專利名稱：一種鑒定白菜紫色性狀的方法及專用引物對(duì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒定白菜紫色性狀的方法及專用引物對(duì)。
背景技術(shù)：
花青素是存在于植物中的水溶性色素，由一個(gè)基本的結(jié)構(gòu)母核和不同的取代基組成，因取代基種類及位置不同而形成了不同顏色的花青素，包括粉、紅、紫和藍(lán)色等，大約 88%的被子植物的花顏色是由花青素決定的，花青素主要積累在植物液泡中并有多種生理功能，例如吸引昆蟲傳粉，抵御低溫和紫外線傷害，以及防治植物病害等；花青素是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)效的自由基清除劑，具有抗氧化衰老、抗突變、抗癌與抗動(dòng)脈硬化功能；此外，花青素還是一種安全、無毒的天然食用色素。因此，花青素在園藝、醫(yī)藥、化妝、食品等方面具有一定的應(yīng)用潛力和研究?jī)r(jià)值。白菜紫色品種是近幾年在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)的新類型，主要由國(guó)外引入。2006年前后，國(guó)外推出了應(yīng)用細(xì)胞質(zhì)Ogu CMS不育系育成的紫色小白菜雜交一代(中文名稱“紫羅蘭”)，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)銷售、種植，影響較大。這份紫色小白菜植株綜合表現(xiàn)為個(gè)體生長(zhǎng)速度緩慢，葉片正面紫色，葉片背面綠色，葉柄翠綠。在秋季栽培條件下，由于陽光充足，葉片的亮紫色表現(xiàn)尤為突出等特點(diǎn)。張德雙等采用多份大白菜與引進(jìn)的紫色小白菜雜交，得到了 2份紫色的大白菜中間材料。白菜紫色品種的紫色是由花青素類物質(zhì)所致。研究表明，白菜紫色品種花青素含量比普通品種高很多。目前關(guān)于大白菜紫色性狀來源的報(bào)道主要有3種途徑西北農(nóng)林科技大學(xué)于2001 年開始著手進(jìn)行紫色大白菜新品種的選育工作，試驗(yàn)所用的紫紅色基因源來自紫菜薹；孫日飛于2006年報(bào)道了利用紫紅色芥菜作為紫色源，經(jīng)過種間雜交和連續(xù)回交，成功地獲得了紫紅色大白菜新種質(zhì)；2007年張德雙報(bào)道了選用2份大白菜(07-721和07-80 與紫色小白菜雜交，分別獲得雜交F1代，再用2份大白菜與2個(gè)&分別回交轉(zhuǎn)育，已初步獲得紫色大白菜中間材料(07D3和07D5)。孫日飛等經(jīng)初步研究認(rèn)為，來自芥菜的紫紅色基因源，紫紅色基因與控制黃色、橘紅色的基因遺傳表現(xiàn)相反，表現(xiàn)為顯性；張德雙等通過大白菜與紫色小白菜變種間雜交，初步研究認(rèn)為葉片紫色對(duì)綠色受1對(duì)遺傳基因控制，紫色對(duì)綠色為顯性，決定葉片紫色的基因具有累加效應(yīng)；張明科等通過大白菜與紫菜薹種間雜交和連續(xù)回交，通過調(diào)察和統(tǒng)計(jì)，進(jìn)行常規(guī)和分子分析后，初步研究認(rèn)為，紫色性狀為數(shù)量性狀，是受一對(duì)主基因控制的部分顯性遺傳，并呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，可能還受到微效基因和環(huán)境條件的共同影響。盡管所用的紫色基因源不同，但紫色性狀表現(xiàn)出較相似的遺傳趨勢(shì)。分子標(biāo)記輔助育種是分子標(biāo)記技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合的產(chǎn)物，具有準(zhǔn)確、不受環(huán)境條件干擾等優(yōu)點(diǎn)。利用分子標(biāo)記與決定目標(biāo)性狀基因緊密連鎖的特點(diǎn)，通過檢測(cè)與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，篩選出所要的基因型，輔助常規(guī)育種，從而達(dá)到提高育種效率、 加快育種進(jìn)程的目的。目前蔬菜作物上主要對(duì)抗病、抗逆及重要農(nóng)藝性狀基因開展了分子標(biāo)記及定位的
3研究工作，這將是開展分子標(biāo)記輔助育種及定位、圖位克隆重要基因的基礎(chǔ)。國(guó)內(nèi)外已經(jīng)大規(guī)模開展了包括白菜、甘藍(lán)、番茄、甜(辣)椒、黃瓜、馬鈴薯等主要蔬菜作物的分子標(biāo)記研究，這些主要性狀的分子標(biāo)記為開展蔬菜作物的分子標(biāo)記輔助育種提供了重要基礎(chǔ)。張明科等獲得了 2個(gè)與大白菜紫色性狀連鎖的RAPD標(biāo)記，遺傳距離分別為13. 73cM和18. 65cM。 盡管張明科找到了與紫色性狀連鎖的標(biāo)記，但是其遺傳距離還相對(duì)較遠(yuǎn)，遠(yuǎn)達(dá)不到分子標(biāo)記輔助育種的要求。目前，在所應(yīng)用的標(biāo)記中，RFLP標(biāo)記所需DNA量較大，步驟較多，周期長(zhǎng)，制備探針及檢測(cè)中要用到放射性同位素，成本高；RAPD標(biāo)記因使用的引物比較短，對(duì)反應(yīng)條件極為敏感，稍有改變便影響擴(kuò)增產(chǎn)物的重現(xiàn)，重復(fù)性較差，穩(wěn)定性不好。另外，RAPD是顯性標(biāo)記， 不能區(qū)分純合基因型與雜合基因型，無法直接用于基因型分析；AFLP標(biāo)記費(fèi)用比較昂貴， 且方法需經(jīng)多步操作，統(tǒng)計(jì)分析困難，對(duì)DNA的純度和內(nèi)切酶的質(zhì)量要求很高；SNP提供的信息較少，且費(fèi)用較高。相比之下SSR標(biāo)記具有了以下優(yōu)點(diǎn)(1)數(shù)量豐富，覆蓋整個(gè)基因組，揭示的多態(tài)性高。( 具有多等位基因的特性，提供的信息量高。( 共顯性遺傳，不易被自然選擇和人工選擇所淘汰，符合孟德爾遺傳定律。(4)易于利用PCR技術(shù)分析，對(duì)DNA 質(zhì)量要求低，用量少，不需使用同位素，即使是部分降解的樣品也可進(jìn)行分析。(5)每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于不同的實(shí)驗(yàn)室相互交流合作開發(fā)引物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于鑒定白菜紫色性狀的引物對(duì)。本發(fā)明所提供的用于鑒定白菜紫色性狀的引物對(duì)，其中一條引物如1)所示，另一條引物如2)所示1)為如下A或B:A、核苷酸序列為SEQ ID NO 1的DNA分子；B、將A限定的DNA分子經(jīng)過1個(gè)或幾個(gè)堿基的替換，得到的具有相同功能的由A 衍生的DNA分子；2)為如下C或D C、核苷酸序列為SEQ ID NO 2的DNA分子；D、將C限定的DNA分子經(jīng)過1個(gè)或幾個(gè)堿基的替換，得到的具有相同功能的由C 衍生的DNA分子。上述任一所述引物對(duì)在鑒定白菜紫色性狀中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種輔助鑒定白菜紫色性狀的方法。本發(fā)明所提供的輔助鑒定白菜紫色性狀的方法，包括如下步驟用上述任一所述引物對(duì)對(duì)待測(cè)白菜進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為21!3bp，則確認(rèn)所述待測(cè)白菜顏色候選為紫色。上述引物對(duì)中、上述應(yīng)用中、上述鑒定方法中，所述白菜顏色均指白菜葉片顏色， 尤其指葉片正面顏色即葉片向陽面顏色。上述引物對(duì)中、上述應(yīng)用中、上述鑒定方法中，所述白菜為含有控制紫色性狀的基因的白菜，具體可為紫色小白菜與其它白菜雜交得到的后代白菜。本發(fā)明利用F2群體將控制紫色性狀的基因首次定位到A3染色體上，找到了與紫
4色性狀緊密連鎖的共顯性分子標(biāo)記，建立了大白菜紫色分子標(biāo)記輔助選擇系統(tǒng)。本發(fā)明方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在早期便可鑒定出純合的材料，選擇性強(qiáng)，減少了育種的盲目性，節(jié)省了時(shí)間，降低了勞動(dòng)成本，加快了育種進(jìn)程，具有重要意義。該分子標(biāo)記不僅可以用于鑒定大白菜的紫色性狀，而且為克隆紫色基因和轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。


圖1為大白菜、紫色小白菜親本、群體。A 大白菜(P1), B:紫色小白菜(P2)， C =FnD=F2分離群體。圖2為BVb005P10-18引物兩池各單株的電泳結(jié)果。P1 綠色，P2 紫色，Ll和L2 綠色池，Zl和Z2 紫色池，1-11 紫色單株，12-23 綠色單株。Ml IOObp marker, M2 50bpmarkero圖3為階13005 10-18在&群體上的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。M:50bp marker, 1-186 186 個(gè) F2 單株。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例1、分子標(biāo)記的應(yīng)用一、材料大白菜(09-680)在文獻(xiàn)“張德雙，張鳳蘭，趙岫云，余陽俊，徐家炳，于拴倉，汪維紅.2011.大白菜(大白菜X紫色小白菜)葉片紫色性狀的遺傳分析.中國(guó)蔬菜，2:36-38” 中公開過，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。紫色小白菜(09N-742)在文獻(xiàn)“張德雙，張鳳蘭，趙岫云，余陽俊，徐家炳，于拴倉， 汪維紅.2011.大白菜(大白菜X紫色小白菜)葉片紫色性狀的遺傳分析.中國(guó)蔬菜，2: 36-38”中公開過，公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得。以大白菜P1 (09-680)和己紫色小白菜(09N-742)為親本，雜交獲得F1，然后自交得到F2代，用186個(gè)F2單株構(gòu)建F2群體(圖1)。二、分子標(biāo)記
權(quán)利要求
1.一種用于鑒定白菜紫色性狀的引物對(duì)，其中一條引物如1)所示，另一條引物如2)所示1)為如下A或B:A、核苷酸序列為SEQID NO 1的DNA分子；B、將A限定的DNA分子經(jīng)過1個(gè)或幾個(gè)堿基的替換，得到的具有相同功能的由A衍生的DNA分子；2)為如下C或D:C、核苷酸序列為SEQID NO 2的DNA分子；D、將C限定的DNA分子經(jīng)過1個(gè)或幾個(gè)堿基的替換，得到的具有相同功能的由C衍生的DNA分子。
2.權(quán)利要求1所述引物對(duì)在鑒定白菜紫色性狀中的應(yīng)用。
3.一種輔助鑒定白菜紫色性狀的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求1所述引物對(duì)對(duì)待測(cè)白菜進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，若所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為21!3bp，則確認(rèn)所述待測(cè)白菜顏色候選為紫色。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鑒定白菜紫色性狀的方法及專用引物對(duì)。該引物對(duì)，其中一條引物如SEQ ID NO1所示，另一條引物如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明利用F2群體將控制紫色性狀的基因首次定位到A3染色體上，找到了與紫色性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記可以用于鑒定大白菜的紫色性狀，為進(jìn)一步進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種和克隆基因奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明鑒定方法鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，在大白菜的生長(zhǎng)早期便可進(jìn)行鑒定，無需等待其植株長(zhǎng)成時(shí)再鑒定，節(jié)省了時(shí)間，降低了勞動(dòng)成本，加快了育種速度，具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102242219SQ20111020036
公開日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者于拴倉, 余陽俊, 劉瑾, 盧桂香, 張鳳蘭, 張德雙, 徐家炳, 汪維紅, 趙岫云 申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院