專利名稱：蜂王腸道酶及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及蜂王腸道酶及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
近年來，隨著人類平均壽命的增加，老年人口的比例不斷上升，我國人口老齡化日趨明顯，阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease,AD)作為老年期癡呆最常見的類型，已經(jīng)引起全社會的廣泛關(guān)注。阿爾茨海默病是一種以記憶力下降和認(rèn)知功能障礙為特征的復(fù)雜的多因素慢性進(jìn)行性精神衰退疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶和認(rèn)知能力減退、語言障礙、精神運動異常等癥狀?；颊咴缙谝越洃浵陆禐橹鳎膊『笃谶h(yuǎn)記憶也受累及，日常生活受到影響，表現(xiàn)為學(xué)習(xí)新知識困難，工作主動性下降，承擔(dān)新任務(wù)無法勝任，并隨時間推移而加重， 伴有語言障礙、計算障礙，視空間障礙，喪失日常技能，失去認(rèn)知能力等。阿爾茨海默病發(fā)病隱匿，進(jìn)行性加重，會給患者及其家人帶來巨大的痛苦，嚴(yán)重阻礙著社會經(jīng)濟的健康穩(wěn)定發(fā)展。如今，阿爾茨海默病已成為繼心臟病、腫瘤和中風(fēng)之后的第四大殺手，國際國內(nèi)針對阿爾茨海默病的治療還沒有特效藥物，且其綜合治療療程長、顯效慢。國際國內(nèi)學(xué)者對阿爾茨海默病的研究結(jié)果表明，阿爾茨海默病發(fā)病機制非常復(fù)雜，其確切病機目前尚不清楚，同大多數(shù)其他長期性疾病一樣，阿爾茨海默病是由多因素導(dǎo)致的，由此形成了多種假說。但眾多的研究證明，Αβ級聯(lián)假說是目前阿爾茨海默病發(fā)病機理的主流學(xué)說，該假說指出Aβ的過度積累是AD發(fā)病的基礎(chǔ)，而Αβ產(chǎn)生與清除的失衡是導(dǎo)致其過度累積的原因。蜂王漿(Royal Jelly,RJ)又名蜂皇漿，俗稱蜂王乳，是6-18日齡青年工蜂的下咽頭腺和上顎腺等腺體所分泌的特殊物質(zhì)。蜂王漿呈乳白色或淡黃色，半透明，微黏稠，有特殊香味，味酸、澀、辛、微甜，主要為蜂王的終身食物及工蜂幼蟲孵化后的前三天食物，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗炎、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血壓、降低血糖和促進(jìn)細(xì)胞生長等功能。研究發(fā)現(xiàn)，蜂王漿對包括阿爾茨海默病在內(nèi)的神經(jīng)性疾病有良好的改善作用，蜂王漿中的某些物質(zhì)具有提高神經(jīng)系統(tǒng)的傳遞功能、增強對大腦的營養(yǎng)功能、增加特定神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)量、促進(jìn)大腦細(xì)胞的神經(jīng)生長、促進(jìn)大腦中神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元、星狀細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞的分化，改善小鼠的認(rèn)知功能障礙，提高大鼠的學(xué)習(xí)記憶指數(shù)等作用。因此，蜂王漿能夠成為改善阿爾茨海默病等神經(jīng)性障礙疾病的發(fā)生和發(fā)展的潛在藥物來源。我國是世界上最大的蜂王漿生產(chǎn)國，產(chǎn)量占世界的90%以上，但其多以原料性的產(chǎn)品出口，缺乏深加工產(chǎn)品，從而導(dǎo)致產(chǎn)品價格較低，所獲利潤較少，因此，對蜂王漿進(jìn)行深加工，可以有效提高我國蜂王漿的品質(zhì)，增加出口創(chuàng)匯。新鮮蜂王漿含有多種生物活性物質(zhì)，但貯存不當(dāng)極易發(fā)生腐爛變質(zhì)，失去原有的生物活性和營養(yǎng)價值。研究表明，蜂王漿的變質(zhì)主要是其所含的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致一系列的化學(xué)反應(yīng)促使其變質(zhì)，因此蜂王漿中的蛋白質(zhì)對蜂王漿發(fā)揮整體功效起著極其關(guān)鍵的作用。蜂王漿中所含的蛋白質(zhì)對溫度十分敏感，在貯存過程中部分蛋白質(zhì)易發(fā)生降解， 并且在不同的溫度條件下，不同蛋白質(zhì)的降解速率不一樣。貯存溫度越高、時間越長，蜂王漿越容易發(fā)生美拉德反應(yīng)(Maillard reaction)，變性速率越快。目前有研究發(fā)現(xiàn)，在蜂王漿的保健功效中起著舉足輕重作用的水溶性蛋白質(zhì)，降解產(chǎn)物會發(fā)生聚合，從而使水不溶性蛋白增加。研究者發(fā)現(xiàn)，通過酶水解得到的蜂王漿多肽不但存儲要求降低，而且酶解后的蛋白質(zhì)具有不易變質(zhì)，更利于體內(nèi)的代謝吸收，所含成分具有更理想的藥理功能，更有助于闡明蜂王漿的作用機制。但迄今為止，對蜂王漿酶解后多肽的研究較少，且酶解的方法大多數(shù)通過胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等外源酶來進(jìn)行，不適合蜂王漿蛋白的水解，較難篩選得到對人體真正有效的生物活性多肽。

發(fā)明內(nèi)容
有鑒于此，本發(fā)明提供一種蜂王腸道酶及其制備方法。該方法通過從蜂王幼蟲體內(nèi)提取腸道，通過離心得到腸道酶。獲得的腸道酶對蜂王漿進(jìn)行酶解，能夠模擬蜂王體內(nèi)酶解環(huán)境，得到生物活性更好的蜂王漿多肽。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案本發(fā)明提供了一種蜂王腸道酶的制備方法，包括將2 3日齡的蜂王幼蟲，用 0. 9%的生理鹽水洗滌后，取出所述蜂王幼蟲的腸道，加入pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液或iTris-HCl緩沖溶液研磨成勻漿，在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第一次離心后的中層液體，然后在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第二次離心后的中層液體，得到蜂王腸道酶。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的蜂王腸道酶制備方法中，磷酸鹽緩沖液或TriS-HCl緩沖溶液的濃度為50mmol/L。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的蜂王腸道酶制備方法中，所述蜂王幼蟲的腸道與磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的質(zhì)量體積比以g/mL計為1 1 1 2。作為優(yōu)選，本發(fā)明提供的蜂王腸道酶制備方法中，離心的條件為在20000g，4°C條件下離心20min。本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的蜂王腸道酶。本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到蜂王漿多肽的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到1 3kDa的蜂王漿多肽的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了上述制備方法制得的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到3 5kDa的蜂王漿多肽的應(yīng)用。本發(fā)明提供了蜂王腸道酶對蜂王漿進(jìn)行酶解得到蜂王漿多肽的方法如下在蜂王漿中，加入pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液，在 18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，(除去不溶性成分)收集上清液，經(jīng)截留分子量為8000 14000的透析袋在pH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液中冰浴透析42 56h，(每隔1 更換一次透析液)收集透析袋中透析液，得到水溶性蜂王漿蛋白液；以mg/mL計，將腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液按照蛋白濃度比為30 35 80 90混合，在pH值為8. 3 8. 7，溫度為；34 39°C的條件下酶解22 洸h，得到水溶性蜂王漿蛋白酶解液；將水溶性蜂王漿蛋白酶解液冰浴停止酶解反應(yīng)后，在8000 15000g，4°C條件下離心10 20min，收集上清液，用10 μ m微孔濾膜過濾后，收集濾液得到第一濾液，將所述第一濾液經(jīng)3kDa的超濾膜過濾，收集濾液得到第二濾液，將所述第二濾液經(jīng)IkDa的超濾膜過濾，收集截留物得到1 3kDa的蜂王漿多肽。將所述第一濾液經(jīng)5kDa的超濾膜過濾，收集濾液得到第二濾液，將所述第二濾液經(jīng)3kDa的超濾膜過濾，收集截留物得到3 5kDa的蜂王漿多肽。作為優(yōu)選，制備方法中，勻漿或第一懸浮液的中層液體在20000g的條件下離心。作為優(yōu)選，制備方法中，勻漿或第一懸浮液的中層液體離心20min。作為優(yōu)選，制備方法中磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液與所述蜂王漿的體積比為2 1 4 1。作為優(yōu)選，制備方法中，離心為在20000g的條件下離心20min。作為優(yōu)選，制備方法中，透析時間為48h。作為優(yōu)選，以mg/mL計，制備方法中，所述腸道酶液與所述水溶性蜂王漿蛋白液的蛋白濃度比為32. 5 85。優(yōu)選地，制備方法中，所述腸道酶液的蛋白濃度為20 35mg/mL，所述水溶性蜂王漿蛋白液的蛋白濃度為25 45mg/mL，所述腸道酶液和所述水溶性蜂王漿蛋白液的質(zhì)量比為 1 2. 3 3. 0。作為優(yōu)選，制備方法中酶解溫度為37°C。作為優(yōu)選，制備方法中酶解pH值為8. 5。作為優(yōu)選，制備方法中酶解時間為Mh。作為優(yōu)選，制備方法中，離心條件為在10000g，4°C條件下離心lOmin。本發(fā)明提供一種蜂王腸道酶及其制備方法和用途。該方法通過從蜂王幼蟲體內(nèi)提取腸道，通過離心得到腸道酶。獲得的腸道酶對蜂王漿進(jìn)行酶解，能夠模擬蜂王體內(nèi)酶解環(huán)境，得到生物活性更好的蜂王漿多肽。


圖1示本發(fā)明制得的腸道酶液和水溶性蜂王漿蛋白液的SDS-PAGE電泳圖，其中， 泳道1和泳道2為腸道酶液，泳道3和泳道4為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道m(xù)arker。圖2示酶解時間對酶解效果的影響，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道2 至 9 分別為酶解時間 2h、4h、6h、8h、10h、15h、20h、25hJ}dt 10 為 marker。圖3示圖2內(nèi)泳道1至9各條帶峰面積。圖4示酶解pH值對酶解效果的影響，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道2 至 7 分別為 pH 值 5、6、6. 5、7、7. 5、8，泳道 8 為 marker。圖5示圖4內(nèi)泳道1至7各條帶峰面積。圖6示酶解液中蛋白隨pH值變化情況，其中，泳道1為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道 2為本發(fā)明提供的腸道酶液，泳道3至7為由水溶性蜂王漿蛋白液和腸道酶液分別在pH值為8、8. 1,8. 3,8. 5,8. 7的條件下酶解后酶解液，泳道8為marker。圖7示圖6內(nèi)泳道1至7各條帶峰面積。
圖8示本發(fā)明提供的腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液的最佳配比，其中，泳道1、8 均為本發(fā)明提供的腸道酶液，泳道2、9為水溶性蜂王漿蛋白液，泳道3至6分別為腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液體積比例是1 1、1 2、1 3、1 4，泳道10至13分別為腸道酶液與水溶性蜂王漿蛋白液體積比例是1 5、1 6、1 7、1 8，泳道7、14均為marker。圖9示在最佳酶解條件下，酶解反應(yīng)前后對比圖，其中，反應(yīng)體系總體積為10mL， 泳道1至8為反應(yīng)前圖譜，泳道10至17為反應(yīng)后圖譜；泳道1、10分別含0. 5mL腸道酶液與0. 5mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道2、11分別含0. 5mL腸道酶液與ImL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道3、12分別含ImL腸道酶液與ImL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道4、13分別含ImL腸道酶液與2mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道5、14分別含1. 5mL腸道酶液與1. 5mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道6、15分別含1. 5mL腸道酶液與3mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道7、16分別含 2mL腸道酶液與2mL水溶性蜂王漿蛋白液；泳道8、17分別含2mL腸道酶液與4mL水溶性蜂王漿蛋白液泳道9、18均為marker。圖10示1 3kDa的蜂王漿多肽液相分析色譜圖，其中，實線為^Onm下的色譜圖， 虛線為214nm下的色譜圖。圖11示3 5kDa的蜂王漿多肽液相分析色譜圖，其中，實線為^Onm下的色譜圖， 虛線為214nm下的色譜圖。圖12示1 3kDa的蜂王漿多肽對Aβ 2M5誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其中，圖 12(a)為 Control 組，圖 12(b)為 25ymol/L Αβ25_35 組，圖 12(c)為 25ymol/ LA β 25_35+9. 2 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 12 (d)為 25 μ mol/LA β 25_35+23 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 12 (e)為 25 μ mol/L A β 25_35+46 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 12 (f)為 25 μ mol/ LA β 25_35+92 μ g/mL蜂王漿多肽組。圖13示3 5kDa的蜂王漿多肽對Aβ 2M5誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，其中，圖 13(a)為 Control 組，圖 13(b)為 25 μ mol/L Αβ25_35 組，圖 13(c)為 25 μ mol/ L A β 25_35+13. 2 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 13 (d)為 25 μ mol/LA β 25_35+33 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 13(e)為 25 μ mol/L A β 25_35+66 μ g/mL 蜂王漿多肽組，圖 13(f)為 25 μ mol/ LA β 25_35+132 μ g/mL ^^Ι^Μ .圖14示1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用， 其中，縱坐標(biāo)為細(xì)胞活性(以control組為100% )，橫坐標(biāo)為A β 和蜂王漿多肽的添加量，第一柱形為control組，第二柱形為A β 25_35模型組，第三至第六柱形為蜂王漿多肽處理組；第二柱形和第一柱形具有極顯著差異(P < 0. 001)，第三至第六柱形與第二柱形間具有極顯著差異(P <0.01)。圖15示3 5kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的抑制作用。圖16示1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放量的影響。圖17示3 5kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞LDH釋放量的影響。圖18示Armexin V/PI雙染法檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞的影響，其中，圖18(a)為control組，圖18(b)為Αβ模型組，圖18(c)為 A β+23 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽，圖18 (d)為A β +46 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽，圖18 (e)為A β +92 μ g/mL 1 3kDa的蜂王漿多肽。圖19示Armexin V/PI雙染法檢測3 5kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞的影響，其中，圖19(a)為control組，圖19(b)為Αβ模型組，圖19(c)為 A β+33 μ g/mL 3 5kDa的蜂王漿多肽，圖19 (d)為A β +66 μ g/mL 3 5kDa的蜂王漿多肽，圖19 (e)為A β +132 μ g/mL 3 5kDa的蜂王漿多肽。圖20示Armexin V/PI雙染法檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞的影響結(jié)果總結(jié)。圖21示Armexin V/PI雙染法檢測3 5kDa的蜂王漿多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的 SH-SY5Y細(xì)胞的影響結(jié)果總結(jié)。圖22示1 3kDa的蜂王漿多肽對活性氧自由基的影響。圖23示3 5kDa的蜂王漿多肽對活性氧自由基的影響。圖對示￥68{6111 blotting檢測1 3kDa的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響。圖25示western blotting檢測3 5kDa的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax 和Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響。圖沈示1 3kDa的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl_2比值的影響，其中， 斜線柱形代表Bax/Bcl-2的值，白色柱形代表Bax的表達(dá)量，黑色柱形代表Bcl_2的表達(dá)量。圖27示3 ^Da的蜂王漿多肽對SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2比值的影響，其中， 斜線柱形代表Bax/Bcl-2的值，白色柱形代表Bax的表達(dá)量，黑色柱形代表Bcl_2的表達(dá)量。
具體實施例方式本發(fā)明公開了一種蜂王腸道酶及其制備方法和用途，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過較佳實施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。本發(fā)明提供的蜂王漿多肽中各項試劑均可由市場購得。蜂王漿和蜂王幼蟲均購自北京市門頭溝區(qū)軍莊鎮(zhèn)孟悟村養(yǎng)蜂專業(yè)戶，經(jīng)50次試驗表明，蜂王漿中蛋白含量無顯著差異，從蜂王幼蟲體內(nèi)提取的腸道酶的蛋白含量也無顯著差異。SH-SY5Y細(xì)胞(北京師范大學(xué)資源學(xué)院資源生態(tài)與中藥資源研究所細(xì)胞庫)。Prestained Protein Ladder (美國 Fermentas)，D-MEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)、 胰酶(美國R&D)、青霉素/鏈霉素(美國Gibco公司)，A β 25_35 (純度98. 4 %，杭州中肽生化有限公司)，3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(ΜΤΤ，美國Amresco公司)，Cellstar細(xì)胞培養(yǎng)板(德國Greiner公司)，乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，Armexin V-FITC凋亡檢測試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)， 2，，7，-二氯熒光素雙乙酸鹽(DCFH-DA，美國 Sigma 公司)，Polyvinylidene Fluoride Membrane (PVDF膜)(美國Roche)，小鼠抗人Bcl_2多抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、小鼠抗人β -actin多克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗小鼠IgG多克隆抗體、HRP標(biāo)記小鼠抗兔IgG多克隆抗體、ECL顯色試劑(Santa Cruz公司)，其他試劑為國產(chǎn)分析純。下面結(jié)合實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明實施例1取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 1的PH值為 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在20000 X g， 4°C下離心20min，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在20000乂8，41下離心201^11，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為31. 9mg/mL。 SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，見圖1。實施例2取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 1的PH值為 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在18000 X g， 4°C下離心30min，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在18000Xg，4°C下離心30min，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為35mg/mL。實施例3取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 2的pH 值為7. 2的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在 25000 X g，4°C下離心2%iin，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在25000Xg，4°C下離心2%iin，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為20. ^iig/mL。實施例4將1倍體積的蜂王漿與2倍體積的pH值為7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在20000Xg，4°C下離心20min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值為7的50mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析48h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為42. 7mg/mL。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，見圖1。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進(jìn)行摸索，結(jié)果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應(yīng)體系中添加4mL蛋白濃度為42. 7mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、2mL實施例1制得的蛋白濃度為31. 9mg/mL的腸道酶液和4mL緩沖液的比例關(guān)系，配制2000mL 的反應(yīng)體系。并將體系的PH值調(diào)整到8.5，37°C下經(jīng)行Mh的反應(yīng)。反應(yīng)24h后，冰浴、停止反應(yīng)。反應(yīng)液在10000Xg，4°C下離心lOmin，除去不溶性成分，得到1900mL上清液。用 10 μ m微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統(tǒng)過濾，得到200mL l-3kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經(jīng)BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為 2. 30mg/mLo實施例5將1倍體積的蜂王漿與2倍體積的pH值為7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在20000Xg，4°C下離心20min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值為7的50mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析48h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為42. 7mg/mL。SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果，見圖1。腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進(jìn)行摸索，結(jié)果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應(yīng)體系中添加4mL蛋白濃度為42. 7mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、2mL 實施例2制得的蛋白濃度為35mg/mL的腸道酶液和4mL緩沖液的比例關(guān)系，配制2000mL 的反應(yīng)體系。并將體系的PH值調(diào)整到8.5，37°C下經(jīng)行Mh的反應(yīng)。反應(yīng)24h后，冰浴、停止反應(yīng)。反應(yīng)液在10000Xg，4°C下離心lOmin，除去不溶性成分，得到1900mL上清液。用 10 μ m微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為5kDa和3kDa的膜過濾系統(tǒng)過濾，得到200mL 3 5kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后3 5kDa的蜂王漿多肽。經(jīng)BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為 3. 30mg/mL。實施例6取新鮮2 3日齡的蜂王幼蟲，用等滲的冰冷的0. 9%生理鹽水洗滌干凈后過濾， 逐個解剖并收集蟲體的全部腸道。加入與蟲體腸道的質(zhì)量體積比(g/ml)為1 1的pH值為 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液稀釋，用電動勻漿器在冰浴條件下研磨成勻漿。在18000 X g， 4°C下離心30min，離心后懸浮液分為三層，即漂浮物上層(脂類成分)、懸浮溶液中層、沉淀下層，回收中層。將中層再次在18000Xg，4°C下離心30min，取中層由此得到黃色透明的腸道酶液，保存在-20°C冰箱中。取部分腸道酶液，用BCA法檢測蛋白濃度，得腸道酶液的蛋白濃度為35mg/mL。將1倍體積的蜂王漿與4倍體積的pH = 7的50mmol/L的磷酸鹽緩沖液混合，制備蜂王漿稀釋溶液。將上述蜂王漿稀釋溶液在18000Xg，4°C下離心30min，除去不溶性成分，收集上清液。使用70mm的透析袋(截留分子量8000-14000)在pH值為7的50mmol/L 的磷酸鹽緩沖液中冰浴下透析42h，每隔1 更換一次透析液。取透析袋中液體，即為高純度的水溶性蜂王漿蛋白，保存在-20°C冰箱中。取部分水溶性蜂王漿蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度，得水溶性蜂王漿蛋白的蛋白濃度為26. 8mg/mL。
腸道酶與蜂王漿酶解條件的確定對酶解的PH值、酶解時間進(jìn)行摸索，結(jié)果見圖2 至圖9。確定最佳酶解條件為在pH值為8. 3 8. 7，溫度為34 39°C的條件下酶解22 26h。按照IOmL反應(yīng)體系中添加6mL蛋白濃度為26. 8mg/mL的水溶性蜂王漿蛋白、2mL 實施例2制得的蛋白濃度為35mg/mL的腸道酶液和2mL緩沖液的比例關(guān)系，配制2000mL 的反應(yīng)體系。并將體系的PH值調(diào)整到8.3，39°C下經(jīng)行沈11的反應(yīng)。反應(yīng)2 后，冰浴、停止反應(yīng)。反應(yīng)液在8000Xg，4°C下離心20min，除去不溶性成分，得到1860mL上清液。用 10 μ m微孔濾膜過濾，收集濾液，再依次用分子量大小為3kDa和IkDa的膜過濾系統(tǒng)過濾，得到180mL l-3kDa的濾液。將濾液冷凍干燥，再用蒸餾水溶解，0. 22 μ m的薄膜過濾，得到酶解后l_3kDa的蜂王漿多肽。經(jīng)BCA方法檢測后，得到酶解后蜂王漿蛋白多肽的蛋白濃度為 2. lOmg/mL。實施例7各取ImL實施例4至6制得的1 3kDa、3 5kDa的蜂王漿蛋白多肽旋轉(zhuǎn)揮干，用 0. 06% TFA的水溶解到lmL，12000rpm離心lOmin，取上清。梯度洗脫條件如下平衡緩沖液 (A) 0. 06% TFA，洗脫緩沖液(B) 0. 05% TFA 的乙腈；梯度0 ~ 100 % B over 6 column volumes (CV)；流速lmL/min ；進(jìn)樣體積500 μ L ；檢測波長280nm/214nm。檢測結(jié)果如圖 IOUl所示。實施例8D-MEM/F12基本培養(yǎng)基將D-MEM/F12培養(yǎng)基溶于三蒸水中，混合均勻，用NaHCO3 將培養(yǎng)基的PH值調(diào)為7. 2，經(jīng)0. 22 μ M的微孔濾膜過濾，分裝后，4°C保存。D-MEM/F12完全培養(yǎng)基在D-MEM/F12基本培養(yǎng)基中添加10%的胎牛血清，1 %的各10萬μ/L的青霉素/鏈霉素，混合均勻，4°C保存。在超凈臺上，將Img 4 0251完全溶于擬8111滅菌三蒸水，配制成1讓01/1的母液，-20°C保存，用前37°C老化72h，分裝后-20°C保存待用。SH-SY5Y細(xì)胞用含體積分?jǐn)?shù)為10%的FBS，1 %青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37°C，5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天進(jìn)行1次傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞經(jīng)行實驗。 將細(xì)胞分為3組。正常對照組完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Mh后換為無血清DMEM/F12培養(yǎng)基；ΑβΜ_35 模型組加入25 μ mol/L的Αβ 25_35 ；蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組實施例1至3制得的l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽(不同濃度)預(yù)孵育4h后，加入25μπι01/1&Αβ25_35。MTT測定細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期SH-SY5Y細(xì)胞，以3X104cellS/ml的密度， 200 μ 1/well接種到96孔培養(yǎng)板，37°C，5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組和A β 25_35模型組分別加入100 μ 1無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組加入100μ 1含實施例1至3制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽(不同濃度)的無血清DMEM/ F12培養(yǎng)基。預(yù)孵育4h后，正常對照組換加100 μ 1無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，A β 25_35模型組換加100 μ 1 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組換加100 μ 1同時含25 μ mol/L Αβ25_35和不同濃度實施例1至3制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。分別設(shè)置6個復(fù)孔。藥物作用24h后，每孔加入5mg/ ml的MTT (pH = 7. 0 PBS配制)11 μ 1，4h后，棄培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μ Ι/well，黑暗下輕輕震蕩lOmin，酶標(biāo)儀492nm和630nm下讀吸光度(OD)值。
細(xì)胞存活率(％)=(實驗組0D492_63Q-blank 組 0D492_63Q)/(control 組 0D492-63Q-blank組0D492_63Q) X100%。倒置顯微鏡觀察結(jié)果見圖12、13。MTT比色法結(jié)果見圖 14、15。由倒置顯微鏡的結(jié)果顯示control組的SH-SY5Y細(xì)胞均勻分布生長，生長良好， 胞體豐滿，透光率好，突觸明顯且伸展良好，大部分細(xì)胞呈梭形、三角形或多邊形，細(xì)胞培養(yǎng)液澄清透明。25μΜ Αβ25_35處理的24h后，SH-SY5Y細(xì)胞分布不均勻，聚集成簇生長，細(xì)胞形態(tài)不均一，胞體收縮，透光率下降，突觸減少或消失，細(xì)胞圓形化嚴(yán)重；細(xì)胞有懸浮且細(xì)胞培養(yǎng)液有渾濁現(xiàn)象。不同濃度梯度的l_3kDa的RJP處理組與25 μ M A β 25_35模型組相比， 隨著RJP濃度的逐漸增大，細(xì)胞聚集成簇的現(xiàn)象逐漸減弱，生長逐漸均勻分布，胞體逐漸飽滿，透光率逐漸增強，突觸逐漸變多變長，細(xì)胞圓形化現(xiàn)象減弱，細(xì)胞培養(yǎng)液渾濁現(xiàn)象也變?nèi)?，總體細(xì)胞狀態(tài)有明顯改善。不同濃度梯度的3_5kDa的RJP處理組與25 μ M A β 25_35模型組相比，細(xì)胞生長狀況與l_3kDa的RJP處理組相似。由MTT比色法檢測的結(jié)果顯示25 μ M A β 25_35處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后，能導(dǎo)致細(xì)胞的MTT代謝率明顯下降。說明25μΜΑβ2Μ5能顯著地降低細(xì)胞線粒體的活力，從而對細(xì)胞造成顯著地?fù)p傷，形成對細(xì)胞明顯的毒性。四種濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽與 25μΜΑβΜ_Μ共同作用24h后，都能使細(xì)胞MTT的代謝率顯著提高，與Αβ模型組差異明顯 (P < 0. 01),92 μ g/ml的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽效果最好。由此說明，隨著l_3kDa蜂王漿蛋白多肽的濃度的增加，MTT的代謝率逐漸提高，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性關(guān)系；l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽能有效抑制25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，對A β 25_35導(dǎo)致的 SH-SY5Y細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用(P < 0. 01)。25 μ M A β 25_35處理SH-SY5Y細(xì)胞Mh后，能導(dǎo)致細(xì)胞的MTT代謝率明顯下降。說明25 μ M A β 能顯著地降低細(xì)胞線粒體的活力，從而對細(xì)胞造成顯著地?fù)p傷，形成對細(xì)胞明顯的毒性。四種濃度的3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽與25 μ M A β 共同作用24h后， 也都能使細(xì)胞MTT的代謝率顯著提高，與Αβ模型組差異明顯(P < 0. 05)，132 μ g/ml的 3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽的保護(hù)效果最好。由此說明，隨著3-5kDa蜂王漿蛋白多肽的濃度的增加，MTT的代謝率逐漸提高，呈現(xiàn)顯著的濃度依賴性關(guān)系；3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽能有效抑制25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性作用，對A β 25_35導(dǎo)致的SH-SY5Y細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用(P < 0. 05)。乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase, LDH)釋放的檢測取對數(shù)生長期的 SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為3X104cells/ml,200y Ι/well接種到96孔培養(yǎng)板，37°C， 5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入 100 μ 1無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組加入100 μ 1含不同濃度實施例1 至3制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。4h后，正常對照組換加 10(^1無血清01^11/^12培養(yǎng)基^^51模型組換加10(^1 25 4 11101/1的六^51的無血清 DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組換加100 μ 1同時含25 μ mol/LA β Μ_35和不同濃度實施例1至3制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。分別設(shè)置4個復(fù)孔。藥物作用24h后吸取上清，每孔取0. 02ml立即經(jīng)行LDH濃度檢測。按照LDH試劑盒操作步驟做空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管和對照管，并分別添加相應(yīng)溶液并混勻，室溫放置3min，440nm蒸餾水調(diào)零，Icm光徑測定各管的吸光度。按照如下公式計算培養(yǎng)液中LDH活力
培養(yǎng)液中LDH活力(U/L ) = jCjftOTDCim Ι ΜΕΙ χ標(biāo)準(zhǔn)濃度(2mmol/L) X樣品測試前稀釋倍數(shù)X 1000。結(jié)果見圖16、17。由圖可知control組的細(xì)胞培養(yǎng)液中釋放的LDH量很低，兩組實驗中LDH活性分別為 22. 87 士 3. 76U/L 和 38. 17 士 6. 52U/L。25 μ M Αβ 25_35 處理 SH-SY5Y 細(xì)胞 24h 后，培養(yǎng)液中釋放的LDH量顯著增加(P < 0. 001)，說明25 μ M A β 25_35對SH-SY5Y細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷，使細(xì)胞質(zhì)中的部分LDH透過損傷的細(xì)胞膜釋放到培養(yǎng)液中。與々025_35模型組相比，三種不同濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽均能使細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放量顯著減少(P < 0. 01)，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，LDH釋放量逐漸減少，表現(xiàn)出顯著的濃度依賴性關(guān)系。與Αβ25_Μ模型組相比，本組實驗中92μ g/ml的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的釋放，抑制率在66%左右。與Αβ25_35模型組相比，三個濃度的3_5kDa的蜂王漿蛋白多肽也均能使細(xì)胞培養(yǎng)液中的LDH釋放量減少。當(dāng)蜂王漿蛋白多肽濃度> 1/50初始濃度時，差異顯著(P <0. 001),且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，也表現(xiàn)出一定的濃度依賴性關(guān)系。與A β 25_35 模型組相比，本組實驗中132 μ g/ml的3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽能最大程度地抑制LDH的釋放，抑制率在32%左右。Annexin V-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率取對數(shù)生長期的 SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8. 5X104cells/ml,2ml/well接種到6孔培養(yǎng)板，37°C，5% 的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Mh，24h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入 2ml無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組加入2ml含不同濃度實施例1至3制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。4h后，正常對照組換加2ml無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，A β 25_35模型組換加^il 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12 培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組換加2ml同時含25 μ mol/L A β 2M5和不同濃度實施例1至 3制得的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。藥物作用24h后，吸出培養(yǎng)基于EP管中保存，用不含EDTA的胰酶消化30s，后用Iml含2%血清的冷PBS輕輕吹打， 然后和上一步吸出的培養(yǎng)基混勻，4°C下lOOOr/min離心lOmin，棄上清。加入Iml含2%血清的冷PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞重懸，4°C下1000r/m離心lOmin，棄上清。重復(fù)上一步一次， 再將細(xì)胞重懸于500 μ 1稀釋好的IXbinding buffer中，轉(zhuǎn)移到流式上樣管，加入25 μ 1 Annexin V-FITC (終濃度為0. 5 μ g/ml)。常溫避光15min或4°C避光30min，加入5 μ 1碘化丙啶(Propidium iodide, PI，終濃度 0. 5-1. 0 μ g/ml)，混勻，用 FACS Calibar 流式細(xì)胞儀 (美國Becton Dickinson)，選擇激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長530nm檢測。采用Cell-Quest 數(shù)據(jù)處理軟件，獲取10000個細(xì)胞分析。結(jié)果見圖18、19，結(jié)果總結(jié)見圖20、21。由圖可知control組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率較小，只占細(xì)胞總數(shù)的 5. 32士0.98% -6. 88士0.37%。25 μ M 的 Aβ 處理 24h 后，SH-SY5Y 細(xì)胞出現(xiàn)明顯的凋亡，早期凋亡率和晚期凋亡率占細(xì)胞數(shù)的26. 39士2. 24% -36. 71 士 1. 47%，表現(xiàn)在流式圖上為第四象限和第一象限細(xì)胞數(shù)明顯增多(Ρ<0.001)。25μΜ的Αβ2Μ5與不同濃度的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h后，SH-SY5Y細(xì)胞的總體凋亡率有所下降，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率逐漸減小，呈一定的濃度依賴性關(guān)系。 當(dāng)蜂王漿蛋白多肽濃度為92μ g/ml時，早期凋亡率和晚期凋亡率從26. 39 士 2. 下降到 6. 97士 1.01% (P <0.001)，接近空白對照組的水平。由此說明，l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽對A β 25_35誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡有一定的抑制作用。25 μ M的A β 25_35與不同濃度的3_5kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h后， SH-SY5Y細(xì)胞的總體凋亡率也有所下降，且隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，早期凋亡率和晚期凋亡率也逐漸減小，呈一定的濃度依賴性關(guān)系。當(dāng)蜂王漿蛋白多肽濃度為132yg/ml 時，早期凋亡率和晚期凋亡率從36. 71 士 1.47%下降到20. M士0.60% (P < 0. 001)。由此說明，不同濃度的3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽對Αβ25_35誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有一定的抑制作用?；钚匝踝杂苫?R0Q的產(chǎn)生量用DCFH-DA探針方法測定取對數(shù)生長期的 SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8. 5X104cells/ml,2ml/well接種到6孔培養(yǎng)板，37°C，5% 的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組和A β 25_35模型組每孔分別加入2ml 無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組加入2ml含不同濃度實施例1至3制得的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。4h后，正常對照組換加2ml無血清 DMEM/F12培養(yǎng)基，A β 25_35模型組換加^il 25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基， 蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組換加2ml同時含25ymol/L A β 2M5和不同濃度實施例1至3制得的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。藥物處理24h后，吸棄舊培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基洗一遍，每孔加anl 1 1000配制的含DCFH-DA (終濃度20 μ mol/L)的無血清培養(yǎng)基，370C，5%的(X)2培養(yǎng)箱中20min，每隔5min輕輕搖晃一下。無血清培養(yǎng)基洗三遍后，胰酶消化30s，用含2%血清的PBS吹打細(xì)胞重懸。使用FACS Vantage SE流式細(xì)胞儀 (美國Becton Dickinson)，選擇激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長525nm檢測。結(jié)果見圖22、23。由圖可知，25 μ M的A β 25_35處理24h可以使SH-SY5Y細(xì)胞中的ROS顯著升高(P
<0.001)，熒光強度從6. 27士0.60升高到19. 99士0.59。25 μ M的Αβ 與不同濃度的 l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽共同處理SH-SY5Y細(xì)胞24h后，ROS的產(chǎn)生量均有下降，且隨著各自濃度的增加，ROS的產(chǎn)生量呈先降低后增加的趨勢。對于l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組，46 μ g/ml的劑量可以使ROS的產(chǎn)生量降到最低，從19. 99 士0. 59降低到14. 06 士0. 34 (P
<0. 001)。表明l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽能夠阻止A β 誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(R0Q的產(chǎn)生。劑量濃度在一定范圍內(nèi)時，隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，ROS生成量呈減小的趨勢；當(dāng)蜂王漿蛋白多肽濃度繼續(xù)增大時，ROS生成量又逐漸上升。25 μ M的Αβ 與不同濃度的3_5kDa的蜂王漿蛋白多肽共同處理SH-SY5Y細(xì)胞 24h后，ROS的產(chǎn)生量均有下降，且隨著各自濃度的增加，ROS的產(chǎn)生量呈先降低后增加的趨勢。對于3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組，66 μ g/ml的劑量可以使ROS的產(chǎn)生量降到最低，從19. 99士0. 59降低到7. 72士0. 36 (P < 0. 001)，基本恢復(fù)到control組內(nèi)ROS的產(chǎn)生水平。表明3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽能夠阻止Αβ2Μ5誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(R0Q的產(chǎn)生。劑量濃度在一定范圍內(nèi)時，隨著蜂王漿蛋白多肽濃度的增加，ROS生成量呈減小的趨勢；當(dāng)蜂王漿蛋白多肽濃度繼續(xù)增大時，ROS生成量又逐漸上升。在阻止ROS產(chǎn)生效果上，分子量為3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽要好于分子量為l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽。western blotting檢測Bcl_2和Bax的表達(dá)量選用一抗為鼠源的Bcl_2和Bax抗體，用western blotting的方法檢測SH-SY5Y不同處理組中Bcl_2和Bax的表達(dá)量。取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為8. 5 X 104cells/ml，anl/well接種到6孔培養(yǎng)板，37°C，5%的(X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后吸棄舊培養(yǎng)基，正常對照組和Αβ 模型組每孔分別加入2ml無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組加入2ml含不同濃度實施例 1至3制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。4h后，正常對照組換加 2ml無血清DMEM/F12培養(yǎng)基，A β 25_35模型組換加2ml25 μ mol/L的A β 25_35的無血清DMEM/ F12培養(yǎng)基，蜂王漿蛋白多肽保護(hù)組換加aiil同時含25ymol/L A β 和不同濃度實施例 1至3制得的l-3kDa的蜂王漿蛋白多肽的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。藥物處理24h后，冷的 PBS 洗兩遍，收取細(xì)胞，并用 lysis buffer (10% 甘油，50mM PH = BJmjTris-HCU^ β-巰基乙醇，0· 02%溴酚藍(lán)，2%或5%的SDS)在100°C下裂解lOmin，冰浴5min，vortex 混勻輕甩后，上樣或-80 0C凍存?zhèn)溆?。選用15% 的 SDS-PAGE 分離膠，10 μ 1/ 孔上樣，按 100V 20min, 160V 1. 5h 的方法電泳分離。0. 5%的脫脂奶粉封閉2h，相應(yīng)濃度的一抗4°C反應(yīng)過夜，二抗常溫下反應(yīng)1. 5h。 ECL發(fā)過檢測系統(tǒng)檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)量，UMAXl 120掃描儀掃描，ImageJ軟件定量分析。結(jié)果見圖對、25，圖26、27。由圖可知，25 μ M的A β 25_35處理24h后，SH-SY5Y細(xì)胞中Bax/Bcl_2的值顯著提高， 變?yōu)?control 組的 2. 24士0. 18 倍(P < 0. 001)，而 25 μ M 的 A β M_35 與不同濃度的 l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax/Bcl-2的值，且劑量濃度在11. 5-92 μ g/ml 之間時，隨著濃度的增加有逐漸減小的趨勢，呈一定的劑量依賴性；濃度為46 μ g/ml時，減少到最低水平，為control組的0. 65士0. 05倍(P < 0. 001)。當(dāng)濃度為92 μ g/ml時，Bax/ Bcl-2的值又有輕微增加的趨勢。25 μ M的A β 25_35處理24h后，SH-SY5Y細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)量顯著地增加，變?yōu)?control 組的 1. 69士0. 14 倍(P < 0. 001)，而 25 μ M 的 A β 與不同濃度的 l_3kDa 的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax的表達(dá)量，且劑量濃度在11. 5-92 μ g/ml之間時， 隨著濃度的增加Bax的表達(dá)量有逐漸減小的趨勢，呈一定的劑量依賴性；濃度為46 μ g/ml 時，減少到最低水平，為control組的0. 38士0. 04倍(P < 0. 001)。當(dāng)濃度為92 μ g/ml時， Bax的表達(dá)量又有輕微增加的趨勢。Bcl-2蛋白的表達(dá)量呈不規(guī)則的變化，且control組與 Αβ25_35模型組、Αβ 25_35模型組與不同濃度的l_3kDa的蜂王漿蛋白多肽處理組之間差異均不顯著(P > 0. 05)。25μΜ的與不同濃度的3_5kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低 Bax/Bcl-2的值，且劑量濃度在33-132 μ g/ml之間時，隨著濃度的增加有逐漸減小的趨勢； 濃度為66 μ g/ml時，減少到最低水平，為control組的0. 69士0. 03倍(P < 0. 001)。當(dāng)濃度為132 μ g/ml時，Bax/Bcl-2的值又有輕微增加的趨勢。25 μ M的A β 25_35處理24h后， SH-SY5Y細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)量顯著地增加(P < 0. 001)，而25 μ M的A β 25_35與不同濃度的3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用24h均能降低Bax的表達(dá)量。當(dāng)劑量濃度為33 μ g/ ml,66 μ g/ml和132 μ g/ml時，可使Bax的表達(dá)量從control組的1. 59士0. 16倍分別降低到1. 11 士0. 13倍、0.61 士0.04倍和0.45士0.05倍，呈一定的濃度依賴性關(guān)系。對于Bcl_2 蛋白的表達(dá)，25μΜ的Αβ2Μ5處理24h后，表達(dá)量升高(P < 0. 05)，但升高速率小于Bax ； 25 μ M的Αβ 與濃度依次增高的3-5kDa的蜂王漿蛋白多肽共同作用M后，Bcl-2蛋白的表達(dá)量有依次減少的趨勢，但蛋白表達(dá)量減少的速率同樣遠(yuǎn)小于Bax。表明l-3kDa、3-5kDa的的蜂王漿蛋白多肽均能夠阻止A β 誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax/Bcl-2值的升高，在某一濃度范圍內(nèi)均呈一定的濃度依賴性關(guān)系。l_3kDa的RJP 的最適濃度為46 μ g/ml,3-5kDa的RJP的最適濃度為66 μ g/ml。蜂王漿蛋白多肽使Bax/ Bcl-2值降低的原因主要為蜂王漿蛋白多肽能顯著的抑制ΑβΜ_35誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Bax 表達(dá)量的升高。l_3kDa和3_5kDa的蜂王漿蛋白多肽對細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2的表達(dá)量及Bax/ Bcl-2值的影響效果有一定的相似性。上述全部數(shù)據(jù)采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件經(jīng)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)用〒士S表示，組間比較用單因素方差分析(One-way AN0VA)檢驗，P < 0. 05時認(rèn)為差異顯著。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種蜂王腸道酶的制備方法，其特征在于，包括將2 3日齡的蜂王幼蟲腸道，加入PH值為7. 0 7. 2的磷酸鹽緩沖溶液或Tris-HCl緩沖溶液研磨成勻漿，在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第一次離心后的中層液體，然后在18000 25000g，4°C條件下離心20 30min，收集第二次離心后的中層液體，得到蜂王腸道酶。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的濃度為50mmol/L。
3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述蜂王幼蟲的腸道與磷酸鹽緩沖液或Tris-HCl緩沖溶液的質(zhì)量體積比以g/mL計為1 1 1 2。
4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，離心的條件為在20000g，4°C條件下離心 20min。
5.如權(quán)利要求1至4任一項所述的制備方法制得的蜂王腸道酶。
6.如權(quán)利要求5所述的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到蜂王漿多肽的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求5所述的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到1 3kDa的蜂王漿多肽的應(yīng)用。
8.如權(quán)利要求5所述的蜂王腸道酶在對蜂王漿進(jìn)行酶解得到3 ^Da的蜂王漿多肽的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蜂王腸道酶及其制備方法和用途。本方法通過從蜂王幼蟲體內(nèi)提取腸道酶，模擬蜂王體內(nèi)酶解環(huán)境對蜂王漿進(jìn)行酶解得到1～3kDa、3～5kDa的蜂王漿多肽，制得的蜂王漿多肽能夠用于制備Aβ抑制劑。
文檔編號C12N9/64GK102260660SQ20111018740
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者馮成強, 孫平, 李虎臣, 顏慧 申請人:北京師大科技園科技發(fā)展有限責(zé)任公司, 北京師范大學(xué)