專(zhuān)利名稱(chēng)：一種提高牛腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及畜牧學(xué)(動(dòng)物繁殖)，尤其涉及一種提高牛腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
牛卵巢上有數(shù)萬(wàn)個(gè)原始卵泡，在其生長(zhǎng)成熟過(guò)程中，有相當(dāng)數(shù)量的卵泡退化、閉鎖，僅有極少數(shù)的卵泡發(fā)育到成熟階段，直至排卵。在雌性生殖資源中，卵母細(xì)胞是體外受精、胚胎移植、性別控制、胚胎分割、動(dòng)物克隆和轉(zhuǎn)基因等胚胎生物技術(shù)研究和開(kāi)發(fā)必不可少的材料，卵母細(xì)胞來(lái)源匱乏成為制約這些技術(shù)研究進(jìn)展的主要因素，因此卵巢腔前卵泡的開(kāi)發(fā)無(wú)疑是解決這一難題的有效途徑。與普通的體細(xì)胞培養(yǎng)和來(lái)自有腔階段的卵泡卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng)比較，哺乳動(dòng)物腔前卵泡的體外培養(yǎng)難度更大。盡管如此，1989年Eppig等用兩步法體外培養(yǎng)小鼠腔前卵泡，獲得成熟卵母細(xì)胞并成功產(chǎn)下正常后代，自此人們先后在其它動(dòng)物上開(kāi)始了腔前卵泡體外培養(yǎng)的研究。特別是在牛、羊、豬等家畜方面研究較多，并且在研究?jī)?nèi)容、手段和方法上都取得了一些進(jìn)展。但是到目前為止，仍未建立起一套牛腔前卵泡體外培養(yǎng)的體系。因此，進(jìn)一步優(yōu)化和建立牛腔前卵泡體外培養(yǎng)體系顯得尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種制備促進(jìn)離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、次黃嘌呤、血清、促卵泡素、促黃體素、雌激素、PTEN抑制劑、水和α-MEM培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)基，所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml，所述轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml，所述亞硒酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ng/ml ；所述丙酮酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為(0.21-0.29)mmol/l，所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)基中的濃度為 (1.5-2.0)mmOl/l，所述次黃嘌呤在所述培養(yǎng)基中的濃度為(1. 8_2. Qmmol/l，所述血清在所述培養(yǎng)基中的濃度為5% -10% (體積百分含量)，所述促卵泡素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 25μ g · Hir1-O. 5μ g · ml—1，所述促黃體素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5IU ml^-lOIU πιΓ1，所述雌激素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 5μ g ^mr1-L 0μ g ^mr1,所述PTEN抑制劑在所述培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L-lO μ mol/L,所述α -MEM培養(yǎng)基在所述培養(yǎng)基中的濃度為 10. lg/L。所述丙酮酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 21mmol/l、0. 23mmol/l或0. 29mmol/ 1 ；所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)基中的濃度為1. 5mmol/lU. 8mmol/l或2. Ommol/1，所述次黃嘌呤在所述培養(yǎng)基中的濃度為1. 8mmol/l,2mmol/l或2. 5mmol/l，所述血清在所述培養(yǎng)基中的濃度為5%、7.5%或10% (體積百分含量)，所述促卵泡素在所述培養(yǎng)基中的濃度為 0. 25μ g · mr\0.4yg · πιΓ1或0. 5 μ g · πιΓ1，所述促黃體素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5IUmr\8IU ml—1或IOIU ml—1，所述雌激素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 5 μ g ·πιΓ\θ.8μδ -πιΓ1 或1. 0 μ g · πιΓ1，所述PTEN抑制劑在所述培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L、1 μ mol/L或 10 μ mol/Lo所述血清為胎牛血清；所述雌激素為雌激素E2 ；所述PTEN抑制劑為PTEN抑制劑pic。所述哺乳動(dòng)物為牛。所述的方法制備的培養(yǎng)基也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。所述的培養(yǎng)基在促進(jìn)離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育中的應(yīng)用。所述哺乳動(dòng)物為牛。所述離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育通過(guò)增加卵泡直徑和/或提高卵泡成腔率體現(xiàn)。所述α -MEM培養(yǎng)基可商購(gòu)，也可按照如下方法制備200. 00mg/L氯化鈣(無(wú)水)、 400. 00mg/L 氯化鉀、98. 00mg/L 氯化鎂(無(wú)水)、6，800. 00mg/L 氯化鈉、140. 00mg/L 一水合磷酸氫二鈉、1，000. 00mg/L D-葡萄糖、0. 20mg/L 硫辛酸、10. 00mg/L 酚紅、110. 00mg/L 丙酮酸鈉、25. 00mg/L L-丙氨酸；127. 00mg/L L-精氨酸鹽酸鹽、50. 00mg/LL-天冬氨酸一水合物、30.00mg/L L-天冬氨酸、31.00mg/L L-胱氨酸二鹽酸鹽、100. 00mg/L L-半胱氨酸鹽酸鹽一水合物、75. 00mg/L L-谷氨酸、292. 00mg/L L-谷氨酰胺、50. 00mg/L L-甘氨酸、42. 00mg/L L-組氨酸鹽酸鹽一水合物、52. 00mg/L L-異亮氨酸、52. 00mg/L L-亮氨酸、 73. 00mg/L L-賴(lài)氨酸鹽酸鹽、15. 00mg/L L-甲硫氨酸、32. 00mg/LL-苯丙氨酸、40. 00mg/L L-脯氨酸、25. 00mg/L L-絲氨酸、48. 00mg/L L-蘇氨酸、10. 00mg/L L-色氨酸、52. OOmg/ L L-酪氨酸(二鈉鹽),46. 00mg/L L-纈氨酸、50. 00mg/L L-抗壞血酸、0. 10mg/L生物素、 1. 00mg/L泛酸鈣、1. 00mg/L氯化膽堿、1. 00mg/L葉酸、2. 00mg/L內(nèi)消旋肌醇、1. 00mg/L煙酰胺、1. 00mg/L鹽酸吡哆醛、0. 10mg/L核黃素、1. 00mg/L鹽酸硫胺、1. 40mg/L維生素B12和水混合，得到培養(yǎng)基。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種體外培養(yǎng)獲得有腔卵泡的方法的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡在所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到有腔卵泡。所述培養(yǎng)的溫度為39°C，所述培養(yǎng)在5% CO2條件下進(jìn)行，所述培養(yǎng)的時(shí)間為21天。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明首先從卵巢皮質(zhì)分離牛腔前卵泡，隨后將獲取的卵泡在本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其直徑增長(zhǎng)以及卵泡的成腔率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成腔率和直徑增長(zhǎng)值均高于對(duì)照，為進(jìn)一步挖掘雌性生殖資源提供必要的培養(yǎng)體系。通過(guò)本發(fā)明，可為研究牛早期腔前卵泡發(fā)育的研究人員提供一套完整有效地體外培養(yǎng)體系，為進(jìn)一步研究其卵母細(xì)胞體外成熟機(jī)制奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明簡(jiǎn)捷、高效、便于推廣。


圖1為不同濃度的pic對(duì)牛腔前卵泡成腔率的影響
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、新的培養(yǎng)體系的獲得1、腔前卵泡的獲取將屠宰場(chǎng)獲取的離體牛卵巢置于60mm直徑的玻璃平皿中，去除多余系膜和黃體，隨后將卵巢沿著卵巢門(mén)一切為二，去除髓質(zhì)，在培養(yǎng)基(M199培養(yǎng)基， GIBC0，貨號(hào)31100-035)中清洗2次后，用刀具按照橫向和縱向兩個(gè)方向從卵巢皮質(zhì)部劃取卵泡，將獲取的卵泡和培養(yǎng)基用滴管吹打，然后用直徑Imm的吸管吹打80 100次，經(jīng) 200 μ m網(wǎng)篩過(guò)濾，再用直徑0. 5mm吸管吹打80-100次，用100 μ m網(wǎng)篩過(guò)濾，以1500r/min 離心5min，除去上清液，其沉淀加入分離液稀釋?xiě)腋?，體視顯微鏡下鏡檢卵泡、計(jì)數(shù)并測(cè)量直徑；結(jié)果為卵泡數(shù)為每個(gè)卵巢120-140枚腔前卵泡，卵泡直徑為60_80um。2、腔前卵泡體外培養(yǎng)體系的建立1)培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基1 將ITS(ITS固體規(guī)格為25mg胰島素、25mg轉(zhuǎn)鐵蛋白、25ug亞硒酸鈉， 購(gòu)自Sigma，貨號(hào)11884 ；使用時(shí)用水稀釋到終濃度為5ug/ml胰島素、終濃度5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度5ng/ml亞硒酸鈉)、丙酮酸鈉(Sigma，貨號(hào):P4562)、谷氨酰胺(Sigma，貨號(hào) G3126)、次黃嘌呤(Sigma，貨號(hào):H9636)、胎牛血清(GIBC0，貨號(hào):16000)、促卵泡素(FSH， Sigma，貨號(hào):F2293)、促黃體素(LH，Sigma，貨號(hào):L9773)、雌激素 E2 (Sigma，E2257)、PTEN抑制劑Pic (抑癌基因PTEN的抑制劑，ALEXIS, L22757)、水和α -MEM培養(yǎng)基(GIBC0,12000) 混合，得到培養(yǎng)基，胰島素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml，轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml，亞硒酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ng/ml ；丙酮酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 23mmol/l，谷氨酰胺在所述培養(yǎng)基中的濃度為1. 5mmol/l，次黃嘌呤在所述培養(yǎng)基中的濃度為2mmol/l，胎牛血清在所述培養(yǎng)基中的濃度為7. 5% (體積百分含量)，促卵泡素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 25 μ g ^r1,促黃體素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5IU ml—1，雌激素E2在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 5 μ g · ml—1，PTEN抑制劑Pic在所述培養(yǎng)基中的濃度為 10 μ mol/Lo培養(yǎng)基2 成分及其終濃度與培養(yǎng)基1基本相同，不同的是PTEN抑制劑Pic在所述培養(yǎng)基中的濃度為1 μ mol/L。培養(yǎng)基3 成分及其終濃度與培養(yǎng)基1基本相同，不同的是PTEN抑制劑Pic在所述培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L。對(duì)照培養(yǎng)基成分及其終濃度與培養(yǎng)基1基本相同，不同的是不加入PTEN抑制劑 Pic。2) PTEN抑制劑Pic的最優(yōu)濃度篩選將步驟1得到的腔前卵泡在上述培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3中分別培養(yǎng)，39°C， 5% CO2，培養(yǎng)21天。3)卵泡生長(zhǎng)狀況統(tǒng)計(jì)卵泡直徑增長(zhǎng)值和卵泡成腔率；
成腔率為成腔的卵泡數(shù)/總培養(yǎng)成活的卵泡數(shù)X100% ；直徑增長(zhǎng)值為后一次觀察時(shí)卵泡的直徑減去前一次觀察時(shí)卵泡的直徑得到的數(shù)值。卵泡直徑結(jié)果如下表1為不同濃度的PiC對(duì)牛腔前卵泡直徑的影響
權(quán)利要求
1.一種制備促進(jìn)離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基的方法，為將胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、次黃嘌呤、血清、促卵泡素、促黃體素、雌激素、PTEN抑制劑、水和α "MEM培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)基，所述胰島素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml， 所述轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述培養(yǎng)基中的濃度為5ug/ml，所述亞硒酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為 5ng/ml ；所述丙酮酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為(0. 21-0. ^)mmol/l，所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)基中的濃度為(1.5-2.0)mmOl/l，所述次黃嘌呤在所述培養(yǎng)基中的濃度為(1.8-2.5) mmol/1，所述血清在所述培養(yǎng)基中的濃度為5%-10% (體積百分含量)，所述促卵泡素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 25μ g ^mr1-O. 5μ g ^mr1,所述促黃體素在所述培養(yǎng)基中的濃度為 5IU mP-lOItoir1，所述雌激素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 5 μ g · ml^-l.Oyg · πιΓ1，所述 PTEN抑制劑在所述培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L-lOymol/L，所述α -MEM培養(yǎng)基在所述培養(yǎng)基中的濃度為10. lg/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述丙酮酸鈉在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 21mmol/l、0. 23mmol/l或0. 29mmol/l ；所述谷氨酰胺在所述培養(yǎng)基中的濃度為1. 5mmol/lU. 8mmol/l或2. Ommol/1，所述次黃嘌呤在所述培養(yǎng)基中的濃度為1.8mm0l/l、2mm0l/l或2. 5mmol/l，所述血清在所述培養(yǎng)基中的濃度為5%、7.5%或10% (體積百分含量)，所述促卵泡素在所述培養(yǎng)基中的濃度為 0. 25μ g · mr\0.4yg · πιΓ1或0. 5 μ g · πιΓ1，所述促黃體素在所述培養(yǎng)基中的濃度為5IU mr\8IU ml—1或10IU ml—1，所述雌激素在所述培養(yǎng)基中的濃度為0. 5 μ g ·πιΓ\θ.8μδ -πιΓ1 或1. 0 μ g · πιΓ1，所述PTEN抑制劑在所述培養(yǎng)基中的濃度為lOOnmol/L、1 μ mol/L或 10 μ mol/Lo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述血清為胎牛血清；所述雌激素為雌激素E2 ；所述PTEN抑制劑為PTEN抑制劑pic。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述哺乳動(dòng)物為牛。
5.權(quán)利要求1-4中任一所述的方法制備的培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基在促進(jìn)離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述哺乳動(dòng)物為牛。
8.根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育通過(guò)增加卵泡直徑和/或提高卵泡成腔率體現(xiàn)。
9.一種體外培養(yǎng)獲得有腔卵泡的方法，包括如下步驟將離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡在權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到有腔卵泡。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的溫度為39°C，所述培養(yǎng)在5% CO2條件下進(jìn)行，所述培養(yǎng)的時(shí)間為21天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種提高牛腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基及其應(yīng)用。本發(fā)明提供制備促進(jìn)離體哺乳動(dòng)物腔前卵泡體外發(fā)育的培養(yǎng)基的方法，為將胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、丙酮酸鈉、谷氨酰胺、次黃嘌呤、血清、促卵泡素、促黃體素、雌激素、PTEN抑制劑和α-MEM培養(yǎng)基混合，得到培養(yǎng)基。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明首先從卵巢皮質(zhì)分離牛腔前卵泡，隨后將獲取的卵泡在本發(fā)明提供的培養(yǎng)基和對(duì)照培養(yǎng)基中進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察其直徑增長(zhǎng)以及卵泡的成腔率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的培養(yǎng)基培養(yǎng)得到成腔率和直徑增長(zhǎng)值均高于對(duì)照，為進(jìn)一步挖掘雌性生殖資源提供必要的培養(yǎng)體系。
文檔編號(hào)C12N5/071GK102250831SQ20111019420
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者孫婧, 李冬冬, 李向東 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)