專利名稱：一種牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重pcr檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種適用于牛乳粉中雞源摻加物的PCR擴增檢測方法。
背景技術(shù)：
牛乳粉營養(yǎng)豐富，蛋白含量高質(zhì)量優(yōu)，受到消費者的喜愛。隨著我國奶產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，國內(nèi)知名企業(yè)的競爭已將焦點集中到奶源的爭奪上。少數(shù)奶農(nóng)及一些不法商販、甚至一些“無良企業(yè)”為了謀取暴利，常常在牛乳粉中摻假使雜，不惜危害消費者身心健康，甚至生命。以前常用的摻假物有水、食鹽、芒硝、蔗糖、豆?jié){、米湯、防腐劑等。根據(jù)各種摻假物的理化性質(zhì)進行相應(yīng)的檢驗，可使摻假乳原形畢露。發(fā)展到后來則用動物(豬、牛、羊、雞等) 或植物(大豆)水解蛋白來代替乳蛋白；利用植物脂肪(大豆油、菜籽油、玉米油等)及一些廉價的動物脂肪代替乳脂肪。由于理化檢測方法存在檢測對象單一、靈敏度低、易受外源因素干擾等缺點，無法準(zhǔn)確、快速、高通量的進行區(qū)分鑒別。國標(biāo)法對蛋白質(zhì)檢測則設(shè)備復(fù)雜，操作較繁瑣，費用較高，耗時較長。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為解決奶粉中雞源成分檢測的化學(xué)方法存在靈敏度低，易受外源因素干擾等缺點，特別是目前食品中蛋白質(zhì)、脂肪的測定方法不能將不同的動物來源區(qū)分開來的問題，進而提供一種適用于奶粉中的雞源摻加物的PCR檢測方法。本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的方案是一種牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，首先對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取，然后采用牛特異性引物和雞特異性引物對提取的基因組DNA進行PCR擴增，同時對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對雞源DNA進行PCR擴增做為陽性對照組，然后對所有擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析；最后根據(jù)被測產(chǎn)品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定產(chǎn)品中是否添加了雞源摻加物。牛特異性引物1和雞特異性引物2具有的核苷酸序列為引物 1-1 5' -CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3'；引物 1-2 5' -AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3 ‘；引物 2-1 5' -AGCTAGAGAGAGGGGACACCCT-3‘；引物 2-2 5' -GGATTAGAGGGATTCCTAGT-3‘。PCR反應(yīng)所用試劑還包括Taq酶、dNTPUOX緩沖液、MgCl2和滅菌水。所述的PCR引物濃度為0. 1-0. 4 μ mol/L，最佳濃度為0. 21 μ mol/L。所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性92 96°C 3 8min ；變性92 96°C 20 40s， 退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共；35循環(huán)，最后延伸72后3 lOmin。所述PCR反應(yīng)循環(huán)最佳條件為預(yù)變性94°C 4min ；變性94°C 30s，退火56°C 30s,延伸72°C 60s， 共；35個循環(huán)，最后延伸72°C 7min。
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進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%，最佳質(zhì)量濃度為1.7%。本發(fā)明采用分子生物學(xué)中的單一和雙重PCR技術(shù)，可以快速、準(zhǔn)確、靈敏地從基因角度對奶粉中雞源成分的摻入情況進行定性和半定量分析，為市場監(jiān)督部門和檢驗檢疫部門提供技術(shù)保障。此方法操作簡單，費用低，耗時短，特異性好，靈敏度高，重復(fù)性好，能檢測到奶粉中摻入的雞源成分低至0. 1%，適于推廣應(yīng)用。
具體實施例方式下面詳細闡述本發(fā)明優(yōu)選的實施例。實施例一本實施例所述檢測方法依次包括以下步驟a.對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取，S卩，提取產(chǎn)品基因組的DNA。產(chǎn)品的DNA提取方法可以是本申請人于2011年4月1日申請的、申請?zhí)枮?201110081615. 8、名稱為“一種大豆分離蛋白基因組DNA的提取方法”中所闡述的方法，區(qū)別只在于用本發(fā)明所述的牛乳粉替換上述申請中的大豆分離蛋白。申請人在此將該方法闡述如下首先，將預(yù)先加入了已知量雞肉粉(添加量后面闡述)的待測奶粉與TE緩沖液 (濃度不限)充分混合制成TE混合液(混合比例無需限定)，所述TE緩沖液也可以用水代替；然后，加入液體二倍體積的異硫氰酸胍裂解液，充分混勻，室溫裂解，裂解時間為 20 60min。所述異硫氰酸胍裂解液中含50 IOOmM pH 6. 0 8. OTris-HCl ；10 IOOmM pH 8. 0 EDTA ；5M 異硫氰酸胍；體積含量 1. 3% TritonX-IOO0第三步采用酚、氯仿/異戊醇抽提蛋白，所述的酚、氯仿/異戊醇的體積比例為 25 24 1，所述的氯仿/異戊醇的體積比例為M 1。第四步采用異丙醇沉淀DNA，沉淀溫度為-20 30°C，沉淀時間為20 60min。第五步乙醇洗滌，使用的乙醇體積濃度為70 95 % ；第六步室溫晾干，晾干的時間為10 15min。第七步將第六步所得產(chǎn)品完全溶解于TE緩沖液(濃度不限)或滅菌水中，即得到基因組DNA的TE溶液，4°C或_20°C保存?zhèn)溆谩.對前述過程得到基因組DNA的TE溶液(即模板DNA溶液)進行PCR擴增，同時對牛源DNA和雞源DNA進行PCR擴增。PCR擴增所用試劑包括Taq酶、dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸)、10 X緩沖液、MgCl2、 滅菌水、引物和模板DNA。本實施例為雙重PCR反應(yīng)體系，控制的工藝參數(shù)為
權(quán)利要求
1.一種牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，首先對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取，然后采用牛特異性引物和雞特異性引物對提取的基因組DNA進行 PCR擴增，同時對牛源DNA進行PCR擴增做為陰性對照組，對雞源DNA進行PCR擴增做為陽性對照組，然后對所有擴增產(chǎn)物分別進行瓊脂糖凝膠電泳分析；最后根據(jù)被測產(chǎn)品孔出現(xiàn)的電泳帶與陽性對照組和陰性對照組進行比對，即可判定產(chǎn)品中是否添加了雞源摻加物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，牛特異性引物1和雞特異性引物2具有的核苷酸序列為引物 1 -1 5' -CTAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAA-3 ‘；引物 1-2 5' -AAATAGGGTTAGATGCACTGAATCTAT-3 ‘；引物 2-1 5' -AGCTAGAGAGAGGGGACACCCT-3 ‘；引物 2-2 5' -GGATTAGAGGGATTCCTAGT-3 ‘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，PCR反應(yīng)所用試劑還包括Taq酶、dNTPUOX緩沖液、MgCl2和滅菌水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述的PCR引物濃度為0. 1-0. 4μ mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述的PCR引物濃度為0.2 μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性92 96 °C 3 8min ；變性92 96 °C 20 40s，退火52 60°C 20 40s，延伸72°C 30 120s，共；35個循環(huán)，最后延伸72°C 3 lOmin。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，所述PCR反應(yīng)循環(huán)條件為預(yù)變性94°C 4min ；變性94°C 30s,退火30s,延伸 72°C 60s，共；35個循環(huán)，最后延伸72°C 7min。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 5 2. 0%。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，其特征在于，進行瓊脂糖凝膠電泳分析采用的瓊脂糖凝膠的質(zhì)量濃度為1. 7%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種牛乳粉中雞源摻加物的一重/雙重PCR檢測方法，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。所用試劑包括Taq酶、dNTP(脫氧核糖核苷三磷酸)、10×緩沖液、MgCl2、滅菌水、引物和模板DNA。按照如下步驟進行檢測對待測產(chǎn)品的DNA模板進行提取、PCR擴增及對擴增產(chǎn)物進行分析，從而判定是否有雞源摻加物，該方法的檢出限為0.1％。本發(fā)明提供的方法可快速、準(zhǔn)確地檢測出被檢樣品中的雞源摻加物，以有效解決乳品企業(yè)現(xiàn)有的摻假檢測漏洞，為實現(xiàn)從分子水平對牛乳粉質(zhì)量的控制提供研究基礎(chǔ)。本方法成本低、敏感性高、操作簡便、耗時短，適用于食品質(zhì)量和安全檢測領(lǐng)域。
文檔編號C12Q1/68GK102367470SQ20111018914
公開日2012年3月7日 申請日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月7日
發(fā)明者仇麗亞, 徐偉麗, 李啟明, 汪家琦, 馬鶯 申請人:哈爾濱工業(yè)大學(xué)