專利名稱：一種實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測技術(shù)，具體地說，涉及一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
脊髓灰質(zhì)炎(poliomyelitis)是一種古老的疾病，是由脊髓灰質(zhì)炎病毒引起的一種急性傳染性疾病，其臨床表現(xiàn)多種多樣，主要有發(fā)熱、咽痛和肢體疼痛等，部分病人可發(fā)生弛緩性麻痹。脊髓灰質(zhì)炎病人，由于脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元受損，與之有關(guān)的肌肉失去了神經(jīng)的調(diào)節(jié)作用而發(fā)生萎縮，同時(shí)皮下脂肪，肌腱及骨骼也萎縮，使整個(gè)機(jī)體變細(xì)。流行時(shí)以隱匿感染和無癱瘓病例為多。由于兒童發(fā)病比例較成人為高，在普種疫苗前以嬰幼兒患病為主，故又稱小兒麻痹癥(Infantile paralysis)。人是脊髓灰質(zhì)炎病毒唯一的自然宿主，本病通過直接接觸傳染，是一種傳染性很強(qiáng)的接觸性傳染病，隱形感染者以及輕癥癱瘓型病人是本病的主要傳染源，在大規(guī)模流行時(shí)，隱性感染與臨床病例的比例超過100:1。脊髓灰質(zhì)炎病毒以糞-口感染為主要傳播方式，發(fā)病前3飛天至發(fā)病后1周患者鼻咽部分泌物及糞便均可排出病毒，少數(shù)病倒糞便帶毒時(shí)間可長達(dá)3、月；密切生活接觸，不良衛(wèi)生習(xí)慣都可導(dǎo)致病毒的大面積擴(kuò)散。脊髓灰質(zhì)炎的感染以隱性感染(占99%以上)為主，以發(fā)熱，咽痛，肢體疼痛等非特異性癥狀為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重可以出現(xiàn)癱瘓以及機(jī)體萎縮等前角神經(jīng)元受損的癥狀。癱瘓病例中，90%以上發(fā)生于5歲以前。經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)環(huán)境衛(wèi)生和個(gè)人衛(wèi)生習(xí)慣的進(jìn)步導(dǎo)致感染的年齡往往推遲，年長兒和青年人仍然是易感者，目前夏季流行在年長小兒中呈現(xiàn)一定的上升趨勢。本病廣泛分布于全世界，溫帶地區(qū)流行高峰在5 10月，熱帶地區(qū)終年可見。1988 年世界衛(wèi)生組織提出2000年全球消滅脊髓炎，1989年又提出消滅本病的行動計(jì)劃，由于減毒活疫苗的應(yīng)用，發(fā)病率已明顯下降。雖然我國已經(jīng)響應(yīng)世界衛(wèi)生站組織號召進(jìn)行了強(qiáng)制接種免疫，但是我國仍為流行地區(qū)。且近些年來，脊髓灰質(zhì)炎減毒疫苗突變導(dǎo)致的脊髓灰質(zhì)炎感染事件時(shí)見報(bào)道，而水產(chǎn)食品以及蔬菜引發(fā)的脊髓灰質(zhì)炎病毒感染已經(jīng)引起食品安全部門的關(guān)注。脊髓灰質(zhì)炎病毒的核酸為單股正鏈RNA，已知基因組的長度約為7. 5kD。按其抗原性不同，將脊髓灰質(zhì)炎病毒分為1、2、3等3個(gè)血清型。它們的理化性質(zhì)基本相同，RNA的堿基組成也很相似。以上3個(gè)血清型的病毒RNA之間在核苷酸水平上有36% 52%的同源性。三種血清型的病毒都可以致病，其中導(dǎo)致癱瘓病例的主要是1型。脊髓灰質(zhì)炎初起時(shí)與傷風(fēng)感冒相類似，與其他病毒(柯薩奇病毒、?？刹《尽B病毒、流行性腮腺炎病毒、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒、流行性乙型腦炎病毒)感染所致的腦膜炎、化膿性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎、真菌性腦膜炎以及腦膜炎型鉤端螺旋體病等相鑒別。以及感染性多發(fā)性神經(jīng)根炎或稱格林-貝爾綜合征(Guillain-Barre ‘ s syndrome)臨床不易鑒別。目前對于脊髓灰質(zhì)炎的臨床實(shí)驗(yàn)室檢測主要分為三種，包括病毒分離培養(yǎng)，血清學(xué)檢測以及核酸檢測，其中以血清學(xué)和核酸檢測為主要手段，血清學(xué)檢測的診斷指標(biāo)為發(fā)病后1個(gè)月內(nèi)從患者腦脊液或血中查到抗脊髓灰質(zhì)炎病毒IgM抗體者；或恢復(fù)期患者血清中特異性IgG抗體滴度比急性期有4倍升高者；或腦脊液中特異性IgG抗體明顯升高，血液與腦脊液IgG抗體滴度比例失?；虻怪?在血腦屏障無損傷時(shí)，血腦脊液為200—400 1)者均有診斷價(jià)值。相對來說抗體的產(chǎn)生雖然具有診斷價(jià)值，但是對感染的早期判斷一般采取更敏感快速的PCR方法進(jìn)行診斷。近幾年國內(nèi)外相繼報(bào)道了檢測PVs的巢式rt-PCR、常規(guī)RT-PCR等快速檢測方法，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于病毒特征性核酸的檢測。 實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術(shù)，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置 (CCD)的PCR擴(kuò)增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平。CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，并通過軟件分析匯總到工作站得到擴(kuò)增曲線。一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光PCR的一種 (Martel 1, M. , J. Gomez, J. Esteban, S. Sauleda, J. Quer, B. Cabot, R. Esteban, and J. Guardia. 1999. High-throughput real-time reverse transcription—PCR quantitation of hepatitis C virus RNA. J. Clin. Microbiol. 37:327 - 332；Lee Cff, Suarez DL. 2004. Application of real-time RT-PCR for the quantitation and competitive replication study of H5 and H7 subtype avian influenza virus. J Virol Methods. 119 O) : 151-8。)，它是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比，不同之處在于前者在反應(yīng)體系中增加了逆轉(zhuǎn)錄酶，同時(shí)多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)步驟；相同之處在于兩者在反應(yīng)體系中均有一條兩端分別標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的探針，探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光的能量轉(zhuǎn)移給淬滅基團(tuán)，呈現(xiàn)淬滅效應(yīng)。 如果擴(kuò)增過程中有靶序列的存在，擴(kuò)增的過程中探針分子逐漸被水解切斷，熒光報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，熒光報(bào)告基團(tuán)發(fā)出熒光信號。 隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。傳統(tǒng)的RT-PCR由兩個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)程序或步驟完成，第一步是通過逆轉(zhuǎn)錄酶作用， 將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA ；第二步是在Taq酶作用下，以第一步中形成的cDNA為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。與傳統(tǒng)的RT-PCR相比較，一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1、將逆轉(zhuǎn)錄和 PCR擴(kuò)增兩個(gè)在不同反應(yīng)管中分開進(jìn)行的二個(gè)反應(yīng)程序合并成一個(gè)反應(yīng)程序，在一個(gè)PCR 反應(yīng)管中完全閉管完成檢測過程，大大節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間；2、通過對擴(kuò)增曲線以及對數(shù)增長期的循環(huán)閾值(Ct)的分析，摒棄普通PCR方法受多種因素干擾的終點(diǎn)分析方法，能夠?qū)z測樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量分析，從而有效監(jiān)測藥物治療的效果；3、將RNA逆轉(zhuǎn)錄、DNA擴(kuò)增與檢測三過程融合為一體，可以實(shí)時(shí)、動態(tài)監(jiān)測RNA擴(kuò)增的全過程，省掉了 PCR產(chǎn)物后處理過程， 大大縮短了結(jié)果分析時(shí)間，使得該方法更加快捷、方便；4、由于采取一種封閉的檢測模式， 從而減少了氣溶膠污染和由此造成的假陽性；5、由于在普通RT-PCR基礎(chǔ)上增加了一條可與模板互補(bǔ)配對的熒光探針，進(jìn)一步提高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術(shù)在RNA 樣品的檢測和分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的RT-PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。我國食品與藥品管理局(SFDA)已經(jīng)批準(zhǔn)了諸如Hiv-l、HCV等病原體的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒的生產(chǎn)與臨床應(yīng)用。因此，通過一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法開發(fā)一種檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒在技術(shù)上是可行的，它的應(yīng)用將極大滿足脊髓灰質(zhì)炎病毒快速檢測與監(jiān)測工作的需要。眾所周知，在使用已知的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)檢測和定量分析樣品中某特定靶核酸的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準(zhǔn)確性，一個(gè)關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)、篩選及制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽结?。本發(fā)明人在此基礎(chǔ)上利用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)發(fā)明了一種檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒，應(yīng)用于脊髓灰質(zhì)炎病毒的檢測和分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能提高定量分析的準(zhǔn)確性的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
1)使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖謩e對已知的脊髓灰質(zhì)炎病毒POl基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，通過嚴(yán)格的比對分析，在找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如Primer Express 3)選擇并設(shè)計(jì)寡核苷酸引物和探針。由于所設(shè)計(jì)的引物和探針均具有互補(bǔ)于脊髓灰質(zhì)炎病毒的序列，而且與其他病原體的核苷酸序列沒有同源性， 也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，所以避免了脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準(zhǔn)確度。初步選擇引物探針之后我們將引物探針分別進(jìn)行進(jìn)一步的序列比對，通過比對工具(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/) 的blastnr中進(jìn)行同源性檢索,棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物，也就是有可能形成錯配的引物。尤其選取跟脊髓灰質(zhì)炎病毒同源性較高的腸道病毒序列進(jìn)行進(jìn)一步比較，完全排除3 ‘端的同源性，確保引物探針的特異性。2)使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質(zhì)液相層析法(FPLC)純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)告基團(tuán))的6-FAM amidite,并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的BHQ。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。3)適宜于一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系。反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、2’ -脫氧核苷三磷酸、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物、能夠與雙鏈靶多聚核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物、能夠與靶多聚核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針、含有鎂離子的緩沖液。4)從待測樣本中提取RNA，分別加入前述的反應(yīng)體系中，直接經(jīng)一步法RT-PCR擴(kuò)增，從熒光擴(kuò)增曲線判斷是否存在脊髓灰質(zhì)炎病毒。本發(fā)明所得實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、 脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品；所述脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系包括脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中脊髓灰質(zhì)炎正向引物的序列為5’-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3' (SEQ NO. 1)，脊髓灰質(zhì)炎反向引物的序列為5’_ TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3，(SEQ NO. 2);所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中正、反向引物向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基。所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中脊髓灰質(zhì)炎寡核苷酸探針的序列為
5’- AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3’ (SEQ NO. 3)；
在上述試劑盒中，所述脊髓灰質(zhì)炎正、反向引物的濃度均為5 15 pmol/反應(yīng)，探針的濃度為5 15 pmol/反應(yīng)。在上述試劑盒中，所述RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀釋液組成。所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為1. 5 3. 5U/反應(yīng)、熱啟動Taq酶用量為3 7U/ 反應(yīng)、RNasin用量為15 25U/反應(yīng)、dNTPs濃度為0. 20mmol/L。在上述試劑盒中，酶系稀釋液為一般市售的酶系稀釋液；陰性質(zhì)控品為生理鹽水； 脊髓灰質(zhì)炎陽性質(zhì)控品為含有脊髓灰質(zhì)炎基因序列的重組假病毒，假病毒通過市售的逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系統(tǒng)構(gòu)建而成。相對于利用質(zhì)粒DNA作為陽性模版的標(biāo)準(zhǔn)品來說，由逆轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建的陽性指控品完全模擬了實(shí)際情況，為衣殼和包膜包裹的RNA片段，可以為實(shí)驗(yàn)的全過程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆轉(zhuǎn)錄，以及最后的核酸擴(kuò)增進(jìn)行陽性參照。陽性質(zhì)控品濃度均為IX IO6拷貝/ml。在上述試劑盒中，所述RT-PCR反應(yīng)液包括一步法RT-PCR反應(yīng)緩沖液和DEPC水， 其中一步法 RT-PCR 反應(yīng)緩沖液包含 10 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、150 mmol/L KCl, 2. Ommo 1/L MgCl20在上述試劑盒中，其中用于PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)間為50°C逆轉(zhuǎn)錄 15min，1個(gè)循環(huán)；94°C lOmin，1個(gè)循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個(gè)循環(huán)(收集熒
光信號)。在上述試劑盒中，試劑盒的待檢樣品優(yōu)選是糞便、腦脊液及血清等樣品。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明提供了使用一步法實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR技術(shù)檢測樣品中脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒，其基本原理是利用一對寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、熱啟動Taq酶、RNA酶抑制劑 (RNasin)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNIPs)以及Mg2+等RT-PCR反應(yīng)緩沖液中，通過 DA7600、ABI7500等市售的熒光PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶多核苷酸的循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到快速、實(shí)時(shí)、定量檢測靶多核苷酸的目的。本發(fā)明分別針對脊髓灰質(zhì)炎病毒Pol基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針，可檢測出脊髓灰質(zhì)炎病毒，包括I、II、III型，但不能檢測出腸道病毒EV71，科薩奇病毒Α16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型，?？刹《緲颖净蚱渌粑啦≡w樣本，說明本試劑盒具有很好的特異性。本發(fā)明提供的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒可以檢測糞便、腦脊液及血清等樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒；可為靈敏、快速早期診斷脊髓灰質(zhì)炎病毒感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道樣本以及血清等樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行早期快速診斷。本試劑盒可以檢測出脊髓灰質(zhì)炎病毒的最低濃度為1.0Χ102 copies /ml，說明本試劑盒具有非常好的靈敏度。


圖1顯示脊髓灰質(zhì)炎陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品的檢測結(jié)果。從左到右曲線分別代表，脊髓灰質(zhì)炎病毒II型，I型，III型，以及陽性質(zhì)控品，陰性質(zhì)控品未見曲線。陽性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，成S型，可明確判定為陽性。陰性質(zhì)控品擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。圖2顯示特異性參考品的檢測結(jié)果。以腸道病毒EV71，科薩奇病毒A16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、?？刹《靖凶鳛樘禺愋詤⒖计?；以去離子水及健康人血清作為陰性質(zhì)控品，結(jié)果顯示均為陰性結(jié)果；6份特異性參考品的擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無交叉，沒有Ct值，可明確判定為陰性。圖3顯示靈敏度參考品的檢測結(jié)果。從左到右曲線分別為1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/mlU. OXlO2 copies /mlU. OXlO1 copies /ml 的含有脊髓灰質(zhì)炎病毒假病毒組成靈敏度參考品，生理鹽水作為陰性對照未見曲線。5份靈敏度參考品中除了濃度為 1.0X101 copies /ml的脊髓灰質(zhì)炎假病毒樣品外擴(kuò)增曲線平直或斜向下且與基線無交叉， 沒有Ct值，可明確判定為陰性。其余樣本均可明確判定為陽性。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例旨在舉例說明而不是限制本發(fā)明。實(shí)施例1 脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測試劑的研制
1、引物和探針的設(shè)計(jì)通過對已報(bào)導(dǎo)脊髓灰質(zhì)炎病毒的核酸序列進(jìn)行序列比對分析， 以脊髓灰質(zhì)炎病毒Pol基因?yàn)閿U(kuò)增靶位點(diǎn)，選擇無二級結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)計(jì)的基本原則，利用軟件和人工設(shè)計(jì)多對引物和探針。2、臨床樣本的選擇根據(jù)國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，可以糞便、腦脊液及血清等樣
P
ΡΠ
3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化
樣品的準(zhǔn)備以構(gòu)建的含有目的擴(kuò)增區(qū)域的假病毒作為脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測的陽性質(zhì)控品；以腸道病毒EV71，科薩奇病毒A16，乙型腦炎病毒，流感病毒A型，流感病毒B型、?？刹《靖凶鳛樘禺愋詤⒖计罚灰匀ルx子水及健康人血清作為陰性質(zhì)控品，分別提取上述陽性質(zhì)控品與特異性參考品的RNA，陰性質(zhì)控品待用。引物探針的篩選以上述1中設(shè)計(jì)的多組引物探針分別檢測上述的陽性質(zhì)控品與陰性參考品的RNA，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出特異性、靈敏度和重復(fù)性好的最佳引物探針組合。 (如序列表中 SEQ ID NO 1 SEQ ID NO :3)。引物探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從2pmol/ 反應(yīng)至15pmol/反應(yīng)梯度的引物和從2pmol/反應(yīng)至15pmol/反應(yīng)濃度梯度的探針進(jìn)行PCR 反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)引物和探針濃度在5 15 pmol/反應(yīng)之間均可，其中最佳的引物濃度為5pmol/反應(yīng)、探針濃度為5pmol/反應(yīng)。鎂離子濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L 至2. 5mmol/L濃度梯度的鎂離子進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的鎂離子濃度為 2. Ommol/Lο
熱啟動Taq酶用量的優(yōu)化在25 μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從IU (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的熱啟動Taq酶用量為3 7U/反應(yīng)。RT酶用量的優(yōu)化在25 μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從IU(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的RT 酶用量為1. 5 3. 5U/反應(yīng)。RNasin用量的優(yōu)化在25 μ L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的 RNasin用量為15 25U/反應(yīng)。dNTPs濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmol/L 至0. 25mmol/L濃度梯度的dNIPs進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的dNIPs 濃度為 0. 20mmol/Lo反應(yīng)溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的反應(yīng)溫度和時(shí)間為50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，l 個(gè)循環(huán)；94°C 10min，l個(gè)循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個(gè)循環(huán)(收集熒光信號)。實(shí)施例2 脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測試劑盒及其使用
1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50ml /管)1管、脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液(50 μ 1/管)1管、RT-PCR反應(yīng)液(720 μ 1/管)1管、RT-PCR酶系(150 μ 1/管)1 管，陰性質(zhì)控品(200 μ 1/管)1管，脊髓灰質(zhì)炎陽性質(zhì)控品1管。2、標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存
由臨床醫(yī)師根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行標(biāo)本采集，可檢測的標(biāo)本包括，咽拭子、鼻咽分泌物、血清。采集方法如下①糞便樣品取適量標(biāo)本按比例制備樣品懸液，離心取上清，密封保存， 低溫送檢；②腦脊液采集時(shí)間為出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀后3d內(nèi)，采集量為1. 0 2. Oml0采集后立即裝入無菌帶墊圈的凍存管中，4°C下送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，-20°C以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標(biāo)本存于_70°C以下冰箱。；③血清無菌采集靜脈血約1ml，分別于室溫和4°C靜置2 小時(shí)和1小時(shí)后，離心(8，000 rpm，5分鐘)分離并收集血清標(biāo)本。標(biāo)本可立即用于測試，也可以保存于-70°C待測，保存期為6個(gè)月。標(biāo)本運(yùn)送采用 0°C冰壺。3、檢測步驟
(I)RNA提取
取上述類型的樣本各100 μ (樣品不足ΙΟΟμΙ時(shí)請補(bǔ)加適量生理鹽水重懸)，放置于 1.5ml滅菌離心管，加入200μ1 Trizol試劑及ΙΟΟμΙ氯仿，用振蕩器強(qiáng)力振蕩20秒后靜置 3分鐘；
2 8°C下12，OOOrpm離心lOmin，吸取上清至另一干凈的1. 5ml離心管；
加入0. 2ml氯仿，蓋緊蓋子，手動用力顛倒搖動15s (不可用振蕩器)，室溫孵育2 3
min ；
2 8°C下12000rpm離心15 min后，取最上層的上清液至另一干凈的1. 5ml離心管； 加入0. 5ml預(yù)冷的異丙醇，緩慢顛倒充分混勻后，一 20°C靜置15min，2 8 °C， 12000rpm離心10 min，小心棄盡上清液；加入Iml預(yù)冷的70 %的冰冷乙醇，手動顛倒數(shù)次洗滌沉淀，2 8°C，8000rpm離心 5min，小心棄盡上清液；
空氣或真空干燥5 10 min，加入50μ1 DEPC H2O, 55 60° C下孵育lOmin，手指輕輕彈打管底，使其充分溶解，直接用于實(shí)驗(yàn)或-70°C保存?zhèn)溆谩?2) PCR反應(yīng)與結(jié)果分析
分別取脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)液17 μ 1.RT-PCR酶系3 μ 1配制成脊髓灰質(zhì)炎反應(yīng)體系。取陰性質(zhì)控品、陽性質(zhì)控品各5 μ 1，加入脊髓灰質(zhì)炎反應(yīng)體系使用市售的熒光定量PCR儀(如ΑΒΙ7500)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是50°C逆轉(zhuǎn)錄15min，1個(gè)循環(huán)；94°C 10min，l個(gè)循環(huán)；最后95°C 15s，55 60°C 45s，45個(gè)循環(huán)(收集熒光信號)。反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 如擴(kuò)增曲線有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性，否則為陰性。實(shí)施例3 應(yīng)用脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測試劑盒檢測樣品
以實(shí)施例1中的陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品、特異性參考品作為待檢樣本，按照實(shí)施例2 的方法分別檢測這些樣本，陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果為陽性，陰性質(zhì)控品和特異性參考品檢測結(jié)果均為陰性(參見圖1，2)。實(shí)施例4 脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測試劑盒靈敏度實(shí)驗(yàn)
分別由濃度為 1. OXlO5 copies /ml、1. OXlO4 copies /mlU. OXlO3 copies/ml、 1.0X102 copies /ml、l.OXlO1 copies /ml的含有脊髓灰質(zhì)炎病毒假病毒組成靈敏度參考品，按照實(shí)施例2的方法分別檢測這5份樣本，檢測結(jié)果表明，本試劑盒的靈敏度為 1. OXlO2 copies /ml (見圖 3)。
權(quán)利要求
1.一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，其特征在于，所述脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系包括脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液、 RT-PCR反應(yīng)液和RT-PCR酶系；所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中脊髓灰質(zhì)炎正向引物的序列為 5，-GATGATTGCCTATGGTGATGATG-3，，脊髓灰質(zhì)炎反向引物的序列為5，-TCCTGATTGGGCTAGGAGACT -3’ ；所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中脊髓灰質(zhì)炎寡核苷酸探針的序列為5’_ AATTGCATCCTACCCCCATGAGGTTGAC -3’ 。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液中正、 反向引物向5’和3’端方向各延伸10個(gè)堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述脊髓灰質(zhì)炎正、反向引物的濃度均為5 15 pmol/反應(yīng)，探針的濃度為5 15 pmol/反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述RT-PCR酶系由逆轉(zhuǎn)錄酶、熱啟動 Taq酶、RNasin, dNTPs和酶系稀釋液組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述逆轉(zhuǎn)錄酶用量為1.5 3. 5U/ 反應(yīng)、熱啟動Taq酶用量為3 7U/反應(yīng)、RNasin用量為15 25U/反應(yīng)、dNTPs濃度為 0. 20mmol/Lo
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述陽性指控品為含有脊髓灰質(zhì)炎病毒檢測靶標(biāo)的假病毒懸液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測脊髓灰質(zhì)炎病毒的試劑盒，包括RNA提取試劑、脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，所述脊髓灰質(zhì)炎RT-PCR反應(yīng)體系包括脊髓灰質(zhì)炎引物探針混合液、RT-PCR反應(yīng)液和RT-PCR酶系。本試劑盒能快速、實(shí)時(shí)、定量檢測靶多核苷酸，可檢測出脊髓灰質(zhì)炎病毒，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型?？梢詸z測糞便、腦脊液及血清等樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒；可為靈敏、快速早期診斷脊髓灰質(zhì)炎病毒感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對咽拭子、鼻咽分泌物等呼吸道樣本以及血清等樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒進(jìn)行早期快速診斷。
文檔編號C12R1/93GK102344971SQ20111020069
公開日2012年2月8日 申請日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者李明, 杜紅延, 陳華云, 陳瑤, 高秀潔 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)