專利名稱：控制紅刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶基因序列及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
屬于基因的克隆技術(shù)及其序列分析技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是涉及紅刺玫二氫黃酮醇 4-還原酶基因的克隆方法及其編碼蛋白質(zhì)在改變花色時的應(yīng)用技術(shù)。
背景技術(shù)：
HMM (Rosa multiflora Thunb. var. cathayensis Rehd. et ffils.) , 禾4* 屬野薔薇的一個變種。中國原產(chǎn)。傘房花序、花期長以及高耐濕熱氣候特性成為黃淮海流域和城市高架綠化的新寵。然而紅刺玫花單瓣、花色單一限制其廣泛應(yīng)用，且天然的三倍體起源使得對其進(jìn)行傳統(tǒng)雜交育種很難得到改良的子代，改變其花色會提高其應(yīng)用價(jià)值。目前有關(guān)控制紅刺玫花色的基因克隆還未見報(bào)道，對其花色形成機(jī)制的研究也相對較少。為了更好的保護(hù)和利用該資源，利用基因工程改變紅刺玫花色前景看好。在植物的花色合成的途徑中，二氧黃酮醇4-還原酶(DFR)基因起著決定作用，克隆出紅刺玫DFR基因尤為關(guān)鍵。花色素苷有三種類型，根據(jù)羥基的位置和數(shù)目，分為翠雀素色素苷、花青素色素苷及花葵素色素苷，這三種色素苷均以配糖體形式存在?；ㄇ嗨氐纳铣砂ㄒ幌盗械幕瘜W(xué)反應(yīng)，花青素的生化合成中有15個結(jié)構(gòu)基因和2類調(diào)節(jié)基因參與，并有許多酶催化完成， 對這些基因和酶的調(diào)節(jié)直接影響植物色彩表達(dá)(見圖1)。DFR就是在還原型輔酶II (NADPH) 的參與下，不同物種DFR選擇不同的底物，合成不同的花色素，呈現(xiàn)不同的花色。二氫楊梅黃麗(dihydromyricetin, DHM)、二氧棟皮醇(dihydroquercetin, DHQ)禾口二S茨非醇 (dihydrokaempferol,DHK)在DFR酶的作用下分別合成無色的翠雀素，花青素和花葵素，最后在DFR、花色素苷合成酶(anthocyanin synthase, ANS)等酶的作用下合成各種相應(yīng)的翠雀素-3-葡萄糖苷、花青素-3-葡萄糖苷、花葵素-3-葡萄糖苷，分別表現(xiàn)出藍(lán)紫色、粉色至紅紫色、橙紅色至紅色。即在復(fù)雜的花色形成過程中，呈現(xiàn)不同顏色的花色素的積累主要是依賴于DFR基因的活性，失去DFR活性的突變體產(chǎn)生象牙色或者白色。所以，調(diào)節(jié)DFR酶的合成可以控制花色形成的途徑，創(chuàng)造出新的花色。花色合成的途徑中，DFR基因起決定性作用。薔薇屬植物的DFR基因主要催化該基因的第142-1M位點(diǎn)即VYNESNWSDVEFCR核酸序列生成花葵素，形成橙紅色的花色。利用基因工程改變內(nèi)源DFR基因即可以達(dá)到改變植物花色的目的。因此得到紅刺玫的DFR基因?qū)Ω淖兤浠ㄉ哂蟹浅Ｖ匾囊饬x。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于為了改變紅刺玫的單一花色的弊端，創(chuàng)造出新的花色，以便在綠化美化城市中得到更廣泛的應(yīng)用。為此，本發(fā)明要提供控制紅刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)基因序列及其克隆方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案
控制紅刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶基因序列，其方案在于該基因在紅刺玫花內(nèi)存在至少兩個，均具有一個完整的基因編碼區(qū)域；該基因的核苷酸序列是附錄1所示； 所編碼的蛋白質(zhì)序列是附錄2所示；其堿基序列和氨基酸序列顯示紅刺玫中DFR與NADP結(jié)合位點(diǎn)“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 和“TSSAG TVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 是高度保守的底物結(jié)合區(qū)，結(jié)合區(qū)中的第134位氨基酸直接影響酶的底物特異性；紅刺玫DFR基因編碼的氨基酸序列顯示，其DFR高度保守的底物結(jié)合區(qū)是134位是名為天冬酰胺的N，其 DFR酶的底物為DHK或者為DHQ ；催化生成花葵素_3_葡萄糖苷或者為花青素_3_葡萄糖苷，顯現(xiàn)出磚紅色或者紅色；改變134位氨基酸的組成是改變紅刺玫花色的必要條件?？刂萍t刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶基因的克隆方法，具體的操作步驟如下1)設(shè)計(jì)兩個引物如下RosaDFR-F :ATGGCATCGGAATCCGAGTC
RosaDFR-R TTAGCCTGTGACTTTGACACG2).提取紅刺玫花苞的mRNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄為cDNA ；3).弓I 物0· 8μ L，dNTP(2mM) :1· 2μ L，10*PCR KOD buffer :2μ L，KOD-Plus 0. 5 μ L，cDNA :0. 5 μ L，滅菌雙蒸水14. 2 μ L ；4).按照下述條件進(jìn)行 PCR 反應(yīng)94°C 3min,94°C 30s, 62°C 30s, 68°C lmin，30 個循環(huán)，68°C延伸 IOmin, 10°C保存 IOmin ；5).對紅刺玫DFR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條約為1. Okb 特異性條帶。測序按常規(guī)將PCR合成后后純化進(jìn)行末端加A反應(yīng)，然后再加反應(yīng)后的基因與PMD18-T 載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Dffia感受態(tài)菌株，涂布Amp+瓊脂培養(yǎng)平板，37°C過夜，挑取8個克隆進(jìn)行小量質(zhì)粒提取，所得到的質(zhì)粒經(jīng)酶切及菌落PCR，并用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確認(rèn)獲得陽性克隆，重組質(zhì)粒命名為PMD-DFR。并送到博尚生物有限公司進(jìn)行測序。取PMD-DFR質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸序列測定，結(jié)果表明，紅刺玫的二氫黃酮醇4_還原酶基因全長1050bp，其核苷酸序列及相應(yīng)的氨基酸序列分別見附錄。紅刺玫體內(nèi)二氫黃酮醇 4-還原酶基因至少存在兩個，分別命名為DFRA和DFRB。全長均為1050bp，兩個DFR基因在15個堿基處存在差異。兩個基因具有一個完整ORF閱讀框，兩者編碼氨基酸的均為349 個，編碼氨基酸存在8處差異。紅刺玫編碼的DFR基因的蛋白質(zhì)在目前報(bào)道出的所有二氫黃酮醇4-還原酶基因中最短的一個。通過對堿基序列和氨基酸序列分析，紅刺玫中DFR與 NADP結(jié)合位點(diǎn)“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF”是高度保守的底物結(jié)合區(qū)，結(jié)合區(qū)中的第134位氨基酸可直接影響酶的底物特異性，通過對紅刺玫DFR基因編碼的氨基酸的序列分析，結(jié)果顯示他們的部分區(qū)域很保守，這些區(qū)域可能與他們的功能發(fā)揮有重要的作用。其 DFR高度保守的底物結(jié)合區(qū)的134位是N(天冬酰胺)，所以其DFR酶的底物為DHK或者為 DHQ。催化生成花葵素-3-葡萄糖苷或者為花青素-3-葡萄糖苷，顯現(xiàn)出磚紅色或者紅色。 所以改變134位氨基酸的組成是改變紅刺玫花色的必要條件。實(shí)施本發(fā)明后的積極效果是實(shí)施本發(fā)明后為改變紅刺玫的單一花色弊端創(chuàng)造了條件，利用克隆技術(shù)能創(chuàng)造出紅刺玫新的花色，為城市更好綠化美容創(chuàng)造了條件。


圖1.花色素生化合成途徑，
圖2. DFR全長基因，
圖3. PMD-DFR重組質(zhì)粒圖
附錄1紅刺玫二氫黃酮醇4-還原酶基因
>DFRA
1ATGGCATCGGAATCCGAGTCCGTTTGCGTGACAGGCGCCTCCGGTTTCGT
51AGGTTCATGGCTCGTCATGAGACTCCTAGAGCGCGGCTACACTGTCCGAG
101CCACCGTGCGAGACCCTGCTAATTCGAAGAAGGTGAAGCATCTGCTGGAC
151TTACCAAAGGCGGCGACTCACTTGACGCTGTGGAAGGCAGACCTGGCGGA
201GGAGGGAAGCTTCGACGAAGCCATCAAGGGATGCACCGGAGTGTTCCATG
251TCGCCACTCCTATGGATTTTGAGTCCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATC
301AAACCTACTATAAATGGGGTGCTAGACATCATGAAAGCATGTCTAAAAGC
351AAAGACTGTTAGAAGGCTAGTGTTTACAGCTTCGGCTGGATCTGTCAATG
401TTGAAGAGACCCAAAAGCCGGTCTACAACGAAAGCAACTGGAGTGATGTC
451GAATTTTGCCGGAGAGTGAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTATCCAA
501AACTCTAGCTGAGCAAGAGGCATGGAAGTTTGCCAAAGAAAATAACATTG
551ATTTCATCACCATTATCCCAACTCTCGTAATCGGTCCATTTCTCATGCCT
601GCCATGCCGCCGAGCCTCATTACTGGACTTTCGCCACTCACTGGAAATGA
651AAGTCATTATTCGATCATAAAGCAAGGCCAATTCATTCATCTAGACGACC
701TCTGCCAATCTCATATATACTTGTATGAGCATCCGAAAGCAGAGGGCCGC
751TACATTTGTTCATCGCACGATGCTACGATTCATGAAATTGCGAAATTGCT
801GAGGGAAAAGTACCCCGAGTACAATGTTCCTACAACGTTCAAGGGCATTG
851AGGAGAACTTGCCAAAGGTCCATTTTTCTTCAAAGAAATTATTGGAAACA
901GGGTTCGAGTTCAAATACAGCTTGGAGGACATGTTTGTAGGAGCTGTTGA
951TGCTTGTAAAGCAAAGGGTTTGCTTCCTCCTCCTACTGAAAGAGTTGAAA
1001AGCAGGAGGTTGATGAGAGCAGTGTCGTCCGTGTCAAAGTCACAGGCTAA
>DFRB
1ATGGCATCGGAATCCGAGTCCGTTTGCGTGACAGGCGCCTCCGGTTTCGT
51AGGTTCATGGCTCATCATGAGACTCCTAGACCGCGGCTACACTGTCCGAG
101CCACCGTGCGAGACCCTGCTAATAAGAAAAAGGTGAAGCATCTGCTGGAC
151TTACCAAAGGCGGCGACTCACTTGACGCTGTGGAAGGCAGACCTGGCGGA
201GGAGGGAAGCTTCGATGAGGCCATCAAGGGATGCACCGGAGTATTCCATG
251TCGCCACTCCTATGGATTTTGAGTCCAAGGACCCTGAGAACGAAGTGATC
301AAACCTACTATAAATGGGTTGCTAGACATCATGAAAGCATGTCTAAAAGC
351AAAGACTGTTAGAAGGCTAGTGTTTACATCTTCGGCTGGAACTGTCAATG
401TTGAGGAGACCCAAAAACCGGTCTACAACGAAAGCAACTGGAGTGATGTC
451GAATTTTGCCGGAGAGTGAAGATGACTGGTTGGATGTATTTTGTATCCAA
501AACTCTAGCTGAGCAAGAGGCATGGAAGTTTGCCAAAGAAAATAACATTG
551ATTTCATCACCATTATCCCAACTCTCGTAATCGGTCCATTTCTCATGCCT
601TCCATGCCGCCGAGCCTCATTACTGGACTTTCGCCACTCACTGGAAATGA
651AGGTCATTATTCGATCATAAAGCAAGGCCAATTCATTCATCTAGACGACC
701TCTGCCAATCTCATATATACTTGTATGAGCATCCGAAAGCAGAGGGCCGC
751TACATTTGTTCATCGCACGATGCTACGATTCATGAAATTGCGAAATTGCT
801GAGGGAAAAGTACCCCGAGTACAATGTTCCTACAACGTTCAAGGGCATTG
851AGGAGAACTTGCCAAAGGTCCATTTTTCTTCAAAGAAATTATTGGAAACA
901GGGTTCGAGTTCAAATACAGCTTGGAGGACATGTTTGTAGGAGCTGTTGA
951TGCTTGTAAAGCAAAGGGTTTGCTTCCTCCTCCTACTGAAAGAGTTGAAA
1001AGCAGGAGGTTGATGAGAGCAGTGTCGTCCGTGTCAAAGTCACAGGCTAA
附錄2 紅刺玫二氫黃酮醇4-還原酶編碼的氨基酸.序列
DFRA
MASESESVCVTGASGFVGSffLVMRLLERGYTVRATVRDPANSKKVKHLLDLPKAATHLTL
WKADLAEEGSFDEAIKGCTGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTINGVLDIMKACLKAKTV
RRLVFTASAGSVNVEETQKPVYNESNWSDVEFCRRVKMTGWMYFVSKTLAEQEAffKFAKE
NNIDFITIIPTLVIGPFLMPAMPPSLITGLSPLTGNESHYSIIKQGQFIHLDDLCQSHIY
LYEHPKAEGRYICSSHDATIHEIAKLLREKYPEYNVPTTFKGIEENLPKVHFSSKKLLET
GFEFKYSLEDMFVGAVDACKAKGLLPPPTERVEKQEVDESSVVRVKVTG
DFRB
MASESESVCVTGASGFVGSffLIMRLLDRGYTVRATVRDPANKKKVKHLLDLPKAATHLTL
WKADLAEEGSFDEAIKGCTGVFHVATPMDFESKDPENEVIKPTINGLLDIMKACLKAKTV
RRLVFTSSAGTVNVEETQKPVYNESNWSDVEFCRRVKMTGWMYFVSKTLAEQEAffKFAKE
NNIDFITIIPTLVIGPFLMPSMPPSLITGLSPLTGNEGHYSIIKQGQFIHLDDLCQSHIY
LYEHPKAEGRYICSSHDATIHEIAKLLREKYPEYNVPTTFKGIEENLPKVHFSSKKLLET
GFEFKYSLEDMFVGAVDACKAKGLLPPPTERVEKQEVDESSVVRVKVTG
權(quán)利要求
1.控制紅刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶基因序列，其特征在于該基因在紅刺玫花內(nèi)存在至少兩個，均具有一個完整的基因編碼區(qū)域；該基因的核苷酸序列是附錄1所示；所編碼的蛋白質(zhì)序列是附錄2所示；其堿基序列和氨基酸序列顯示紅刺玫中DFR與NADP結(jié)合位點(diǎn)“TASAG SVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 和“TSSAG TVNVEETQKP VYNESNWSDV EF” 是高度保守的底物結(jié)合區(qū)，結(jié)合區(qū)中的第134位氨基酸直接影響酶的底物特異性；紅刺玫DFR基因編碼的氨基酸序列顯示，其DFR高度保守的底物結(jié)合區(qū)是134位是名為天冬酰胺的N，其 DFR酶的底物為DHK或者為DHQ ；催化生成花葵素_3_葡萄糖苷或者為花青素_3_葡萄糖苷，顯現(xiàn)出磚紅色或者紅色；改變134位氨基酸的組成是改變紅刺玫花色的必要條件。
2.控制紅刺玫花色的二氫黃酮醇4-還原酶基因的克隆方法，其特征在于具體的操作步驟如下1)設(shè)計(jì)兩個引物如下 RosaDFR-F :ATGGCATCGGAATCCGAGTC RosaDFR-R TTAGCCTGTGACTTTGACACG2).提取紅刺玫花苞的mRNA，RT-PCR反轉(zhuǎn)錄為cDNA；3).引物0·8μ L，dNTP (2mM) :1. 2 μ L，10*PCR KOD buffer :2 μ L，KOD-Plus :0. 5 μ L， cDNA :0. 5 μ L，滅菌雙蒸水:14. 2μ L ；4).按照下述條件進(jìn)行PCR 反應(yīng)94°C 3min，94°C 30s, 62°C 30s, 68°C lmin，30 個循環(huán)， 68°C延伸 IOmin, 10°C保存 IOmin ；5).對紅刺玫DFR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得一條約為1.01Λ特異性條帶。附錄1: >DFRA
全文摘要
控制紅刺玫花色二氫黃酮醇4-還原酶基因序列及其克隆方法，屬于基因的克隆技術(shù)及其序列分析技術(shù)領(lǐng)域，是涉及紅刺玫二氫黃酮醇4-還原酶基因的克隆方法及其編碼蛋白質(zhì)應(yīng)用技術(shù)。其要點(diǎn)是該基因在紅刺玫花內(nèi)存在至少兩個，均具有一個完整的基因編碼區(qū)域；該基因的核苷酸序列是附錄1所示；所編碼的蛋白質(zhì)序列是附錄2所示；改變134位氨基酸的組成是改變紅刺玫花色的必要條件。其克隆方法，包含以下步驟設(shè)計(jì)兩個引物，提取紅刺玫花苞，引物參與，進(jìn)行PCR反應(yīng)，對紅刺玫DFR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并瓊脂糖凝膠電泳檢測實(shí)施。本發(fā)明后的積極效果是為改變紅刺玫的單一花色弊端創(chuàng)造了條件，利用克隆技術(shù)創(chuàng)造出紅刺玫新的花色，為城市綠化美容創(chuàng)造了條件。
文檔編號C12N15/10GK102286496SQ20111018733
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月6日
發(fā)明者姜靈敏, 張冬梅, 羅玉蘭, 馬偉 申請人:上海市園林科學(xué)研究所