào)，再進(jìn)行殺菌、過濾、包裝即得銀杏金耳果酒。所述的金耳酵母狀孢子和/或寄主菌毛韌革菌搖瓶培養(yǎng)基與三角瓶的容量之比可以是3:20至5:20 ；所述寄主菌毛韌革菌擴大培養(yǎng)基與三角瓶容積之比可以是3:20至 5:20 ；所述金耳酵母狀孢子和/或寄主菌毛韌革菌種子培養(yǎng)基的使用比為當(dāng)本發(fā)明上述的種子罐的容積為IOOL時，其中裝有的種子培養(yǎng)基的量為50-70L ；所述金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌混合發(fā)酵培養(yǎng)基的使用比為當(dāng)本發(fā)明上述發(fā)酵罐的容積為1000-5000L時， 其中裝有的發(fā)酵培養(yǎng)基的量相應(yīng)為500-3500L。本發(fā)明與已有的公開文獻(xiàn)比較具有以下創(chuàng)造性和先進(jìn)性
1)發(fā)酵工藝采用金耳的酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌兩種菌共同發(fā)酵白果，既保留了完整野生金耳的代謝產(chǎn)物優(yōu)勢，克服了以往技術(shù)由于只用革菌的菌絲發(fā)酵，而忽略了金耳特殊的生活特性，不能兼顧金耳多糖和毛韌革菌萜類成分的缺陷，又發(fā)揮了兩菌互補產(chǎn)生強大的分解轉(zhuǎn)化能力，脫除了銀杏白果的有毒酚酸類物質(zhì)，有效提升了發(fā)酵產(chǎn)物的藥用價值；
2)發(fā)酵工藝中的第二次發(fā)酵采用白果淀粉為基質(zhì)，既保證了果酒的藥用價值，又與銀杏的其它傳統(tǒng)酒工藝存在本質(zhì)的差異，也是本發(fā)明的創(chuàng)造性所在；
3)兩次發(fā)酵后制得的銀杏金耳果酒中富集了高效的血小板活化因子受體拮抗劑銀杏內(nèi)酯B，免疫增強劑金耳糖苷類，以及具有抗輻射、抗腫瘤作用的銀杏黃酮和毛韌革菌萜類， 同時口感適宜，易于吸收，較其它酒類產(chǎn)品工藝先進(jìn)，市場前景十分廣闊。本發(fā)明利用金耳與毛韌革菌共同深層發(fā)酵白果仁后，將發(fā)酵醪中補加白果淀粉和釀酒酵母等原料，深度發(fā)酵后制成的銀杏金耳保健果酒，為金黃色低度酒，去除了白果中有毒的成分，口感芳香醇厚，酒體純凈，圓潤爽口，酒精度大于3%，白果酚酸小于lppm，氫氰酸小于0. 1微克/升，富含金耳多糖、倍半萜、銀杏黃酮、銀杏內(nèi)酯B等。由本發(fā)明獲得的銀杏金耳果酒能夠協(xié)同發(fā)揮金耳與銀杏的雙重藥理作用，具有良好的抗輻射功能。
具體實施例方式為了進(jìn)一步闡述本發(fā)明的技術(shù)方案所涉及的制備，給出了下述實施例。但這些實施例不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中所使用的金耳酵母狀孢子和毛韌革菌是由發(fā)明人篩選得到的金耳BlOl菌株和毛韌革菌S102菌株，金耳BlOl菌株和毛韌革菌S102于2011年4月21日提交中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏。金耳BlOl的分類命名為龜耳(JremeIla atfra/ iia^a)，保藏號為CGMCC No. 4785 ；毛韌革菌S102的分類命名為 (Stereum Air1^/to )，保藏號為CGMCC No. 4786。保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1 號院3號中國科學(xué)院微生物研究所。
實施例1
一種以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，包括以下步驟
(1)將金耳酵母狀孢子的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基(中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，1991版93頁)中，培養(yǎng)溫度18°C，培養(yǎng)時間120小時；
(2)將寄主菌毛韌革菌的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基(中國微生物菌種保藏管理委員會農(nóng)業(yè)微生物中心，中國農(nóng)業(yè)菌種目錄，1991版93頁)中，培養(yǎng)溫度23°C，培養(yǎng)時間120小時；
(3)將步驟(1)得到的金耳酵母狀孢子斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于23°C，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間36小時；其中所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20，麩皮50 (沸水煮汁過濾取清液)，磷酸二氫鉀0. 2， 硫酸鎂0. 1，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8 ；
(4)將步驟(2)得到的寄主菌毛韌革菌斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于23°C，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間40小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20，麩皮10 (沸水煮汁過濾取清液)，黃豆10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 1，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8 ；
(5)將步驟(3)得到的金耳酵母狀孢子的搖瓶種子按5%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子罐培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率 50轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0. 3v/v/m，培養(yǎng)時間36小時；其中所述的金耳酵母狀孢子的種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20，黃豆30，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 1，豆油0. 2，加水至適當(dāng)體積，起始PH為5.8;
(6)將步驟(4)得到的寄主菌毛韌革菌搖瓶菌種按5%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴大培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23°C，轉(zhuǎn)速50轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間60小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶擴大培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖20，黃豆10，玉米粉 10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 1，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5.8 ；
(7)將步驟(6)得到的寄主菌毛韌革菌的搖瓶擴大種子按5%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率50轉(zhuǎn)/分鐘，接種量5% (體積百分比)，通風(fēng)量1:0. 3v/v/m，培養(yǎng)時間48小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖20，黃豆30，玉米粉10，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 1，豆油0.2，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5.8 ；
(8)將銀杏果去外殼及內(nèi)皮，再去除內(nèi)胚芽，加5倍體積水浸泡打漿，將步驟(5)和步驟 (7)得到的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌的種子罐種子各按5% (體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入白果發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23°C，發(fā)酵罐壓力0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速 50轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0. 3v/v/m,72小時；其中所述的混合發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)銀杏白果100，豆油0. 2，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8 ；
(9)將Ikg的白果淀粉用IL的礦泉水浸透，蒸煮25分鐘，冷卻至50°C，按質(zhì)量百分比 0. 5%加入米曲進(jìn)行保溫糖化1小時，升溫殺菌滅酶，糖化后，冷卻至15°C，按照糖化料總重量的2倍加入步驟(8)獲得的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液，混勻，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在15°C，后發(fā)酵時間為7天；
(10)將步驟(9)獲得的發(fā)酵后醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在65°C進(jìn)行殺菌處理15秒，再進(jìn)行貯存，貯存期為20天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾調(diào)，再進(jìn)行殺菌、過濾、包裝即得銀杏金耳果酒，酒精度大于3%，白果酚酸小于lppm，氫氰酸小于0. 1微克/升。 實施例2
一種以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，包括以下步驟
(1)將金耳酵母狀孢子的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間48小
時；
(2)將寄主菌毛韌革菌的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度28°C，培養(yǎng)時間148小
時；
(3)將步驟(1)得到的金耳酵母狀孢子斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于28°C，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間75小時；其中所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖50，麩皮100 (沸水煮汁過濾取清液)，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂2，加水至適當(dāng)體積，起始pH為7. 0 ；
(4)將步驟(2)得到的寄主菌毛韌革菌斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于28°C，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間120小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖50，麩皮30 (沸水煮汁過濾取清液)，黃豆80，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為7. 0 ；
(5)將步驟(3)得到的金耳酵母狀孢子的搖瓶種子按10%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率 250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1 1. Ov/v/m,培養(yǎng)時間60小時；其中所述的金耳酵母狀孢子的種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖50，黃豆60，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0. 5，豆油0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始PH為7.0;
(6)將步驟(4)得到的寄主菌毛韌革菌搖瓶菌種按10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴大培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間80小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶擴大培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖50，黃豆80，玉米粉50，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為7. O ；
(7)將步驟(6)得到的寄主菌毛韌革菌的搖瓶擴大種子按10%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量10% (體積百分比)，通風(fēng)量1:1. Ov/v/m，培養(yǎng)時間120小時；其中所述的毛韌革菌種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖50，黃豆60，玉米粉50，磷酸二氫鉀2，硫酸鎂0. 5，豆油0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為7. O ；
(8)將銀杏果去外殼及內(nèi)皮，再去除內(nèi)胚芽，加10倍體積水浸泡打漿，將步驟(5)和步驟(7)得到的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌的種子罐種子各按10% (體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入白果發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度28°C，發(fā)酵罐壓力0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:1. Ov/v/m, 180小時；其中所述的混合發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為 (單位為克/升)銀杏白果200，豆油0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為7. O ；
(9)將Ikg的白果淀粉用IL的礦泉水浸透，蒸煮40分鐘，冷卻至65°C，按1.0%(質(zhì)量百分比)加入米曲進(jìn)行保溫糖化2小時，升溫殺菌滅酶。糖化后，冷卻至18°C，按照糖化料總重量的3倍加入步驟(8)獲得的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在18°C，后發(fā)酵時間為15天；
(10)將步驟(9)獲得的發(fā)酵后醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在80°C進(jìn)行殺菌處理15分鐘， 再進(jìn)行貯存，貯存期為100天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾調(diào)，再進(jìn)行殺菌、過濾、包裝即得銀杏金耳果酒，酒精度大于3%，白果酚酸小于lppm，氫氰酸小于0. 1微克/升。 實施例3
一種以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，包括以下步驟
(1)將金耳酵母狀孢子的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度23°C，培養(yǎng)時間96小
時；
(2)將寄主菌毛韌革菌的斜面菌種接入PDA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度25°C，培養(yǎng)時間136小
時；
(3)將步驟(1)得到的金耳酵母狀孢子斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間66小時；其中所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖40，麩皮75 (沸水煮汁過濾取清液)，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為6. 2 ；
(4)將步驟(2)得到的寄主菌毛韌革菌斜面菌種轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶種子培養(yǎng)基的三角瓶中，于25°C，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間76小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖40，麩皮20 (沸水煮汁過濾取清液)，黃豆50，磷酸二氫鉀，硫酸鎂0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為6. 2 ；
(5)將步驟(3)得到的金耳酵母狀孢子的搖瓶種子按8%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率150 轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0. 5v/v/m，培養(yǎng)時間56小時；其中所述的金耳酵母狀孢子的種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖40，黃豆50，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 5，豆油0. 3，加水至適當(dāng)體積，起始PH為6. 2;
(6)將步驟(4)得到的寄主菌毛韌革菌搖瓶菌種按8%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有搖瓶擴大培養(yǎng)基的三角瓶中進(jìn)行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，轉(zhuǎn)速150轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間72小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶擴大培養(yǎng)基組成為(單位為克/升):葡萄糖40，黃豆50，玉米粉 30，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為6. 2 ；
(7)將步驟(6)得到的寄主菌毛韌革菌的搖瓶擴大種子按10%(體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率150轉(zhuǎn)/分鐘，接種量8% (體積百分比)，通風(fēng)量1:0. 5v/v/m，培養(yǎng)時間90小時；其中所述的寄主菌毛韌革菌種子培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)葡萄糖40，黃豆50，玉米粉30，磷酸二氫鉀1，硫酸鎂0. 5，豆油0. 3，加水至適當(dāng)體積，起始pH為6. 2 ；(8)將銀杏果去外殼及內(nèi)皮，再去除內(nèi)胚芽，加8倍體積水浸泡打漿，將步驟(5)和步驟 (7)得到的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌的種子罐種子各按8% (體積百分比)的接種量轉(zhuǎn)接入白果發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25°C，發(fā)酵罐壓力0. 05Mpa，攪拌轉(zhuǎn)速 150轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1:0. 5v/v/m, 120小時；其中所述的混合發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為(單位為克/升)銀杏白果150，豆油0. 3，加水至適當(dāng)體積，起始pH為6. 2 ；
(9)將Ikg的白果淀粉用IL的礦泉水浸透，蒸煮30分鐘，冷卻至55°C，按0.8%(質(zhì)量百分比)加入米曲進(jìn)行保溫糖化1. 5小時，升溫殺菌滅酶。糖化后，冷卻至16°C，按照糖化料總重量的2. 5倍加入步驟(8)獲得的金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液，混勻，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在16°C，后發(fā)酵時間為30天；
(10)將步驟(9)獲得的發(fā)酵后醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在70°C進(jìn)行殺菌處理10分鐘， 再進(jìn)行貯存，貯存期為60天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾調(diào)，再進(jìn)行殺菌、過濾、包裝即得銀杏金耳果酒，酒精度大于3%，白果酚酸小于lppm，氫氰酸小于0. 1微克/升。實施例4
用本發(fā)明的方法制得的銀杏金耳果酒(以實施例1產(chǎn)品為例)具有抗輻射的保健功能， 可通過下面的功能試驗證明
實驗動物昆明種近交系小鼠，雄性，體重18-22g。實驗方法隨機分為正常對照組、單純照射組、銀杏金耳果酒低劑量組、銀杏金耳果酒高劑量組，每組10只。銀杏金耳果酒低劑量組和銀杏金耳果酒高劑量組連續(xù)灌胃銀杏金耳果酒14天，每天1次，銀杏金耳果酒低劑量組每次lmL/kg，銀杏金耳果酒高劑量組每次 5mL/kg,至第14天給予小鼠6tlCo γ射線全身照射，照射劑量為7Gy，劑量率0. 7Gy ^irT1,照射時間lOmin。正常對照組和單純照射組灌胃蒸餾水，每天1次。觀察各組小鼠30d存活情況，統(tǒng)計30d存活率、平均存活天數(shù)，計算保護(hù)指數(shù)。各組間統(tǒng)計學(xué)檢驗方法采用t-檢驗。結(jié)果顯示，30天后給銀杏金耳果酒高劑量組小鼠的30d存活率比單純照射組提高 33%，平均存活時間提高6. 9天，差異顯著(/XO. 05)，保護(hù)指數(shù)1. 38(保護(hù)指數(shù)大于1. 2為有效)。銀杏金耳果酒低劑量組平均存活時間提高2. 6天，保護(hù)指數(shù)1.21，大于有效值。表明口服銀杏金耳果酒能夠減輕輻射損傷，顯著提高小鼠存活率。
權(quán)利要求
1.一種以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于，將金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌分別培養(yǎng)后得種子液，然后將金耳酵母狀孢子種子液與寄主菌毛韌革菌的種子液混合發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，再將發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合后進(jìn)行發(fā)酵制得銀杏金耳果酒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 金耳酵母狀孢子經(jīng)搖瓶種子培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)得金耳酵母狀孢種子液；寄主菌毛韌革菌經(jīng)搖瓶種子培養(yǎng)、搖瓶擴大培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)得寄主菌毛韌革菌種子液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 以克/升為單位，所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-50、麩皮50-100、磷酸二氫鉀0. 2-2、硫酸鎂0. 1-2，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的金耳酵母狀孢子搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23-28°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間36-75小時；所述的金耳酵母狀孢子的種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-5、黃豆30-60、磷酸二氫鉀1-2、硫酸鎂0. 1-0. 5、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的金耳酵母狀孢子種子罐培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度2348°C，種子罐壓力0. 05Mpa，攪拌速率 100-250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量1: (0. 3-1. 0)v/v/m，培養(yǎng)時間36-60小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 以克/升為單位，所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-50、 麩皮10-50、黃豆10-80、磷酸二氫鉀0. 2-2、硫酸鎂0. 1_2，加水至適當(dāng)體積，起始pH為 5. 8-7. 0 ；所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度2348°C，轉(zhuǎn)速50-250 轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間40-120小時；所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-50、黃豆10-80、玉米粉10-50、磷酸二氫鉀1-2、硫酸鎂0. 1-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的寄主菌毛韌革菌搖瓶種子培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度23-28°C，轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)時間60-80小時；所述的寄主菌毛韌革菌種子罐培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20-50、黃豆30-60、玉米粉10-50、磷酸二氫鉀1-2、硫酸鎂0. 1-0. 5、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為 5. 8-7. 0 ；所述的寄主菌毛韌革菌種子罐培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度2318°C，種子罐壓力 0. 05Mpa，攪拌速率50-250轉(zhuǎn)/分鐘，接種量按體積百分比5_10%，通風(fēng)量1 (0. 3-1. 0) ν/ν/ m，培養(yǎng)時間48-120小時。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以白果為基質(zhì)進(jìn)行金耳的酵母狀孢子和寄主毛韌革菌混合深層發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于，以克/升為單位，所述的金耳酵母狀孢子種子液與寄主菌毛韌革菌的種子液混合發(fā)酵培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成為白果100-200、豆油0. 2-0. 5，加水至適當(dāng)體積，起始pH為5. 8-7. 0 ；所述的混合發(fā)酵培養(yǎng)的條件是兩種菌的種子罐種子按體積百分比各5-10%的接種量轉(zhuǎn)接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中進(jìn)行混合培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度23- °C，發(fā)酵罐壓力0. 05Mpa,攪拌轉(zhuǎn)速50-250轉(zhuǎn)/分鐘，通風(fēng)量 1: (0. 3-1. 0)v/v/m, 72-180 小時。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 所述的白果淀粉基質(zhì)的組成為白果淀粉lkg、礦泉水IL ；金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)基混合發(fā)酵后的發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合進(jìn)行后發(fā)酵的制酒工藝是將白果淀粉用礦泉水浸透，蒸煮25-40分鐘，冷卻至50-65°C，按質(zhì)量百分比 0. 5%-1. 0%加入米曲進(jìn)行保溫糖化1-2小時，升溫殺菌滅酶，糖化后，冷卻至15-18°C，按照糖化料總重量的2-3倍加入所述的發(fā)酵液混勻，加入釀酒酵母進(jìn)行后發(fā)酵，后發(fā)酵溫度控制在15-18°C，后發(fā)酵時間為7-15天，發(fā)酵后對醪液進(jìn)行壓榨過濾，然后在65-80°C進(jìn)行殺菌處理15秒-15分鐘，再進(jìn)行貯存，貯存期為20-100天，將貯存后熟的酒進(jìn)行勾兌、殺菌、 過濾、包裝即制得銀杏金耳果酒。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 在金耳酵母狀孢子和寄主菌毛韌革菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)之前，首先將金耳酵母狀孢子的斜面菌種、毛韌革菌的斜面菌種分別接入斜面培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，金耳酵母狀孢子的斜面菌種培養(yǎng)溫度1848°C，培養(yǎng)時間48-120小時，毛韌革菌的斜面菌種培養(yǎng)溫度23_28°C，培養(yǎng)時間120-148小時。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，其特征在于， 所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以白果為基質(zhì)發(fā)酵制備銀杏金耳果酒的方法，該方法是將金耳酵母狀孢子與寄主菌毛韌革菌分別培養(yǎng)后得種子液，然后將金耳酵母狀孢子種子液與寄主菌毛韌革菌的種子液混合發(fā)酵培養(yǎng)得到發(fā)酵液，再將發(fā)酵液與白果淀粉基質(zhì)、釀酒酵母混合后進(jìn)行發(fā)酵制得銀杏金耳果酒。制得的銀杏金耳果酒酒精度大于3%，白果酚酸小于1ppm，氫氰酸小于0.1微克/升。由該方法獲得的銀杏金耳果酒具有抗輻射保健作用。
文檔編號C12R1/645GK102250722SQ201110185420
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月4日
發(fā)明者俞建國, 劉春卉, 馬維新 申請人:江蘇同源堂生物工程有限公司