專(zhuān)利名稱(chēng)：RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
玉米作為我國(guó)三大糧食作物之一，其常年種植面積約2000萬(wàn)公頃，總產(chǎn)量達(dá)1200 億公斤。然而，近些年來(lái)，由于玉米病毒病逐漸加重，已成為玉米生產(chǎn)上的重要病害，尤其是玉米粗縮病。玉米粗縮病是由灰飛虱傳毒的一種病毒病害，廣泛分布于除非洲、北美外的熱帶、亞熱帶和溫帶的玉米產(chǎn)區(qū)。最早在意大利發(fā)現(xiàn)，之后在以色列、法國(guó)、瑞士、西班牙、德國(guó)、挪威、前捷克斯洛伐克、前南斯拉夫和阿根廷等國(guó)發(fā)生。在我國(guó)，50年代玉米粗縮病在新疆南部、甘肅西部曾嚴(yán)重發(fā)生，70年代流行于華北，近年來(lái)在我國(guó)東北、華北、西北、華中及長(zhǎng)江以南部分地區(qū)大面積暴發(fā)、流行，具明顯的上升趨勢(shì)，成為我國(guó)玉米上的重要病害之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，1996年全國(guó)玉米粗縮病發(fā)病面積233萬(wàn)公頃，占玉米總種植面積的10% 以上，毀種絕收約4萬(wàn)公頃，一般病田病株率達(dá)10-40%，平均減產(chǎn)10-30%。2007年山東省大面積爆發(fā)玉米粗縮病，全省發(fā)生面積約340萬(wàn)畝，比往年都有所增加，嚴(yán)重時(shí)造成部分地塊近絕收。以上數(shù)據(jù)表明，玉米粗縮病已成為我國(guó)玉米上的重要病毒病害之一。RNaseIII家族是一類(lèi)依賴(lài)于dsRNA的特異性的內(nèi)切核酸酶，在真核生物或原核生物中都有發(fā)現(xiàn)，如細(xì)菌、酵母、線(xiàn)蟲(chóng)、果蠅和人類(lèi)等。此類(lèi)酶在生物轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用在原核生物中，與rRNA前體的剪接，mRNA的代謝等生命過(guò)程密切相關(guān)；真核生物中，在性的發(fā)育或花的形成等生命活動(dòng)起調(diào)控作用外，其缺失可造成生命的死亡。利用其切割dsRNA的特性，在生物體免疫，RNA干擾和植物抗病毒策略(PTR)等方面越來(lái)越發(fā)揮著重要功能。植物病毒多為單鏈正義RNA(ssRNA)，當(dāng)病毒侵入植物體繁殖自身時(shí)，ssRNA復(fù)制形成dsRNA中間體，這正好是依賴(lài)dsRNA的內(nèi)切核酸酶的靶向底物，RNaseIII結(jié)合到此結(jié)構(gòu)，進(jìn)行切割，形成小的RNA碎片。Court等于1993年提出因?yàn)橹仓昊蚪MRNA很多都形成莖環(huán)狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)入野生型的RNaseIII將會(huì)對(duì)植物的正常生長(zhǎng)有很大危害。他們將大腸桿菌中的RNaseIII基因(rnc)中的第117個(gè)氨基酸由谷氨酸突變?yōu)橘?lài)氨酸后，這種突變體(rnC70)就只能結(jié)合雙鏈RNA，而不能切割。目前還未有抗RBSDV的玉米品種，一旦感染玉米粗縮病，目前還沒(méi)有好的根治辦法，且抗性種質(zhì)資源匱乏，因此開(kāi)發(fā)轉(zhuǎn)基因玉米抗病新品種來(lái)從根本上控制玉米粗縮病的爆發(fā)顯得尤為重要和迫切。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法。本發(fā)明提供的方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得抗粗縮病的轉(zhuǎn)基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。所述RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)為序列表中的序列1。所述目的植物為雙子 葉植物或者單子葉植物。所述雙子葉植物為玉米。所述粗縮病由下述致病菌引起水稻黑條矮縮病毒(Rice blackstreaked dwarf virus, RBSDV)。所述RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物，所述植物表達(dá)載體具體為PAM2025。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明將RNaseIII突變體的編碼基因(rnc70)導(dǎo)入玉米中， 得到轉(zhuǎn)基因玉米新品種，該新品種對(duì)于常見(jiàn)玉米病毒病具有較強(qiáng)抗性，在大田栽培過(guò)程中， 在相同的病毒病危害情況下，本發(fā)明培育的轉(zhuǎn)基因玉米新品種與非轉(zhuǎn)基因或感病對(duì)照組相比具有明顯的抗病效果，從而對(duì)于減少病毒病危害，保障玉米穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。


圖1為轉(zhuǎn)rnc70玉米植株的獲得圖2為轉(zhuǎn)rnc70玉米植株基因組PCR檢測(cè)結(jié)果圖3為轉(zhuǎn)rnc70玉米植株的PCR-Southern檢測(cè)
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、轉(zhuǎn)rnc70玉米的獲得一、重組農(nóng)桿菌的獲得1、植物表達(dá)載體向農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化取200 μ 1感受態(tài)農(nóng)桿菌LBA4404(張榮，王國(guó)英，張曉紅，趙虎基.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2001，9(1) :45-48，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)和河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得)，加入lygpAM2025質(zhì)粒(Mitra，Α.， Higgins, D. W. , Langenberg, W. G. , Nie, H. , Sengupta, D. N. , and Silverman, R. H. (1996). A mammalian 2—5A system functions as an antiviral pathway in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences93 (13)，6780-6785，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)和河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所獲得，該質(zhì)粒含有RNaseIII突變體的編碼基因rnCC70，該基因的核苷酸序列為序列表中的序列1，也可以人工合成序列1，RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4.)，冰浴30min，液氮中速凍lmin，37°C水浴5min，然后加入Iml YEB培養(yǎng)基(含有125mg/L鏈霉素)，28°C慢速振蕩培養(yǎng)4h ；IOOOrpm離心30 秒，棄上清，加入0. Iml YEB培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，涂布于含有適當(dāng)濃度的抗生素的YEB平板上，28°C培養(yǎng)約48h，得到重組農(nóng)桿菌。2、陽(yáng)性克隆的鑒定和保存挑取上述獲得的重組農(nóng)桿菌在含有相應(yīng)抗生素的YEB平板上劃線(xiàn)，28°C過(guò)夜培養(yǎng)，挑少許菌于含有2-3ml YEB液體培養(yǎng)基的指形管中，28°C過(guò)夜搖菌。用堿裂解法提質(zhì)粒， 利用BamH I對(duì)提取的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切鑒定，酶切后得到約681 bp大小的條帶對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒為酶切鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒；同樣，利用引物PRN3-3 :5，-CAACGGAAGCTGGGCTACAC-3，(序列2)禾口 PRN3-4 5 ‘ -TTGAACCTGTGCCAACCACC-3 ‘(序列 3)對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行 PCR 鑒定，擴(kuò)增得到約 592 bp 的片段的為PCR鑒定陽(yáng)性質(zhì)粒，將PCR鑒定結(jié)果與酶切鑒定結(jié)果均為陽(yáng)性質(zhì)粒即為陽(yáng)性質(zhì)粒。將含有該陽(yáng)性質(zhì)粒的重組農(nóng)桿菌菌液加入甘油至終濃度為15%，混勻后保存于_70°C，或者將劃線(xiàn)的平板4°C保存，每隔一個(gè)月繼代一次，并命名為L(zhǎng)BA4404/pAM2025。二、轉(zhuǎn)rnc70玉米的獲得1、農(nóng)桿菌菌液的制備挑取繼代3天后LBA4404/pAM2025單菌落，在加有相應(yīng)抗生素的液體YEB培養(yǎng)基中，以250rpm進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，在28°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，將菌液置于離心管中，在 5000rpm下離心5min并收集菌體，將收集的菌體用含ΙΟΟμπιοΙ/L As (乙酰丁香酮)的 D-inf液體培養(yǎng)基洗1-2次，最后將菌體重懸浮于添加100 μ mol/L As的D-inf液體培養(yǎng)基中，OD值約0. 35-0. 45，放置0. 5h可用于轉(zhuǎn)化，得到農(nóng)桿菌菌液。D-inf液體培養(yǎng)基配方
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得抗粗縮病的轉(zhuǎn)基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突變體的編碼基因?yàn)樾蛄斜碇械男蛄?。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或者單子葉植物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述單子葉植物為玉米。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于所述粗縮病由下述致病菌引起水禾S漂條矮縮病毒(Rice blackstreaked dwarf virus)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于所述RNaseIII突變體的編碼基因通過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種RNaseIII的突變基因在植物抗病中的應(yīng)用。本發(fā)明提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物方法，為將RNaseIII突變體的編碼基因?qū)肽康闹参?，獲得抗粗縮病的轉(zhuǎn)基因植物；所述RNaseIII突變體的氨基酸序列為序列表中的序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明培育的轉(zhuǎn)基因玉米新品種對(duì)于常見(jiàn)玉米病毒病具有較強(qiáng)抗性，在大田栽培過(guò)程中，在相同的病毒病危害情況下，本發(fā)明培育的轉(zhuǎn)基因玉米新品種與對(duì)照組相比具有明顯的抗病效果，從而對(duì)于減少病毒病危害，保障玉米穩(wěn)產(chǎn)具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102250945SQ20111018729
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者于嘉林, 劉賀, 張志燕, 張永亮, 徐佳凌, 曹修嶺, 李大偉, 田蘭芝, 苗洪芹, 路銀貴, 邸墊平, 韓成貴 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所