專利名稱：玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國每年受洪澇災(zāi)害的農(nóng)田面積平均為956萬公頃，其中嚴(yán)重的年份，受災(zāi)面積達(dá)1500萬公頃以上。在亞洲地區(qū)，洪澇災(zāi)害給玉米的生產(chǎn)造成了很大的損失，僅南亞，每年超過15%的玉米種植面積遭受不同程度的危害。在印度，洪澇災(zāi)害造成玉米每年減產(chǎn)25-30%。因我國南方降雨量豐富、排灌系統(tǒng)不完善等原因，低洼地區(qū)的春玉米經(jīng)常遭受澇潰害，導(dǎo)致玉米嚴(yán)重減產(chǎn)。澇潰害已成為我國南方玉米高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的主要制約因子之一。因此，克隆玉米淹水脅迫響應(yīng)基因及其啟動(dòng)子，對(duì)闡明玉米淹水脅迫響應(yīng)形成的分子機(jī)理以及玉米和其他旱生作物耐澇潰的遺傳改良，具有十分重要的理論價(jià)值和實(shí)踐意義。 ERF基因是參與植物非生物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因之一，是水稻、深水稻和擬南芥淹水脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵基因。因此，克隆玉米ERF基因的啟動(dòng)子，有助于闡明玉米耐潰性形成的分子機(jī)制，同時(shí)為玉米及其他旱生作物的耐潰遺傳改良提供理論指導(dǎo)。然而，玉米ERF啟動(dòng)子的克隆，目前，尚未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，并提供zmERF5基因啟動(dòng)子在植物耐潰遺傳改良中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是I、玉米zmERF5基因的獲得根據(jù)已知的玉米基因組信息，使用煙草ERF2蛋白的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域高度保守的蛋白質(zhì)序列，進(jìn)行同源比對(duì)分析，電子克隆出121個(gè)ERF基因。通過與擬南芥、水稻、煙草等其他植物ERF基因的比較分析，剔除48個(gè)假陽性，獲得了 73個(gè)ERF基因，分別命名為zmERFl—zmERF73。玉米自交系Hz32的耐潰性較強(qiáng)，而Mol7耐潰性較弱，在玉米3葉I心期，分別對(duì)Hz32和Mol7進(jìn)行0、4、12h的淹水處理，并利用real-time PCR對(duì)73個(gè)ERF基因在各處理根系的表達(dá)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)zmERF5基因在Mol7及Hz32根系受淹水誘導(dǎo)高效表達(dá)，結(jié)果也暗示zmERF5基因的啟動(dòng)子是淹水脅迫響應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。2、玉米自交系Mo 17葉片總DNA的提取取玉米葉片5. Og于液氮中研磨,轉(zhuǎn)入50ml離心管中。加預(yù)熱至95°C的CTAB緩沖液(I. 17MNaCL、0. 0016M EDTA-8. 0,0. 835M Ttis-7. 5,1. 6% CTAB, I % β-疏基乙醇)10ml，混勻。在65°C水浴鍋內(nèi)反應(yīng)90分鐘，不時(shí)輕搖離心管。取出離心管，待冷至室溫后，加入等體積氯仿異醇(24 I)，小心搖動(dòng)試管10分鐘。8000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)至另一 50ml離心管中。加2/3體積異丙醇，小心混勻，將棉絮狀DNA轉(zhuǎn)入盛IOml 70%乙醇的50ml離心管中，浸泡12小時(shí)。倒掉70%乙醇，將DNA晾干，加入Iml TE溶解。待DNA完全溶解后，轉(zhuǎn)入2. Oml離心管中，加入10 μ I 10mg/ml RNaseA,混勻；在37°C下,溫育2小時(shí)。再用Iml苯酚氯仿異戊醇(25 24 I)抽提一次，8000rpm離心10分鐘。將上清液轉(zhuǎn)入2. Oml離心管中，加入1/10體積的3M NaAC (PH5. 2)，2/3體積異丙醇沉淀DNA。將棉絮狀DNA轉(zhuǎn)入2. Oml離心管中，用70%乙醇洗滌一次，短暫離心，使DNA貼壁，倒去70%乙醇，晾干DNA。待DNA晾干后，加入0.5ml T. E溶液，完全溶解DNA，于_20°C長期保存。3、zmERF5基因啟動(dòng)子的克隆根據(jù)玉米自交系B73 zmERF5基因的啟動(dòng)子序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，左引物5' TGGAAGCAAGGCCACACAACTAA 3'，右引物5' TAAATTGAATTTTAGATGTTGCCT 3'。分另Ij以Mol7、Hz32的DNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2. 5μ I 10 X PCR緩沖液，2μ1 IOmM dNTPs, I μ I IOmM特異引物，Ιμ IOmM特異右引物，I單位Taq酶，40ng模板DNA，總體積25 μ I。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?5°C 3分鐘；95°C I分鐘，61°C I分鐘，72°C 2分鐘
30秒，循環(huán)35次；72°C 7分鐘；4°C 30分鐘。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于I %瓊脂糖凝膠中120伏直流電壓電泳45分鐘，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的凝膠回收試劑盒，回收特異DNA片段，并將該DNA片段連接到pGEM-Teasy載體上，進(jìn)行DNA測(cè)序。4、轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建使用帶酶切位點(diǎn)的引物(左引物加HindIII酶切位點(diǎn)，右引物加BamHI酶切位點(diǎn))，以玉米自交系Mol7的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物與pGEM_T easy載體連接，轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5 α，生長在含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上的白色菌株被分離出來。經(jīng)PCR檢測(cè)，選擇陽性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序，提取所克隆zmERF5啟動(dòng)子序列正確的質(zhì)粒DNA。使用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶同時(shí)酶切質(zhì)粒，I %瓊脂糖凝膠電泳，回收zmERF5啟動(dòng)子片段。使用HindIII和BamHI限制性內(nèi)切酶同時(shí)酶切pBI121質(zhì)粒載體，并回收載體片段。將zmERF5啟動(dòng)子片段與pBI121載體片段在體外進(jìn)行鏈接，構(gòu)建成pBI121-zmERF5-GUS載體，轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101菌株中。對(duì)所克隆的zmERF5基因啟動(dòng)子進(jìn)行DNA測(cè)序，其DNA序列如下zmERF5基因啟動(dòng)子DNA序列TGGAAGCAAGGCCACACAACTAAACATAAGTCTACAACGCTTCCACGCCAATGGCCTCAAAGGAAAAAAGCAAGCACACATGTCAAAAAAAACTTATGCACAAGAACAAAAACGAGGAGCAAAAACAAAAAAACTGATACTCCCTCACCGGATCAACCATGTCAACACACGCTGGAGCCCCATCGCCGTGGGCTGGAGCAGTAGAGCCACCCACTTCACCACAGCTCCTCCGCTGACAGCAAACATGGATCCCGTCAGAGCCACCTCCCCCTCCACAGCAACTCATCATGGACCAGCGCGAGATCAGGAAATCGCCACCGGGGAGCCGACTCCGCCACTATGCGTCACAGAAATCGCCTTCTCTCATCTCCTACCGGACAGCCCGCCGATCGCCAGCAACACGAACAACACGAGCAGCAGAGAAAAAAAATCGCCGCCCCCTCCCCTGGATAGCCCGACGGCTGCTAGCAACAGAGGAGTAGAAGAAATGGGGAGGGCGGAGACCTTGCCGGCAAACAGCAGCACGTCGTGGGAAGCTTCGTCGGCCCTCGTTCTCAGTTCTCACGCATTCCAGAGGGCAGGGCGTTGGGGAAAGTGAACAGACGCTCCGTCGCATTCCAGAGGGCAATGGTTGGGGAAAGTGAATAGCGCGCGGAAAGTGAAAAGACGCCTGAGTAAAAAATCAAACAGTGCAATAGGGACCCTCTGTCAGCGACAGTAGACAAAAAAATATCCAACAGATGAAAAAAAAGCATATGGCAGATCCAACGGTGCACAAACGTGGATGCGTAGTCCAGTGCTTCTTCCGGTTGCTTGTTCTCAGCCTGAAATGCCTGCGCCGGGTTGGGGTAACAAGCCTCTTTCGCTGTGTCGTCGCCGTGGTTGAAGAGCTGAGACGCGACGAACTTGTCGAGCACTAAAGGCAGGAGGAGGAGGCTTGGGGCTCTCCACCAACCGAGGGCGCGCGAGAAGCCTTTGCTCAGGGAAACA
AACAGACAGACGCAACTCAGGATCGATAACTGACACTCGATTCCTTGAAGCGATGAAGTGGAGGCGAGCATGAACCCTCGCGGGGAGGTAGCGGCGGAGGCATCTCGTCCCGACCACGGCGGGGACCATGAAAGGGCGGCTCTGGGAGCTAGAGCTAGCCGTGCGCGCCGGCGTGATGGAGAGAGGGAAGCGCGGTCCAGTAGAGCGAGTAGTGAGCGGTGGTAGAGCTGCTGGCTTGCCGGTAGAGCTGCTGGCTTAGCCAGTGGTAGAGCTGCTGGCTTGCCGTGGTAGAGGCGATGGACCCGGCAGGGCGTTGGGAAGATGAACGGGCGGTCAGTCGCATTCCAGAGAGTAAAGATGAAAGTGAACAGCGGAAAGCGAAAAGACGCAATAGGGACCCTCTGTCAAGCGACAGTAAACAGAGAAAAATATCCAATAGATGAAAAAGAGCATCCTGGAGAT
CCAACGGCGTACAAATCGAGTGAAAACAACAAGAGAAACACACGCGTGTCCGTTAGCTTTTTCCTTTTTGTTTTATCAGTTTCGGTTCCTATAGTAAAAAGTTGGAGTCGTGCTAAACGGACCTTACAAACTCCGTCAAGGCAACATCTAAAATTCAATTTA5、轉(zhuǎn)zmERF5啟動(dòng)子擬南芥植株的獲得將含pBI121-zmERF5-GUS載體的GV3101農(nóng)桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基，加入利福平和卡那霉素至終濃度為100mg/L，28°C振蕩培養(yǎng)。離心收集菌體，用ddH20稀釋至OD =O. 8,每IOOml菌液加入5. Og鹿糖和50 μ I Silweet L-77。使用floral dip方法對(duì)擬南芥進(jìn)行浸染，成熟后收獲種子，將種子播在含100mg/L卡那霉素的MS固體篩選培養(yǎng)基上。從篩選培養(yǎng)基中長出的抗性植株，經(jīng)PCR檢測(cè)后確定為轉(zhuǎn)zmERF5啟動(dòng)子陽性植株。6、zmERF5啟動(dòng)子活性的檢測(cè)將轉(zhuǎn)zmERF5擬南芥于苗期進(jìn)行淹水處理，將正常生長和淹水處理的轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常生長條件下，轉(zhuǎn)zmERF5啟動(dòng)子擬南芥植株的根和葉片，未出現(xiàn)GUS染色的藍(lán)色；而淹水條件下，轉(zhuǎn)zmERF5啟動(dòng)子擬南芥的根呈現(xiàn)較強(qiáng)的⑶S藍(lán)色，葉片未見⑶S藍(lán)色。研究表明zmERF5啟動(dòng)子既是一個(gè)在根中表達(dá)的組織特異型啟動(dòng)子，同時(shí)也是一個(gè)淹水誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。本發(fā)明與現(xiàn)有的技術(shù)相比具有如下有益效果l、zmERF5啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物，淹水條件下快速高效啟動(dòng)外源基因在植株根部的大量表達(dá)，可以提高植株的耐潰性，或抗蟲、抗病等能力。2. zmERF5啟動(dòng)子直接驅(qū)動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)基因植物，由于外源基因只在淹水條件下誘導(dǎo)表達(dá)，且表達(dá)部位僅局限于根部，所以對(duì)于食用非根部的轉(zhuǎn)基因植物，不存在轉(zhuǎn)基因食品安全問題。3、zmERF5啟動(dòng)子為淹水條件下誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和只在根部特異表達(dá)的組織特異性啟動(dòng)子、是啟動(dòng)能力較強(qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子。
具體實(shí)施例方式把zmERF5啟動(dòng)子克隆到轉(zhuǎn)化載體上，其后連接一個(gè)Tnos終止子，構(gòu)建成一個(gè)轉(zhuǎn)化載體。將所轉(zhuǎn)化的目的基因以正確的方向，克隆到zmERF5啟動(dòng)子與Tnos終止子之間，構(gòu)建好轉(zhuǎn)化載體。然后通過基因槍轟擊法或農(nóng)桿菌法介導(dǎo)法將目的基因轉(zhuǎn)化到受體細(xì)胞中，通過組織培養(yǎng)等技術(shù)手段獲得轉(zhuǎn)基因植株。在澇潰、淹水條件下，zmERF5啟動(dòng)子可以啟動(dòng)目的基因在植株根部大量表達(dá)。
權(quán)利要求
1.玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，其特征在于zmERF5基因啟動(dòng)子的DNA序列為TGGAAGCAAGGCCACACAACTAAACATAAGTCTACAACGCTTCCACGCCAATGGCCTCAAAGGAAAAAAGCAAGCACACATGTCAAAAAAAACTTATGCACAAGAACAAAAACGAGGAGCAAAAACAAAAAAACTGATACTCCCTCACCGGATCAACCATGTCAACACACGCTGGAGCCCCATCGCCGTGGGCTGGAGCAGTAGAGCCACCCACTTCACCACAGCTCCTCCGCTGACAGCAAACATGGATCCCGTCAGAGCCACCTCCCCCTCCACAGCAACTCATCATGGACCAGCGCGAGATCAGGAAATCGCCACCGGGGAGCCGACTCCGCCACTATGCGTCACAGAAATCGCCTTCTCTCATCTCCTACCGGACAGCCCGCCGATCGCCAGCAACACGAACAACACGAGCAGCAGAGAAAAAAAATCGCCGCCCCCTCCCCTGGATAGCCCGACGGCTGCTAGCAACAGAGGAGTAGAAGAAATGGGGAGGGCGGAGACCTTGCCGGCAAACAGCAGCACGTCGTGGGAAGCTTCGTCGGCCCTCGTTCTCAGTTCTCACGCATTCCAGAGGGCAGGGCGTTGGGGAAAGTGAACAGACGCTCCGTCGCATTCCAGAGGGCAATGGTTGGGGAAAGTGAATAGCGCGCGGAAAGTGAAAAGACGCCTGAGTAAAAAATCAAACAGTGCAATAGGGACCCTCTGTCAGCGACAGTAGACAAAAAAATATCCAACAGATGAAAAAAAAGCATATGGCAGATCCAACGGTGCACAAACGTGGATGCGTAGTCCAGTGCTTCTTCCGGTTGCTTGTTCTCAGCCTGAAATGCCTGCGCCGGGTTGGGGTAACAAGCCTCTTTCGCTGTGTCGTCGCCGTGGTTGAAGAGCTGAGACGCGACGAACTTGTCGAGCACTAAAGGCAGGAGGAGGAGGCTTGGGGCTCTCCACCAACCGAGGGCGCGCGAGAAGCCTTTGCTCAGGGAAACAAACAGACAGACGCAACTCAGGATCGATAACTGACACTCGATTCCTTGAAGCGATGAAGTGGAGGCGAGCATGAACCCTCGCGGGGAGGTAGCGGCGGAGGCATCTCGTCCCGACCACGGCGGGGACCATGAAAGGGCGGCTCTGGGAGCTAGAGCTAGCCGTGCGCGCCGGCGTGATGGAGAGAGGGAAGCGCGGTCCAGTAGAGCGAGTAGTGAGCGGTGGTAGAGCTGCTGGCTTGCCGGTAGAGCTGCTGGCTTAGCCAGTGGTAGAGCTGCTGGCTTGCCGTGGTAGAGGCGATGGACCCGGCAGGGCGTTGGGAAGATGAACGGGCGGTCAGTCGCATTCCAGAGAGTAAAGATGAAAGTGAACAGCGGAAAGCGAAAAGACGCAATAGGGACCCTCTGTCAAGCGACAGTAAACAGAGAAAAATATCCAATAGATGAAAAAGAGCATCCTGGAGATCCAACGGCGTACAAATCGAGTGAAAACAACAAGAGAAACACACGCGTGTCCGTTAGCTTTTTCCTTTTTGTTTTATCAGTTTCGGTTCCTATAGTAAAAAGTTGGAGTCGTGCTAAACGGACCTTACAAACTCCGTCAAGGCAACATCTAAAATTCAATTTA。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，其特征在于所述的啟動(dòng)子是從玉米自交系Mol7中克隆獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，其特征在于在澇潰、淹水條件下，zmERF5啟動(dòng)子可以啟動(dòng)目的基因在植株根部大量表達(dá)。
全文摘要
本發(fā)明涉及玉米淹水脅迫響應(yīng)zmERF5基因啟動(dòng)子，屬植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域；其特征在于公開了zmERF5基因啟動(dòng)子的DNA序列，該啟動(dòng)子的特征是含有2個(gè)AuxRR-Core、1個(gè)CE3、4個(gè)CGTCA-motif和2個(gè)MBS位點(diǎn)順式元件，這些順式元件與植物激素、厭氧脅迫響應(yīng)相關(guān)，是一個(gè)組織特異型的啟動(dòng)子，只在根系中表達(dá)；是一個(gè)誘導(dǎo)型的啟動(dòng)子，受淹水誘導(dǎo)高效表達(dá)。該啟動(dòng)子與抗蟲、抗病、抗逆等目的基因連接，在淹水、澇漬條件下，可提高轉(zhuǎn)基因植株根部的抗蟲、抗病、抗逆境能力。同時(shí)該啟動(dòng)子只在根部表達(dá)，不涉及食用轉(zhuǎn)基因植物地上部分的食品安全問題。zmERF5啟動(dòng)子在旱生植物的耐漬遺傳改良中，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102876674SQ20111019920
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2011年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月15日
發(fā)明者杜何為, 黃敏, 張祖新, 陳威, 黃育剛, 范金香, 吳闖 申請(qǐng)人:長江大學(xué)