專利名稱：玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌hp-orf53-55的構(gòu)建方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌 HP-0RF53-55的構(gòu)建方法及其在生產(chǎn)達(dá)托霉素中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
達(dá)托霉素是一種鈣離子依賴型的抗生素，在鈣離子存在的條件下，達(dá)托霉素將以非共價(jià)鍵的形式結(jié)合到細(xì)胞膜蛋白上，細(xì)胞膜上的達(dá)托霉素結(jié)合蛋白(DBPs)為其作用靶位，達(dá)托霉素可擾亂細(xì)胞膜對(duì)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，從而阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖的磷壁酸脂質(zhì) (LTA)的生物合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜的性質(zhì)；另外，它還能通過(guò)破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，使其內(nèi)容物外泄而達(dá)到殺滅細(xì)菌的目的。也有報(bào)道是其與細(xì)胞膜的結(jié)合，導(dǎo)致膜電位的降低，從而破壞胞內(nèi)RNA和DNA的合成，最終抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。達(dá)托霉素由于獨(dú)特的結(jié)構(gòu)特征和作用機(jī)理， 對(duì)于耐藥菌，如耐萬(wàn)古霉素的腸球菌(VRE)，耐甲氧西林的金葡菌(MRSA)，糖肽類敏感的金葡菌(GISA)，凝固酶陰性的葡萄球菌(CNQ和耐青霉素的肺炎鏈球菌(PRSP)的感染具顯著的治療效果。是繼萬(wàn)古霉素之后一種新型的抗生素，在治療皮膚感染和心膜炎方面有著顯著的療效。2003年和2006年達(dá)托霉素(Daptomycin，LY14603》先后被美國(guó)FDA和了歐洲藥品評(píng)價(jià)署(EMEA)的認(rèn)證和批準(zhǔn)上市。盡管國(guó)內(nèi)已經(jīng)有生產(chǎn)達(dá)托霉素的菌種，以初步實(shí)現(xiàn)中試生產(chǎn)，但是菌種原始，達(dá)托霉素的產(chǎn)量低，生產(chǎn)成本很高，因此通過(guò)基因工程技術(shù)選育高產(chǎn)優(yōu)良菌株，進(jìn)一步提高達(dá)托霉素的產(chǎn)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種達(dá)托霉素的基因工程菌HP-0RF53-55的構(gòu)建方法，與出發(fā)菌株相比實(shí)例菌株的達(dá)托霉素產(chǎn)量的到了顯著提高。ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是縮寫(xiě)名詞)，利用水解ATP獲得能量來(lái)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)多種底物和脂類、留醇、抗生素等次級(jí)代謝產(chǎn)物，廣泛分布于抗生素合成基因簇中，對(duì)于抗生素的分泌，自抗性和抗生素合成調(diào)控有著重要作用。ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在鏈霉菌的形態(tài)分化和抗生素合成中有著重要的作用，敲除相應(yīng)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白后，會(huì)大大降低抗生素的分泌效率，造成抗生素在細(xì)胞內(nèi)的積累，使細(xì)胞對(duì)自產(chǎn)抗生素的耐受性降低，對(duì)抗生素的合成造成嚴(yán)重的產(chǎn)物抑制作用。達(dá)托霉素由非核糖體蛋白合成酶(NRPQ指導(dǎo)合成的大環(huán)內(nèi)酯類脂肽抗生素，分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜(分子量高達(dá)1620. 6Da)，合成基因簇中包含64個(gè)0RF，合成機(jī)理復(fù)雜，調(diào)控機(jī)制嚴(yán)格。位于NRPS基因下游的0RF53，ORFM和0RF55，分別被預(yù)測(cè)為ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的周質(zhì)成分和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白透性酶。這三個(gè)基因編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因最臨近 NRPS基因，因此0RF53，0RFM和0RF55編碼的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)達(dá)托霉素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和合成調(diào)控起著重要的作用。過(guò)表達(dá)0RF53，0RFM和0RF55，可促進(jìn)達(dá)托霉素的分泌效率提高，降低達(dá)托霉素在細(xì)胞內(nèi)的積累，減小對(duì)自身細(xì)胞的毒害，降低達(dá)托霉素合成的產(chǎn)物抑制作用。 從而可以使達(dá)托霉素的產(chǎn)量有顯著的提高。
本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的達(dá)托霉素基因工程菌的構(gòu)建方法，利用PCR擴(kuò)增基因0RF53，ORFM和0RF55 (這三個(gè)基因在基因組上是連續(xù)，作為整體克隆表達(dá))。將基因片段連接到過(guò)表達(dá)載體，然后利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化玫瑰孢鏈霉菌，通過(guò)抗生素抗性篩選獲得目的基因工程菌。所述表達(dá)載體為整合型載體。所述表達(dá)載體中NRPS附屬基因的啟動(dòng)子為ermE* ； 表述載體的出發(fā)載體為PIB139。達(dá)托霉素基因工程菌的構(gòu)建方法，步驟如下(1)設(shè)計(jì) PCR 引物擴(kuò)增基因 0RF53，0RF54 和 0RF55 ；(2)將克隆得到的目的基因插入PIB139的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*下游多克隆位占.
^ \\\ (3)然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567中，以備結(jié)合轉(zhuǎn)移之用；(4)將大腸桿菌ET12567與玫瑰孢鏈霉菌在MS培養(yǎng)基上37°C共培養(yǎng)20小時(shí)，然后用含有萘啶酮酸(25yg/ml)和安普霉素(50yg/ml)的無(wú)菌水將平板覆蓋，再在30°C培養(yǎng)48小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子。(5)提取篩選的轉(zhuǎn)化子的基因組，用PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子達(dá)托霉素基因工程菌的應(yīng)用，其特征是(1)在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Sti^ptomyces roseosporus基因工程菌 HP-0RF53-55的斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液；(2)取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 300C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時(shí)，制備種子液；(3)以 4%的接種量，接種到7. 5L自動(dòng)發(fā)酵罐中，在發(fā)酵培養(yǎng)中30°C培養(yǎng)， 在0 30h,控制pH 6. 5，溶氧45 % ；在30h 144h，控制pH 7.0,通氣量控制0. 8v/v/m, 30h時(shí)以0. 10mL/h的速度開(kāi)始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在開(kāi)始補(bǔ)加甘油， 流速為0. 25mL/L · h，發(fā)酵144小時(shí)；(4)通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的達(dá)托霉素濃度。所述的培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為種子液體培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g，酵母浸粉 0. 5g, K2HP04 · 3H20 0. 05g, MgS04 · 7H20 0. 05，CaC03 0. 02g，溶解到 IL 蒸餾水中，初始 ρΗ7· 0。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖1. Og/L，糊精3g/L，干酪素1. 0g/L, 花生餅粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2S04 0. 6g/L，初始 pH 7. 0o本發(fā)明的達(dá)托霉素基因工程菌，為玫瑰孢鏈霉菌(Str印tomyces roseosporus) HP-0RF53-55,已經(jīng)于2010年8月23日，在北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心進(jìn)行了保藏，保藏編號(hào)分別為CGMCC No. 4097。本發(fā)明的效果和作用是本發(fā)明提供了能提高達(dá)托霉素產(chǎn)量的基因工程菌的構(gòu)建方法。屬于基因重組技術(shù)。該方法包括以下過(guò)程克隆達(dá)托霉素合成基因簇中非核糖體蛋白合成酶(NRPQ下游的 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因0RF53，0RF54和0RF55 (如圖1)，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567中，將ET12567與玫瑰孢鏈霉菌共培養(yǎng)，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化玫瑰孢鏈霉菌，然后通過(guò)安普霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，通過(guò) PCR進(jìn)一步確認(rèn)。本發(fā)明構(gòu)建的玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌可直接用于達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)，可提高產(chǎn)量25%，并可有利于降低分離純化難度和提高收率，從而顯著降低達(dá)托霉素生產(chǎn)成本。


圖1 達(dá)托霉素結(jié)構(gòu)及非核糖體蛋白合成酶(NRPQ基因簇示意圖；圖2 過(guò)表達(dá)重組載體構(gòu)建流程。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1基因工程菌HP-0RF53-55 的構(gòu)建(CGMCC 4097)設(shè)計(jì)引物PCR克隆0RF53-55。(上下游引物分別為上引GAAGGAAACATATGGTGCTCGGCT (下戈Ij 線為NdeI酶切位點(diǎn))；下弓丨 GTACAATCTAGATCACTTGACGCTCCCTG (下劃線為XbaI酶切位點(diǎn))。將PCR產(chǎn)物和表達(dá)載體 PIB139分別用Ndel/Xbal雙酶切，回收后，將0RF53-55和pIB139以3 1 1 1的比例用T4連接酶在16°C連接2小時(shí)構(gòu)建重組表達(dá)載體pAB139(如圖2)，然后用熱激法導(dǎo)入 ET12567大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，在LB培養(yǎng)基活化培養(yǎng)一小時(shí)后涂到安普霉素篩選平板。然后挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒嚴(yán)證。然后用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法將重組表達(dá)載體PAB139導(dǎo)入玫瑰孢鏈霉菌。具體步驟如下(1)將ET12567單克隆挑進(jìn)IOml含50 μ g/ml氯霉素，50μ g/ml卡那霉素，50 μ g/
ml的安普霉素過(guò)夜培養(yǎng)(2)取Iml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液接種到50ml含氯霉素，卡那霉素，安普霉素各50mg/ml 的培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)到OD值達(dá)到0. 5-0. 8 ；(3)用等體積的不含抗生素的LB培養(yǎng)基清洗2次，重懸于0. 1體積的LB培養(yǎng)基中；(4)在洗大腸桿菌的同時(shí)，加大概108個(gè)鏈霉菌的孢子于500 μ 1的2ΧΥΤ培養(yǎng)基中，50°C下熱擊10分鐘，然后37°C活化2小時(shí)；(5)加500 μ 1大腸桿菌細(xì)胞于0. 5ml的熱擊過(guò)的孢子或菌絲體中，快速混合，離
心。扔掉大部分上清液，重懸細(xì)胞；(6)將混合細(xì)胞涂布于含0. 01mol/LMgC12的MS瓊脂培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)16_20h， 在涂布之前將MS板于超凈風(fēng)中吹lh，有利于吸掉下一步涂布的水；(7)用含0. 5mg的萘啶酮酸和Img安普霉素的水覆蓋；(8)挑選轉(zhuǎn)化子于選擇性高氏一號(hào)培養(yǎng)基上(含有50 μ g/ml安普霉素和25 μ g/ ml的萘啶酮酸)。(9)結(jié)合轉(zhuǎn)移菌株的篩選結(jié)合轉(zhuǎn)移LB平板上生長(zhǎng)2天后，得到了結(jié)合轉(zhuǎn)化子， 接菌到含50ug/ml的安普霉素和萘啶酮酸的高氏一號(hào)選擇培養(yǎng)基上，基本確認(rèn)為接合轉(zhuǎn)移株，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證，準(zhǔn)備接種到液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，提取基因組，利用與載體PIB139多克隆位點(diǎn)兩側(cè)序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證。所用的測(cè)序引物序列上引TTGCGCCCGATGCTAGTCG ；下弓丨 GCACGACAGGTTTCCCGACTG最后將篩選獲得的0RF53-55過(guò)表達(dá)基因工程菌命名為HP-0RF53-55。發(fā)酵應(yīng)用在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌S. roseosporus HP-0RF53-55的斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液；然后取0. 5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中， 30°C，180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時(shí)；然后以1 % 4%的接種量，接種到7. 5L自動(dòng)發(fā)酵罐中；然后，30°C，在0 30h，控制pH 6. 5，溶氧45% ；30h 144h，控制pH 7.0，通氣量控制0. 8v/v/m, 30h時(shí)以0. 10mL/h的速度開(kāi)始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在
開(kāi)始補(bǔ)加甘油，流速為0. 25mL/L *h，發(fā)酵144小時(shí)。通過(guò)HPLC監(jiān)測(cè)發(fā)酵液中的達(dá)托霉素濃度。達(dá)托霉素發(fā)酵產(chǎn)量達(dá)到698mg/L，比出發(fā)菌株提高了 25%。
權(quán)利要求
1.達(dá)托霉素基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征是利用PCR擴(kuò)增NPRS下游ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因0RF53，0RFM和0RF55，將基因片段連接到過(guò)表達(dá)載體，然后利用結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化玫瑰孢鏈霉菌，通過(guò)抗生素抗性篩選獲得目的基因工程菌。
2.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是所述表達(dá)載體為整合型質(zhì)粒載體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的構(gòu)建方法，其特征是所述表達(dá)載體中啟動(dòng)子為ermE*；表述載體的出發(fā)載體為PIB139。
4.如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征是步驟如下(1)設(shè)計(jì)PCR引物擴(kuò)增NPRS下游ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因0RF53，0RF54和0RF55；(2)將克隆得到的目的基因插入PIB139的組成型強(qiáng)啟動(dòng)子ermE*下游多克隆位點(diǎn)；(3)然后將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567中，以備結(jié)合轉(zhuǎn)移之用；(4)將大腸桿菌ET12567與玫瑰孢鏈霉菌在MS培養(yǎng)基上37°C共培養(yǎng)20小時(shí)，然后用含有萘啶酮酸(25μ g/ml)和安普霉素(50μ g/ml)的無(wú)菌水將平板覆蓋，再在30°C培養(yǎng)48 小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子；(5)提取篩選的轉(zhuǎn)化子的基因組，用PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。
5.達(dá)托霉素基因工程菌的應(yīng)用，其特征是(1)在室溫下取玫瑰孢鏈霉菌Mi^ptomycesroseosporus基因工程菌HP-0RF53-55的斜面孢子用無(wú)菌水制成孢子懸液；(2)取0.5毫升孢子懸液接種到裝有30毫升種子培養(yǎng)基的250毫升的搖瓶中，30°C， 180 220rpm搖床中培養(yǎng)48小時(shí)，制備種子液；(3)以1% 4%的接種量，接種到7. 5L自動(dòng)發(fā)酵罐中，在發(fā)酵培養(yǎng)中30°C培養(yǎng)，在0 30h，控制pH 6. 5，溶氧45% ；在30h 144h，控制pH 7. 0，通氣量控制0. 8v/v/m，30h時(shí)以 0. 10mL/h的速度開(kāi)始流加1 1的癸酸和油酸甲酯溶液，并在開(kāi)始補(bǔ)加甘油，流速為 0. 25mL/L · h，發(fā)酵 144 小時(shí)；(4)通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)酵液中的達(dá)托霉素濃度。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述的培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為種子液體培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為糊精lg，葡萄糖0. 5g，蛋白胨0. 5g，酵母浸粉0.5g，K2HPO4 · 3H20 0. 05g，MgSO4 · 7H20 0. 05，CaCO3 0. 02g，溶解到 IL 蒸餾水中，初始 pH 7. 0。
7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征是所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成及質(zhì)量含量為葡萄糖1.Og/L,糊精 3g/L，干酪素 1. 0g/L，花生餅粉 0. 6g/L，L-天冬素 0. 12g/L，K2SO4 0. 6g/L，初始 pH 7. 0。
8.達(dá)托霉素基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為玫瑰孢鏈霉菌(Sti^ptomyces roseosporus)HP-0RF53-55,保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理中心，保藏編號(hào)分別為CGMCC No.4097。
全文摘要
本發(fā)明提供了玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，克隆達(dá)托霉素合成基因簇中非核糖體蛋白合成酶(NRPS)基因下游編碼ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三個(gè)關(guān)鍵基因ORF53-55，利用大腸桿菌-鏈霉菌穿梭質(zhì)粒表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌ET12567中，將ET12567與玫瑰孢鏈霉菌共培養(yǎng)，通過(guò)結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)化玫瑰孢鏈霉菌，然后通過(guò)安普霉素抗性篩選轉(zhuǎn)化子，通過(guò)PCR對(duì)基因工程菌進(jìn)一步驗(yàn)證。本發(fā)明構(gòu)建的玫瑰孢鏈霉菌基因工程菌可直接用于達(dá)托霉素的工業(yè)化生產(chǎn)，可提高產(chǎn)量降低成本。
文檔編號(hào)C12R1/465GK102260700SQ201110190188
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月24日
發(fā)明者宇光海, 賈曉強(qiáng), 聞建平 申請(qǐng)人:天津大學(xué)