專利名稱：基于ssx-2基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于SSX-2基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是威脅生命的漿細(xì)胞性惡性腫瘤，在血液惡性腫瘤中發(fā)病率位于第二位。盡管干細(xì)胞移植以及新型藥物治療可以使病情得到有效控制，但很少有患者能夠取得完全緩解甚至治愈，復(fù)發(fā)和死亡的結(jié)局仍不可避免。分子生物學(xué)的發(fā)展使越來越多的腫瘤相關(guān)基因?yàn)槿藗兯J(rèn)知，這些重要的分子標(biāo)志已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤的診斷和治療中發(fā)揮了極大的作用，在MM中雖然已發(fā)現(xiàn)涉及免疫球蛋白基因重排、C-MYC、RAS癌基因突變及人類端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶mRNA過度表達(dá)等，但缺乏公認(rèn)的腫瘤相關(guān)的特異性診斷、微小殘留病檢測和預(yù)后評估的分子靶標(biāo)。癌睪丸抗原(Cancer testis antigen，CT抗原)基因是與惡性腫瘤相關(guān)的基因家族，編碼免疫原性蛋白質(zhì)，在過去15年間已鑒定了 40多個家族，表達(dá)特點(diǎn)是限制性表達(dá)于正常組織睪丸、卵巢和胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，其他正常組織幾乎不表達(dá)，而在多種腫瘤組織中有不同頻率的表達(dá)，且可誘導(dǎo)抗體介導(dǎo)和T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。基于其在腫瘤患者及正常組織中的表達(dá)特點(diǎn)和免疫原性，CT抗原已被認(rèn)為是有應(yīng)用前景的人類惡性腫瘤免疫治療的靶標(biāo)，并有可能成為重要的診斷和預(yù)后標(biāo)志。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種基于SSX-2基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒。本發(fā)明保護(hù)一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的試劑盒，包括特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述試劑盒還可包括陽性質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒為含有SSX-2基因(NCBI基因庫序列號NM_175698/003147)或其片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)?？蔀楹行蛄斜淼男蛄?所示的SSX-2基因片段的重組質(zhì)粒。所述陽性質(zhì)粒具體可為將PMD18-T載體與序列表的序列 7所示的SSX-2基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。所述試劑盒還可包括針對內(nèi)參基因的特異性引物對乙和探針乙；所述內(nèi)參基因?yàn)?ABL基因(NCBI基因庫序列號NM_005157)。所述特異性引物對乙具體可為序列表的序列4 所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列具體可如序列表的序列6所示。所述試劑盒還可包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)?？蔀楹行蛄斜淼男蛄?所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。所述內(nèi)參質(zhì)粒具體可為將PMD18-T載體與序列表的序列8所示的ABL基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
所述特異性引物對甲和所述探針甲可用于制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒。
在很多多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，SSX-2基因表達(dá)，而在正常人的骨髓或外周血中，SSX-2基因不表達(dá)。且處于不同ISS期的多發(fā)性骨髓瘤患者的骨髓或外周血中，SSX-2基因的陽性率具有差異性。本發(fā)明的試劑盒，不僅可以應(yīng)用于定性輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤，還可以通過內(nèi)參基因，測定患者SSX-2基因的表達(dá)水平。SSX-2基因的表達(dá)水平有希望成為MM輔助診斷、預(yù)后和療效監(jiān)測指標(biāo)，對其進(jìn)行深入研究有助于了解MM的病理機(jī)制，尋求新的治療策略。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。


圖1為內(nèi)參對照質(zhì)粒RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為陽性對照病人的RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖3為SSX-2基因的表達(dá)量與患者生存時間的相關(guān)性結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。TRIzol kits 購自Invitrogen公司。RNAsin 購自華美生物技術(shù)公司。dNTP 購自Pharmecia公司。Mo-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、5 X標(biāo)準(zhǔn)緩沖液購自Promega公司。DNA連接酶購自TakaRa公司。Universal PCR Master mix 購自天根生物技術(shù)有限公司。Phusion High-Fidelity PCR Kit:購自 New England Biolabs 公司。RPMI8226 細(xì)胞購自美國 ATCC(美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心)，產(chǎn)品目錄號為CCL-155。U266細(xì)胞購自美國ATCC，產(chǎn)品目錄號為TIB-196。KM3細(xì)胞購自上海拜力生物科技有限公司。K562細(xì)胞購自上海坤肯生物化工有限公司，中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10269。MEG-Ol細(xì)胞購自上海坤肯生物化工有限公司，中國細(xì)胞庫典藏細(xì)胞中心細(xì)胞目錄QK10748。HL60細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu 23。多發(fā)性骨髓瘤診斷及分期標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)Greipp PR, San Miguel J, Durie BG, et al. International Staging System for Multiple Myeloma. Journal of Clinical Oncology，2005，15 :3412-3420.。療效的評價標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)Durie BG, Harousseau JL, Miguel JS, et al. International uniform response criteria for multiple myeloma. Leukemia. 2006，20 1467-1473.。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS軟件v. 13. O。計(jì)量資料采用方差分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)。臨床資料與CT抗原基因表達(dá)間的相關(guān)性用直線相關(guān)分析。ρ < 0. 05被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過單因素和多因素分析評價因素與生存的相關(guān)性，采用 Log-rank檢驗(yàn)鑒定生存相關(guān)因素，ρ < 0. 05的變量納入Cox回歸分析，ρ < 0. 2定義為與生存預(yù)后相關(guān)的因素。實(shí)施例3至8中的PCR參數(shù)均如下PCR反應(yīng)體系(10 μ 1)上游引物0. 9 μ Μ，下游引物0. 9 μ Μ，探針0. 25 μ Μ,2XTaqMan通用PCR公共體系5 μ 1 (ABI公司，美國)，質(zhì)粒1 μ 1 ；其余為去離子水。PCR 反應(yīng)條件:50°C 2min，l 個循環(huán)；95°C lOmin，1 個循環(huán)；95°C 15s，60°C lmin，50 個循環(huán)。實(shí)施例1、特異性引物對和探針的設(shè)計(jì)SSX-2基因(NCBI基因庫序列號NM_175698/003147)位于人染色體Xpll. 22，針對SSX-2基因設(shè)計(jì)特異性引物對甲(由上游引物SSX-FP和下游引物SSX-RP組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為IlObp)和探針甲(探針SSX-T-probe)上游引物SSX-FP (序列表的序列 1) :5，-TAACCGTGGGAATCAGGTTGA-3，下游引物SSX-RP (序列表的序列 2) :5，-CCTCCGAATCATTTCCTTCCT-3，探針SSX-T-probe (5，— 3，)FAM-CCGAAGATCATGCCCAAGAAGCCAG-BHQ(核苷酸序列為序列表的序列 3)。針對ABLl基因(內(nèi)參基因；NCBI基因庫序列號NM_005157)設(shè)計(jì)的特異性引物對乙(由上游引物ABLl-F和下游引物ABL1_R組成，擴(kuò)增產(chǎn)物為124bp)和探針乙(探針 ABLl-T-probe)上游引物ABL1-F(序列表的序列 4) :5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3， 下游引物ABL1_R(序列表的序列 5) 5，-GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，；探針ABLl_T_probe(5，— 3，)FAM-CCATTTTTGGTTTGGGCTTCACACCATT-TAMRA(核苷酸序列為序列表的序列 6)。分別合成特異性引物對甲、探針甲、特異性引物對乙和探針乙。(可參考文獻(xiàn)合成:Gabert J, Beillard Ε, van der Velden VH, et al. Standardization and quality control studies of， real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia—a Europe Against Cancer program. Leukemia. 2003,17 :2318-57.)。實(shí)施例2、相關(guān)質(zhì)粒的制備一、陽性對照質(zhì)粒(含有SSX-2基因片段的質(zhì)粒)的制備以SSX-2基因表達(dá)陽性的多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA 為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列7所示(435bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入PMD18-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了陽性對照質(zhì)粒丁(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在 ECOR V位點(diǎn)插入序列7所示cDNA)。PCR擴(kuò)增所用的引物對如下上游引物5，-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC-3，；下游引物5，-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG-3，。 二、內(nèi)參對照質(zhì)粒(含有ABL基因片段的質(zhì)粒)的制備以正常人(志愿者)的骨髓單個核細(xì)胞的cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表的序列8所示(124bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，克隆入pMDIS-T質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)，篩選陽性克隆提取質(zhì)粒并純化后進(jìn)行測序，結(jié)果表明得到了內(nèi)參對照質(zhì)粒(骨架質(zhì)粒為PMD18-T質(zhì)粒，在ECOR V位點(diǎn)插入序列8所示cDNA)。
PCR擴(kuò)增所用的弓丨物對如下上游引物5，-TGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT-3，；下游引物5，- GATGTAGTTGCTTGGGACCCA-3，。三、陰性對照質(zhì)粒pMD18-T 質(zhì)粒。實(shí)施例3、檢測陽性對照質(zhì)粒的靈敏度檢測將實(shí)施例2得到的內(nèi)參對照質(zhì)粒用滅菌雙蒸注射用水進(jìn)行10倍梯度稀釋得到各個稀釋液(每微升分別含有IO6UO5UO4UO3UO2UO1UOq個拷貝的ABL基因片段)；通過測定吸光度值計(jì)算SSX-2基因片段或ABL基因片段的拷貝數(shù))。將各個內(nèi)參對照質(zhì)粒采用實(shí)施例1得到的特異性引物對乙和探針乙在熒光實(shí)時定量PCR儀(美國ABI公司7500-FAST 型)上進(jìn)行RQ-PCR。內(nèi)參對照質(zhì)粒RQ-PCR熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1 (閾值為0. 082)，函數(shù)為 Iog10ABLl = (Ct-38. 46)/-3. 22，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.99以上，檢測內(nèi)參基因的靈敏度達(dá)10個拷貝。將一例多發(fā)性骨髓瘤患者(志愿者)的cDNA，用滅菌雙蒸注射用水1 :10梯度稀釋，采用實(shí)施例1得到的特異性引物對甲和探針甲在熒光實(shí)時定量PCR儀上進(jìn)行 RQ-PCR(美國ABI公司7500-FAST型)。擴(kuò)增曲線顯示Ct值和SSX-2啟始模板量的對數(shù)存在線性相關(guān)(相關(guān)系數(shù)大于0. 99，檢測靈敏度達(dá)10_4，閾值為0. 082 ；見圖2)，其擴(kuò)增效率與 ABL基因相近，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，均用ABL標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算基因拷貝數(shù)，檢測SSX-2基因片段的靈敏度可達(dá)10個拷貝。實(shí)施例4、檢測細(xì)胞系及多發(fā)性骨髓瘤患者一、試劑盒的組裝試劑盒由如下組件組成實(shí)施例1制備的針對SSX-2基因的特異性引物對甲和探針甲、針對ABLl基因的特異性引物對乙和探針乙；實(shí)施例2制備的陽性對照質(zhì)粒和內(nèi)參對照質(zhì)粒。二、應(yīng)用步驟一的試劑盒檢測細(xì)胞系分別檢測各個細(xì)胞系中SSX-2基因的表達(dá)水平。每個細(xì)胞系樣本皆重復(fù)檢測3次。 步驟如下1、提取各個細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以cDNA為模板，用特異性引物對甲和探針甲在熒光實(shí)時定量PCR儀(美國ABI 公司7500-FAST型)上進(jìn)行RQ-PCR ；以cDNA為模板，用特異性引物對乙和探針乙在熒光實(shí)時定量PCR儀(美國ABI公司7500-FAST型)上進(jìn)行RQ-PCR。分析每批RQ-PCR結(jié)果時閾值均固定為閾值為0. 082。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)條件同實(shí)施例3。用內(nèi)參對照質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得到各細(xì)胞系中SSX-2基因和ABLl 基因的拷貝數(shù)。以SSX-2基因的拷貝數(shù)與ABLl基因的拷貝數(shù)的比值表示SSX-2基因的相對表達(dá)水平(％ )。結(jié)果見表1。表1在血液腫瘤細(xì)胞系中SSX-2基因的相對表達(dá)水平
權(quán)利要求
1.一種輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的試劑盒，包括特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括陽性質(zhì)粒；所述陽性質(zhì)粒為含有SSX-2基因或其片段的重組質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)粒為含有序列表的序列7所示的SSX-2基因片段的重組質(zhì)粒。
4.如權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述陽性質(zhì)粒為將PMD18-T載體與序列表的序列7所示的SSX-2基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括針對內(nèi)參基因的特異性引物對乙和探針乙；所述內(nèi)參基因?yàn)锳BL基因。
6.如權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于所述特異性引物對乙為序列表的序列4 所示DNA和序列表的序列5所示DNA組成的引物對；所述探針乙的核苷酸序列如序列表的序列6所示。
7.如權(quán)利要求5或6所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括內(nèi)參質(zhì)粒；所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有ABL基因或其片段的重組質(zhì)粒。
8.如權(quán)利要求7所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參質(zhì)粒為含有序列表的序列8所示的ABL基因片段的重組質(zhì)粒。
9.如權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于所述內(nèi)參質(zhì)粒為將PMD18-T載體與序列表的序列8所示的ABL基因片段連接得到的重組質(zhì)粒。
10.特異性引物對甲和探針甲在制備輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤的試劑盒中的應(yīng)用；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于SSX-2基因輔助診斷多發(fā)性骨髓瘤患者的定量檢測試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括特異性引物對甲和探針甲；所述特異性引物對甲為序列表的序列1所示DNA和序列表的序列2所示DNA組成的引物對；所述探針甲的核苷酸序列如序列表的序列3所示。本發(fā)明的試劑盒，不僅可以應(yīng)用于定性診斷多發(fā)性骨髓瘤，還可以通過內(nèi)參基因，測定患者SSX-2基因的表達(dá)水平。本發(fā)明為多發(fā)性骨髓瘤的診斷提供了一條快速、可靠、準(zhǔn)確的新途徑，為療效觀察、微小殘留病的動態(tài)觀察提供依據(jù)。本發(fā)明將在醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。
文檔編號C12N15/11GK102251035SQ20111018728
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者劉開彥, 劉艷榮, 張瑤, 李金蘭, 江濱, 阮國瑞, 陳珊珊, 黃曉軍 申請人:北京大學(xué)人民醫(yī)院