專利名稱：一種多功能穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多功能穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，特別是一種適用于產(chǎn)甘油假絲酵母的穿梭載體。
背景技術(shù)：
產(chǎn)甘油假絲酵母是野生型的甘油高產(chǎn)菌株。與釀酒酵母相比，它具有生長速度和發(fā)酵速度快，耐高滲透壓，甘油產(chǎn)率高，轉(zhuǎn)化率和耗糖轉(zhuǎn)化率世界領(lǐng)先等較多優(yōu)勢(王正祥，諸葛健.耐高滲壓高壓甘油的一個(gè)假絲酵母新種產(chǎn)甘油假絲酵母[J].微生物學(xué)報(bào).1999,39(001) :68-74)。應(yīng)用于基因工程技術(shù)中的宿主細(xì)胞具有較大前景。另一方面， 在大規(guī)模生產(chǎn)生物柴油過程中會(huì)產(chǎn)生較多的副產(chǎn)物甘油，在一定程度上削弱了發(fā)酵法生產(chǎn)甘油的優(yōu)勢，以甘油為原材料或底物生產(chǎn)高附加值的生物產(chǎn)品越來越受到重視，那么以產(chǎn)甘油假絲酵母作為宿主通過代謝工程構(gòu)建基因工程菌株生產(chǎn)高附加值生物產(chǎn)品具有潛在的前景。但是該菌株的遺傳知識(shí)和分子生物學(xué)信息遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于釀酒酵母等模式菌株。該菌株有很多獨(dú)有的性質(zhì)，其他酵母適用的載體大多不能在該酵母中使用。如對(duì)潮霉素、G418等真菌抗生素具有很強(qiáng)的抗性，不能使用這些抗生素作為遺傳工程技術(shù)中的篩選標(biāo)記。遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏已經(jīng)嚴(yán)重限制了該工業(yè)菌株的研究和應(yīng)用，所以構(gòu)建適用于該酵母的表達(dá)載體迫在眉睫。2008年，本實(shí)驗(yàn)室陳獻(xiàn)忠(Chen X，F(xiàn)ang H, Rao Ζ, Shen W, Zhuge B，Wang Z and Zhuge J. (2008)An efficient genetic transformation method for glycerol producer Candida glycerinogenes. Microbiol. Res. 163 :531-553)描述了電轉(zhuǎn)化是該菌株的比較合適的轉(zhuǎn)化方法，并且構(gòu)建了以kocin為篩選標(biāo)記的整合載體。2010年沈微(Shen W, Wang ZX, Rao ZM, Zhuge J and Zhuge B. (2010)A genetic transformation system based on trpl complementation in C. glycerinogenes. World J. Microbiol. Biotechnol. 27 :1005-1008)構(gòu)建了基于Trpl互補(bǔ)的以18s rDNA為整合位點(diǎn)的整合載體， 使用的也是^ocin篩選標(biāo)記。抗藥性是最方便的篩選標(biāo)記，使用藥物篩選酵母轉(zhuǎn)化子比使用其他的方法如營養(yǎng)缺陷型，都要簡單易行。但是產(chǎn)甘油假絲酵母對(duì)潮霉素、G418、放線菌酮等藥物的抗性較強(qiáng)，不能使用這些作為篩選酵母轉(zhuǎn)化子的篩選條件。kocin可以用于篩選酵母轉(zhuǎn)化子，但是其價(jià)格昂貴，大大限制了對(duì)該優(yōu)良菌株的深入研究。把銅抗性篩選標(biāo)記應(yīng)用于產(chǎn)甘油假絲酵母這一工業(yè)菌株不僅操作簡單，而且大大降低了科研和工業(yè)生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的一個(gè)技術(shù)問題是提供一種多功能穿梭表達(dá)載體，能大大降低生產(chǎn)和科研成本。所述表達(dá)載體，以pGAP^為骨架，含有URA3整合位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、CUPl銅抗性蹄選標(biāo)記表達(dá)盒。所述URA3整合位點(diǎn)5’端有HindIILHpaI酶切位點(diǎn)，能將銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒
3插入其中。所述多克隆位點(diǎn)包括Asp718I、KpnI、PmlI、&icII、SfiI、XhoI。所述銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒包括上游GAP啟動(dòng)子及下游AOXl終止子。所述URA3序列如SEQ ID NO. 1所示。所述銅抗性篩選標(biāo)記序列如SEQ ID NO. 2所示。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種構(gòu)建多篩選標(biāo)記表達(dá)載體的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟1)克隆產(chǎn)甘油假絲酵母的URA3序列到pGAPZB，構(gòu)建表達(dá)載體pGAPZU ；2)克隆釀酒酵母的CUPl序列到pGAPZB，構(gòu)建載體pGAPZC ；3)以pGAPZC質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增酵母篩選標(biāo)記表達(dá)盒，將酵母篩選標(biāo)記表達(dá)盒克隆到pGAPZU的URA3序列5’端HindIILHpaI酶切位點(diǎn)之間，獲得pGUGCA穿梭載體。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)甘油假絲酵母的多篩選標(biāo)記穿梭載體的應(yīng)用方法。所述的表達(dá)載體URA3序列內(nèi)部有多個(gè)單酶切位點(diǎn)，可使用SspI、BstXI等單酶切線性化轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細(xì)胞。所述的表達(dá)載體能夠在大腸桿菌和產(chǎn)甘油假絲酵母中復(fù)制，能夠應(yīng)用于構(gòu)建產(chǎn)甘油假絲酵母表達(dá)體系。所述的表達(dá)載體能夠應(yīng)用于克隆目的基因，在大腸桿菌中使用低濃度kocin為篩選標(biāo)記，在酵母中使用銅篩選標(biāo)記。所述的表達(dá)載體應(yīng)用于整合表達(dá)，能實(shí)現(xiàn)目的基因在產(chǎn)甘油假絲酵母中穩(wěn)定復(fù)制和表達(dá)。本發(fā)明提供的表達(dá)載體適用于產(chǎn)甘油假絲酵母，能穩(wěn)定復(fù)制、表達(dá)，此外還適用于在大腸桿菌中擴(kuò)增。對(duì)于產(chǎn)甘油假絲酵母來說，使用^ocin作為篩選標(biāo)記的成本為7 元 /L，而使用CuSO4 ·5Η20作為篩選標(biāo)記的成本僅為1. 1元/L，與之前在酵母中使用kocin為篩選標(biāo)記相比大大降低了成本，此外本專利克服了大多數(shù)抗生素在產(chǎn)甘油假絲酵母無法使用的缺陷。


圖1穿梭載體pGUGGA物理圖譜。圖2轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞中綠色熒光蛋白的檢測。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所用PCR相關(guān)試劑，限制性內(nèi)切酶，CIAP購自TaKaRa公司。質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收試劑盒購買自博大泰克。質(zhì)粒PGAP^購自^witrogen公司，所用分子生物學(xué)方法都均按照分子克隆進(jìn)行操作。實(shí)施例1 pT-URA3的構(gòu)建根據(jù)產(chǎn)甘油假絲酵母URA3基因序列(GenBank序列號(hào)為No. AY623794)，使用 DNAMAN設(shè)計(jì)引物URA3U1和URA3R1。為了利于將PCR片段連接到質(zhì)粒pGAP^上，在上游引物URA3U1的5'端添加BglII酶切位點(diǎn)。下游引物URA3R1的5'端含有BglII酶切位點(diǎn)， 所以不用額外添加BglII酶切位點(diǎn)。上游引物URA3U15' -GAAGATCTGTTCCGCGTATTCTAAGTG-3 ‘，下游引物URA3R15' -GCTTTGGTGGTTTGGTTACCGTGAGG-3 ‘，下劃線“_”表示引入的酶切位點(diǎn)。PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 50s，55°C退火 2min，72°C延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)；72°C再延伸IOmin。產(chǎn)物回收后，與T載體連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)JM109，使用100ug/mL的 LB平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒，驗(yàn)證得質(zhì)粒構(gòu)建正確。實(shí)施例2 pGAPZU的構(gòu)建將上述獲得的pT-URA3使用BglII進(jìn)行酶切，于一個(gè)500ul的離心管中進(jìn)行，酶切體系為質(zhì)粒DNA30ul，10XbufferH 5ul，BglIMul，用水補(bǔ)足50ul。然后放于37°C水浴鍋中，酶切證。PGAP^質(zhì)粒DNA使用同樣的酶同樣的方法進(jìn)行酶切。pGAP^質(zhì)粒酶切產(chǎn)物放于65°C水浴鍋中處理半小時(shí)，使BglII酶失活，加入CIAP 3ul,CIAP buffer 6ul，然后將離心管放于37°C水浴鍋中處理一小時(shí)進(jìn)行去磷酸化，防止酶切片段自連。按8 1的比例往待純化體系中加入結(jié)合緩沖液，充分混勻，混勻后，將溶液加入離心吸附柱中，再將吸附柱套入廢液收集管中，8000r/min離心30s。(反應(yīng)體系不足50 μ 1的，用水補(bǔ)足50 μ 1后再加結(jié)合緩沖液)。倒回柱子再離心30s，去廢液。在吸附柱內(nèi)加入500 μ 1漂洗液，SOOOr/ min離心lmin，洗去雜質(zhì)，重復(fù)漂洗一次。倒棄收集管內(nèi)液體，8000r/min離心2min，除去殘留液體。將質(zhì)粒純化柱放在一干凈的1. 5ml離心管中，加入35μ 1洗脫緩沖液至管內(nèi)柱面上，放置5min。8000r/min離心lmin，取出吸附柱，樣品4°C保存。取已滅菌的500μ1離心管一支，用記號(hào)筆標(biāo)上組號(hào)，依次加入DNA片段1 μ 1，質(zhì)粒酶切片段7 μ 1，T4DNA Iigase 1 μ 1，10XT4DNAligase bufferl μ 1混勻。將上述溶液于16°C水浴過夜。轉(zhuǎn)化大腸桿菌， 在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取轉(zhuǎn)化子，PCR和酶切驗(yàn)證得出質(zhì)粒構(gòu)建正確。實(shí)施例3穿梭載體pGAP^C的構(gòu)建根據(jù)NCBI上所查到得釀酒酵母W303-1A中CUPl基因序列(GenBank序列號(hào)為 No. 856450)設(shè)計(jì)引物。所用引物為CUPF 1CCGGAATTCATCTGTTGTACTATCCGCTTCUPRl :ATTTCCGCCGCTATACGTGCATATGTTC為了利于克隆，分別在CUPFl、CUPRl中添加了 EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)。以釀酒酵母染色體DNA為模板，以⑶PF1、CUPRl為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)程序95°C預(yù)變性 5min。94°C變性 50s，56°C退火 lmin，72°C延伸 lmin, 30個(gè)循環(huán)。72°C再延伸lOmin。將上述獲得的PCR片段使用EcoRI和NotI進(jìn)行酶切，克隆到pGAP^構(gòu)建質(zhì)粒 pGAP^C，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取轉(zhuǎn)化子。酶切驗(yàn)證得出質(zhì)粒構(gòu)建正確。實(shí)施例4穿梭載體pGUGCA的構(gòu)建根據(jù)pGAPZBC質(zhì)粒序列設(shè)計(jì)引物GAPUl和A0XR1，為了利于將PCR片段連接到質(zhì)粒 pGAPZU上，在上游引物GAPUl的5'端添加HpaI酶切位點(diǎn)。在下游引物A0XR1的5'端添加HindIII酶切位點(diǎn)。
GAPUl 5' -GGGTTAACGGATCTCAAGAAGATCCTTTG-3‘AOXRl 5' -CCCAAGCTTGTGGTACGGCGATGCGCGG-3‘，下劃線“_”表示引入的酶切位點(diǎn)。PCR程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 50s，55°C退火 2min，72°C延伸 lmin，30 個(gè)循環(huán)；72 °C再延伸IOmin。將上述獲得的PCR片段通過HpaI和HindIII進(jìn)行酶切，克隆到pGAPZU構(gòu)建質(zhì)粒 pGUGCA(圖1)，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取轉(zhuǎn)化子。酶切驗(yàn)證得出質(zhì)粒
構(gòu)建正確。實(shí)施例5載體pGUGCA的酵母轉(zhuǎn)化子銅抗性結(jié)果穿梭載體pGUGCA經(jīng)BstX I酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)甘油假絲酵母中，使用 150ug/ml的hoc in平板篩選陽性轉(zhuǎn)化子。任意挑取產(chǎn)甘油假絲酵母WL2002-5電轉(zhuǎn)化獲得的20株kocin抗性酵母轉(zhuǎn)化子， 接種于新鮮的YEPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，收集菌體后在無菌水中饑餓處理2h，以野生型產(chǎn)甘油假絲酵母作為對(duì)照，然后劃線于含17 22mmol/l Cu2+的YEPD平板上，30°C培養(yǎng)3天。 結(jié)果顯示野生型產(chǎn)甘油假絲酵母的銅離子最低抑制濃度為18mmol/L，而產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化子的銅離子最低抑制濃度為21mmol/L。銅抗性可以作為基因工程技術(shù)中的篩選標(biāo)記。
實(shí)施例6使用pGUGCA載體表達(dá)綠色熒光蛋白將GFP編碼序列插入pGUGCA載體的多克隆位點(diǎn)，然后電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)甘油假絲酵母中，使用銅離子篩選陽性轉(zhuǎn)化子。具體實(shí)驗(yàn)如下根據(jù)pCAMBIA1302質(zhì)粒中GFP編碼基因(GenBank序列號(hào)為No. AAF65344. 1)設(shè)計(jì)兩個(gè)引物GFPUl和GFPR1。為了利于將PCR片段連接到質(zhì)粒pGUGGC上，在上游引物GFPUl 的5'端添加Kpn I位點(diǎn)。在下游引物GFPRl的5'端添加Β ο I酶切位點(diǎn)。GFPUl 5' -CGGGGTACCATGGTAGATCTGACTAG-3‘，GFPRl 5' -CCGCTCGAGCCCGATCTAGTAACATAG-3‘，下劃線“_”表示引入的酶切位點(diǎn)。PCR 反應(yīng)程序?yàn)?5°C預(yù)變性 5min ；94°C變性 50s，57°C退火 2min，72°C延伸 lmin， 30個(gè)循環(huán)；72 °C再延伸IOmin。將上述獲得的PCR片段使用Kpn I和Bio I進(jìn)行酶切，克隆到pGUGCA以驗(yàn)證表達(dá)載體的功能，在含25ug/ml的kocin的LB抗性平板上挑取大腸桿菌轉(zhuǎn)化子。酶切驗(yàn)證得出質(zhì)粒構(gòu)建正確。將上述構(gòu)建的載體使用BstX I單酶切線性化后，電轉(zhuǎn)化至產(chǎn)甘油假絲酵母細(xì)胞中，使用21mmol/l的Cu2+篩選產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化子。將獲得的陽性轉(zhuǎn)化子使用熒光顯微鏡觀察，可以觀察到綠色熒光(圖2)。實(shí)施例7使用pGUGCA表達(dá)目的基因的酵母轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性將產(chǎn)甘油假絲酵母轉(zhuǎn)化子在含有21mmol/lCU2+的YEPD選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜后，按照10_3的稀釋度接種于不含Cu2+的YEPD非選擇性培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)1 后，將菌液適當(dāng)稀釋涂布于非選擇性培養(yǎng)基中，3天后，將平板復(fù)制到選擇性平板中培養(yǎng)。經(jīng)計(jì)數(shù)得具有銅抗性的酵母轉(zhuǎn)化子為96%。所計(jì)數(shù)的總酵母菌落在300個(gè)以上。這說明酵母轉(zhuǎn)化子較穩(wěn)定。
實(shí)施例8載體pGUGCA在釀酒酵母、皺褶假絲酵母中的應(yīng)用將GFP編碼序列插入pGUGCA載體的多克隆位點(diǎn)，線性化后電轉(zhuǎn)化至釀酒酵母、皺褶假絲酵母中，使用銅離子篩選陽性轉(zhuǎn)化子。熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)了綠色熒光。
權(quán)利要求
1.一種多功能穿梭表達(dá)載體，其特征是以PGAP^為骨架，含有多克隆位點(diǎn)、產(chǎn)甘油假絲酵母的URA3序列及銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述多克隆位點(diǎn)包括ASp718I、KpnI、RiilI、 SacII、SfiI、XhoI0
3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于所述銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒包括上游GAP 啟動(dòng)子及下游AOXl終止子。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述URA3序列如SEQIDNO. 1所示。
5.權(quán)利要求1-3任一所述的表達(dá)載體，其特征在于所述銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒如SEQ ID NO. 2 所示。
6.權(quán)利要求1所述表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟1)克隆產(chǎn)甘油假絲酵母的URA3序列到pGAPZB，構(gòu)建表達(dá)載體pGAPZU；2)克隆釀酒酵母的CUPl序列到pGAPZB，構(gòu)建載體pGAPZC；3)以pGAPZC質(zhì)粒DNA為模板，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒，將酵母篩選標(biāo)記表達(dá)盒克隆到PGAPZU的URA3序列一端，獲得pGUGCA穿梭載體。
7.權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體構(gòu)建方法，其特征在于URA3序列的5’端存在兩個(gè)酶切位點(diǎn)HindIII、HpaI，能將銅抗性篩選標(biāo)記表達(dá)盒插入其中。
8.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體應(yīng)用于克隆目的基因，其特征在于在大腸桿菌中使用低濃度^ocin為篩選標(biāo)記，在酵母中使用銅篩選標(biāo)記。
9.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體應(yīng)用于整合表達(dá)，其特征在于使用載體URA3序列內(nèi)部的單酶切位點(diǎn)^pI、BstXI等酶切線性化，提高轉(zhuǎn)化效率。
10.權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體應(yīng)用于整合表達(dá)，其特征在于該載體不僅能應(yīng)用于產(chǎn)甘油假絲酵母，還能應(yīng)用于釀酒酵母、皺褶假絲酵母等酵母屬。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多功能穿梭表達(dá)載體及其構(gòu)建方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建的載體pGUGCA以pGAPZB為骨架，以產(chǎn)甘油假絲酵母URA3序列為整合位點(diǎn)，以低濃度Zeocin為大腸桿菌中的篩選標(biāo)記，以銅離子為酵母篩選標(biāo)記。本專利獲得的穿梭載體pGUGCA可以在大腸桿菌中復(fù)制，在產(chǎn)甘油假絲酵母中復(fù)制和表達(dá)。該載體實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌中使用低濃度Zeocin為篩選標(biāo)記，在酵母中使用銅篩選標(biāo)記，大大降低了生產(chǎn)和科研成本，同時(shí)介導(dǎo)目的基因在產(chǎn)甘油假絲酵母這一優(yōu)良宿主中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)。該發(fā)明為對(duì)潮霉素、G418等真菌抗生素都有很強(qiáng)抗性的產(chǎn)甘油假絲酵母提供了方便易得又廉價(jià)的轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)該載體又能應(yīng)用于釀酒酵母、皺褶假絲酵母等酵母屬。為酵母的遺傳改造提供了有力工具。
文檔編號(hào)C12N15/65GK102286521SQ201110200440
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者方慧英, 諸葛健, 諸葛斌, 高曉娜 申請(qǐng)人:江南大學(xué)