專利名稱：雙孢蘑菇333號(hào)菌株scar-pcr鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種針對(duì)雙孢蘑菇品種的特異性SCAR-PCR檢測方法，更具體涉及一種雙孢蘑菇333號(hào)菌株的特異性SCAR-PCR檢測方法。
背景技術(shù)：
雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)屬蘑菇科蘑菇屬，別名蘑菇、洋蘑菇、白蘑菇。其味道鮮美，質(zhì)地脆嫩，屬高蛋白低脂肪的營養(yǎng)食品。經(jīng)常食用雙孢蘑菇，可以防止壞血病、預(yù)防腫瘤，促進(jìn)傷口愈合和解除鉛、砷、汞等的中毒，兼有補(bǔ)脾、潤肺、理氣、化痰之功效，能防止惡性貧血，改善神經(jīng)功能，降低血脂。我國是食用蘑菇生產(chǎn)大國，但是食用蘑菇的菌種互相串弓丨，流通量大使得菌種市場的管理比較混亂，同物異名、同名異物的現(xiàn)象較為普遍，品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)得不到有效保護(hù)。 自DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)以來，伴隨著分子生物學(xué)的發(fā)展許多生物技術(shù)已經(jīng)用于食用蘑菇的分類鑒定研究。目前，常用的技術(shù)有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)、限制性片段長度多態(tài)性 (RFLP)、序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)、ITS序列分析等。繼同核不育單孢分離物配對(duì)雜交育種、原生質(zhì)體融合等細(xì)胞水平的育種技術(shù)之后，雙袍蘑菇的遺傳育種已達(dá)到分子水平，其成果主要有同工酶電泳法鑒定種性，染色體混合標(biāo)記連鎖圖的建立，纖維素酶、漆酶基因的克隆，性因子的定位等。而每個(gè)成果的取得都離不開各種遺傳標(biāo)記在該物種研究上的應(yīng)用及不斷更新。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA (RAPD)技術(shù)在生命科學(xué)的許多研究領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，包括遺傳多態(tài)性研究、分類研究、遺傳關(guān)系分析、某些特定基因標(biāo)記、作連鎖圖譜等。這種以 PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)的技術(shù)克服了同工酶和RELP技術(shù)的一些缺點(diǎn)，具有快速、安全、簡便、靈敏度高、需樣量少的特點(diǎn)。該方法可用于鑒定不同類型的菌株，而不能對(duì)同一菌株進(jìn)行檢測。各國對(duì)本國特產(chǎn)物種的保護(hù)已經(jīng)成為國際貿(mào)易技術(shù)壁壘的新趨勢。為了使得我國農(nóng)產(chǎn)品物種資源免遭國外侵犯，對(duì)雙孢蘑菇菌種資源權(quán)益保護(hù)，勢在必行。因此建立雙孢蘑菇菌種鑒別技術(shù)，十分必要。序列特異擴(kuò)增區(qū)域(SCAR)的PCR擴(kuò)增技術(shù)已被應(yīng)用于香菇等食用菌菌種的鑒別， 但在雙孢蘑菇菌株鑒別上的應(yīng)用，尚未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明基于分子標(biāo)記技術(shù)，建立一種雙孢蘑菇333號(hào)菌株的SCAR-PCR鑒定方法。本發(fā)明的蘑菇333由福建省蘑菇菌種研究推廣站提供，該菌種是目前國內(nèi)主栽菌株，具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，我國不管南方、北方都栽培有較大的面積。本發(fā)明的一種雙孢蘑菇333號(hào)菌株的特異性SCAR-PCR鑒定方法，是利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)雙孢蘑菇333號(hào)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用特異引物對(duì)蘑菇333的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，能特異性地?cái)U(kuò)增出 389 bp的產(chǎn)物；所述特異引物的核苷酸序列為MR333-F :5’ - AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，； MR333-R 5' - CGCAACCCGTATTCAACTCC -3，。所述SCAR-PCR擴(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5 min, 94°C變性1 min,退火68. 0°C 1 min，72°C延伸1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min，4°C保存。反應(yīng)體系為10 X Taq buffer 2.0 μ L，7 《酶 1. 5 U，模板 DNA 100 ng，MgCl2 3.5 mmol/L, dNTPs 300 μ mol/L, 上游引物0.5 ymol/L，下游引物0. 5 口11101/1，用(1(1!120將總體積補(bǔ)至2(^1^本發(fā)明的方法用于特異性地鑒別出雙孢蘑菇333號(hào)菌株，該方法耗時(shí)短，操作簡便，特異性強(qiáng)，只針對(duì)蘑菇333特異性擴(kuò)增出389 bp的產(chǎn)物，可以更大地保護(hù)雙孢蘑菇的菌種資源。


圖1為40個(gè)雙孢蘑菇SCAR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜。
具體實(shí)施例方式試劑來源10 X Taq buffer與7 《酶、dNIPs購自上海生工有限公司，引物委托上海生工有限公司合成，DNA序列委托廣州英韋創(chuàng)建生物科技有限公司測試。1.引物合成
根據(jù)SRAP-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列，應(yīng)用I^rimer Premier 5. 0自動(dòng)設(shè)計(jì)了 SCAR引物，并用 Oligo 6進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。共設(shè)計(jì)了 5對(duì)引物，成功擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物的只有1對(duì)，序列如表1。表1 SCAR-PCR引物及其退火溫度
權(quán)利要求
1.一種雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)雙孢蘑菇333號(hào)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用特異引物對(duì)蘑菇333的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增；所述特異引物的核苷酸序列為MR333-F :5’ - AGGAAGGAAAGCACCAAATGG -3，；MR333-R 5' - CGCAACCCGTATTCAACTCC -3，。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用所述特異引物對(duì)蘑菇333的基因組DNA進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增，特異性地?cái)U(kuò)增出389 bp的產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于所述 SCAR-PCR擴(kuò)增的條件為94°C預(yù)變性5 min，94°C變性1 min，退火68. 0°C 1 min，72°C延伸 1 min，40個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min，4°C保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于所述 SCAR-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為10 X Taq buffer 2.0 μ LJa《酶 1.5 U，模板DNA 100 ng, MgCl2 3.5 mmol/L,dNTPs 300 μ mol/L，上游引物 0. 5 μ mol/L，下游引物 0. 5 ymol/L，用 ddH20將總體積補(bǔ)至20 μ L0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種雙孢蘑菇333號(hào)菌株SCAR-PCR鑒定方法，其特征在于利用SCAR分子標(biāo)記對(duì)雙孢蘑菇333號(hào)菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本發(fā)明的方法用于特異性地鑒別出雙孢蘑菇333號(hào)菌株，該方法耗時(shí)短，操作簡便，特異性強(qiáng)，只針對(duì)蘑菇333特異性擴(kuò)增出389bp的產(chǎn)物，可以更大地保護(hù)雙孢蘑菇的菌種資源。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102242208SQ20111018590
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者江樹勛, 邵碧英, 陳文炳 申請(qǐng)人:福建出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心