專(zhuān)利名稱(chēng)：利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
丁二酸(succinic acid)又稱(chēng)琥珀酸，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、染料、香料、油漆、 食品和塑料等行業(yè)，作為C4平臺(tái)化合物，可用于合成1，4_ 丁二醇、四氫呋喃、γ-丁內(nèi)酯等有機(jī)化學(xué)品以及聚丁二酸丁二醇酯(PBQ類(lèi)生物可降解材料，被美國(guó)能源部認(rèn)為是未來(lái) 12種最有價(jià)值的生物煉制產(chǎn)品之一。丁二酸的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，利用微生物發(fā)酵法轉(zhuǎn)化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由于原料來(lái)源廣泛且價(jià)格低廉，污染小，環(huán)境友好，且在發(fā)酵過(guò)程中可以吸收固定CO2,能有效緩解溫室效應(yīng)，開(kāi)辟了溫室氣體二氧化碳利用的新途徑，今年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。丁二酸的生產(chǎn)菌株主要集中在Armerobiospirillum succiniciproducens^Actinobacillus succinogenes、Mannheimia succiniciproducens、 重組谷氨酸棒桿菌和重組五Coli0利用野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，阻礙了其工業(yè)化進(jìn)程。 E. coli由于遺傳背景清楚、易操作、易調(diào)控、培養(yǎng)基要求簡(jiǎn)單和生長(zhǎng)迅速等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛用于研究以獲得產(chǎn)丁二酸優(yōu)秀菌株。E. coli野生菌株生產(chǎn)丁二酸雖然獲得了較高的產(chǎn)物濃度，但培養(yǎng)過(guò)程培養(yǎng)基成本較高，且甲酸、乙酸等副產(chǎn)物積累較多，因此可以敲除或失活其中的乳酸脫氫酶(LDH)基因和丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)基因活性以減少副產(chǎn)物的生成。但是，由于敲除了 PFL基因，導(dǎo)致菌株不能生產(chǎn)乙酸，從而使伴隨乙酸生成的ATP減少，最終導(dǎo)致重組大腸桿菌不能利用木糖代謝生長(zhǎng)，并且生產(chǎn)丁二酸。玉米芯是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中比較常見(jiàn)的廢棄物，由于其成分含有大量纖維素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此大腸桿菌Nzmii不能利用玉米芯水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸。姜岷等將玉米芯按料液比1 5 (質(zhì)量體積比)配制玉米芯料液，物料粒徑250 380 μ m, H2SO4用量3% (體積分?jǐn)?shù))，水解溫度126°C，反應(yīng)時(shí)間215 h，利用活性炭吸附及Ca (OH) 2中和等方式，對(duì)玉米芯多組分糖液進(jìn)行脫毒脫鹽處理，總糖質(zhì)量濃度為50 g/L，其中木糖占80%以上。稻草秸稈是重要的一類(lèi)可再生生物質(zhì)資源。目前，除了在造紙業(yè)工業(yè)方面的利用， 絕大多數(shù)被廢棄，嚴(yán)重浪費(fèi)了資源并且污染了環(huán)境。其主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此不能利用木糖的大腸桿菌菌株不能利用稻草秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，陶文沂等通過(guò)稀硫酸121°C處理稻草秸稈1 h，再用20 g/L的NaOH于121°C處理秸稈1 h，葡萄糖和木糖二者總質(zhì)量濃度都達(dá)50 g/L左右。甘蔗渣是甘蔗制糖時(shí)榨糖之后剩下的主要成分，因此其水解液對(duì)微生物發(fā)酵來(lái)說(shuō)，是一種很好的可持續(xù)利用的綠色碳源，但其水解液含有高濃度木糖，因此不能利用木糖的大腸桿菌菌株不能利用稻草秸稈水解液發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸，約含有50%的纖維素通過(guò)粉碎以及堿/氧化法預(yù)處理可得到總糖質(zhì)量為50 g/L，其中木糖占80%以上。在大腸桿菌磷酸烯醇式丙酮酸通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶生成草酰乙酸，在此過(guò)程中沒(méi)有ATP的生成，但是在feciBm subtilis中，磷酸烯醇式丙酮酸是通過(guò)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶生成草酰乙酸的，在此過(guò)程中有ATP的生成，并且Millard等在大腸桿菌中過(guò)量表達(dá)五COli /7/7C和/7Ci，研究發(fā)現(xiàn)過(guò)量表達(dá)/7/7C可以使琥珀酸作為混合酸發(fā)酵的主要產(chǎn)物，且產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高3. 5倍，而過(guò)量表達(dá)對(duì)發(fā)酵結(jié)果沒(méi)有影響，但在/7/7C缺陷菌株中，/X^的過(guò)量表達(dá)能夠提高琥珀酸的產(chǎn)量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)目的在于提供了一種基于ATP生物合成系統(tǒng)改造后的大腸桿菌菌株的構(gòu)建方法，達(dá)到菌株的構(gòu)建方法簡(jiǎn)單方便，構(gòu)建得到的菌株發(fā)酵方法簡(jiǎn)單可行，易于工業(yè)化，產(chǎn)酸能力強(qiáng)的目的，從而大大降低了生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因Qi/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五C^i NzmiI菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏 IdhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株；
(2)單獨(dú)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(Pd)基因，以及選擇自蘋(píng)果酸酶Cs/d)基因、蘋(píng)果酸脫氫酶基因或丙酮酸羧化酶Oy^)基因這三種基因中的一種，構(gòu)建得到單獨(dú)過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋(píng)果酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種的表達(dá)質(zhì)粒；
(3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(1)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；
(4)利用步驟(3)的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單獨(dú)過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋(píng)果酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到可利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌。具體的，利用本發(fā)明所述的上述方法可以細(xì)分為下述幾個(gè)具體方法。Α、過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，得到能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌Escherichia coli BA204 以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA \丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7i )活性的五coli NZNlll菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PPC)基因，得到同時(shí)缺乏ldhA、pflB和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5，端帶有酶切位點(diǎn)的引物，以Bacillus subtilis基因組DNA為模板，純化擴(kuò)增出的Pd基因后，表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶雙酶切、 連接獲得重組質(zhì)粒pTrC99a-/7d ；將質(zhì)粒pTrC99a-/7d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為 Escherichia coli BA204 ；利用federicAia coli BA204過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。B、過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸酶，得到能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸的大腸桿菌fecAericAia coli BA205
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7^/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五coli NZNlll 菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏MhA、pflB 和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以feciBm subtilis基因組DNA為模板， 純化擴(kuò)增出的pci基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrcgga-s/d用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTr￠:99^1-5/^-/74 ；
將質(zhì)粒導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA205 ；
利用fecAericAia coli BA205共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。C、過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸脫氫酶，使其能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸，獲得大腸桿菌fecAericAia coli BA206
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7^/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五coli NZNlll 菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏MhA、pflB 和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以feciBm subtilis基因組DNA為模板， 純化擴(kuò)增出的Pd基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrC99a- i/A用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒x^d-mdh-pck ；
將質(zhì)粒命dmdh-pck導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA206 ； 利用fecAericAia coli BA206共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸脫氫酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。D、過(guò)量共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，使其能夠高效利用木糖生長(zhǎng)并產(chǎn)丁二酸，獲得大腸桿菌fecAericAia coli BA207
以缺乏乳酸脫氫酶基因(7^/似)，丙酮酸甲酸裂解酶基因(/7/7召)活性的五coli NZNlll 菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因，得到同時(shí)缺乏MhA、pflB 和PPC的感受態(tài)菌株；
合成一對(duì)5’端帶有相同酶切位點(diǎn)的引物，以feciBm subtilis基因組DNA為模板， 純化擴(kuò)增出的Pd基因后，已構(gòu)建的重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc用與引物所設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)一致的酶單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7c々；
將質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA207 ； 利用fecAericAia coli BA207共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力。
本發(fā)明的有益效果在于
首先，厭氧發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)大量諸如乙酸等對(duì)菌株有毒害作用的副產(chǎn)物，因此考慮兩階段發(fā)酵方式，有氧階段提高生物量，厭氧階段進(jìn)行產(chǎn)酸發(fā)酵。也可以選擇性地采用膜分離技術(shù)，達(dá)到分離菌體的目的，再進(jìn)而用于厭氧發(fā)酵。具體步驟如下采用兩階段發(fā)酵模式，劃線-80°C凍存管保藏的菌液到含有氨芐青霉素的平板，挑取平板上長(zhǎng)出的單菌落到5 ml LB 培養(yǎng)基的試管，1% (ν/ν)接種量接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 8-1. 0左右時(shí)用 0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D_=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵。發(fā)酵結(jié)果表明，新構(gòu)建的和大腸桿菌ATP生物合成途徑有關(guān)的基因工程菌fecAericAia coli BA 204、 Escherichia coli BA 2臨、Escherichia coli BA 2晚私 Escherichia coli BA 207 恢復(fù)了厭氧條件下代謝木糖的能力，并高效利用木糖產(chǎn)丁二酸。其次，本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)手段改造大腸桿菌的ATP生物合成途徑，提高ATP供給，補(bǔ)充木糖轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過(guò)程中的能量供給，使重組大腸桿菌能夠持續(xù)利用木糖生長(zhǎng)并使其高效合成丁二酸的方法未見(jiàn)公開(kāi)，而這種應(yīng)用將大大推進(jìn)丁二酸產(chǎn)業(yè)的進(jìn)步和發(fā)展。


圖1 重組質(zhì)粒pTrc99a-/7d的構(gòu)建圖譜。
圖2 1■組質(zhì)粒pTr-pck的構(gòu)建圖譜。
圖3]■組質(zhì)粒x^d-mdh-pck的構(gòu)建圖譜。
圖4]■組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7d的構(gòu)建圖譜。
圖5 PCR產(chǎn)物/74的瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖。
圖6 1■組質(zhì)粒pTrc99a-/7ci的單雙酶切鑒定圖。
圖7]■組質(zhì)粒pTrcgga-s/^的單雙酶切鑒定圖。
圖8 1■組質(zhì)粒的單雙酶切鑒定圖。
圖9 1■組質(zhì)粒pTrc99a-/7_Fc-/7d的單雙酶切鑒定圖。
具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明，但對(duì)本發(fā)明沒(méi)有限制。本發(fā)明所述的安普霉素抗性基因的來(lái)源是pIJ773，獲得自南京師范大學(xué)邵蔚藍(lán)教授處。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)表達(dá)λ重組酶的質(zhì)粒的來(lái)源是pKD46，購(gòu)自htrovegen 公司。本發(fā)明所述的能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒的來(lái)源是pCP20，購(gòu)自htrovegen 公司。本發(fā)明所述的Bacillus subtil is基因組的來(lái)源是購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。本發(fā)明所述的表達(dá)質(zhì)粒用pTrc99a的來(lái)源是購(gòu)自htrovegen公司。本發(fā)明所述的出發(fā)菌株萬(wàn).co/i NZmil的來(lái)源是Biotechnol Bioeng，2001, 74:89 95。實(shí)施例1
6本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株Escherichia coli BA204。1、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因Qpfm活性的五coli Nzmii菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因，得到同時(shí)缺乏 IdhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株。利用同源重組技術(shù)敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因以?xún)蓚?cè)帶有FRT位點(diǎn)的安普霉素抗性基因?yàn)槟０?，利用高保真PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，并設(shè)計(jì)兩端帶有PPC同源片段的擴(kuò)增引物，成功擴(kuò)增出線性DNA同源片段；在出發(fā)菌株NZmil中導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)表達(dá)λ重組酶的質(zhì)粒，使在電轉(zhuǎn)入線性DNA片段后，可以抑制菌體內(nèi)部的核酸外切酶，防止線性片段的分解，同時(shí)進(jìn)行同源重組，通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性重組子；導(dǎo)入能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生FLP重組酶的質(zhì)粒，在誘導(dǎo)后，利用一對(duì)平板，進(jìn)行平行點(diǎn)樣，能夠在無(wú)抗性平板上生長(zhǎng)，但不能在抗性平板上生長(zhǎng)的均極為已經(jīng)敲除抗性的NZmil菌株。2、構(gòu)建過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括 (1)合成帶有SacI和Xba I酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CGAGCTCATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3，； 下游引物5，- GCTCTAGAGCATTCCGTCAATTAAAACAAG -3，。(2)議Bacillus subtil is基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，;35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的Pd基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrc99a分別用feci和損al雙酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 pTrc99a_/ d3、將質(zhì)粒pTrC99a-/7d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA204。實(shí)施例2
本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株federicAia coli BA205。1、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因Qpfm活性的五coli Nzmii菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因，得到同時(shí)缺乏 ldhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例1)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括 (1)合成上下游都帶有Η η 11酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3，； 下游引物5，- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2)以Bacillus subtil is基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，;35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的Pd基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrcgga-s/bJ分別用歷idIII單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 ρ Tr c 9 9 asfcA -pck。3、將質(zhì)粒pTrcgga-s/d-zx^導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coliBA205。實(shí)施例3
本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株federicAia coli BA206。1、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因Qpfm活性的五coli Nzmii菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因，得到同時(shí)缺乏 ldhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例1)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和蘋(píng)果酸脫氫酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括
(1)合成上下游都帶有Η η 11酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3，； 下游引物5，- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2)以Bacillus subtil is基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，;35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的Pd基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a- i/A分別用Λ /7 /ΙΙΙ單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 ρ Tr c 9 9 -mdh -pck。3、將質(zhì)粒vhcU-pck導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA206。實(shí)施例4
本實(shí)施例說(shuō)明構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表達(dá)質(zhì)粒，恢復(fù)重組菌株在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到菌株federidia coli BA207。1、以缺乏乳酸脫氫酶基因UdhA),丙酮酸甲酸裂解酶基因Qpfm活性的五coli Nzmii菌株為出發(fā)菌株，敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(ppc)基因，得到同時(shí)缺乏 ldhA,pfIB和PPC的感受態(tài)菌株(同實(shí)施例1)。2、構(gòu)建共表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶和丙酮酸羧化酶的表達(dá)質(zhì)粒，其過(guò)程包括
(1)合成上下游都帶有Η η 11酶切位點(diǎn)的引物，
上游引物5’ - CCCAAGCTTATGAACTCAGTTGATTTGACCG -3，； 下游引物5，- CCCAAGCTTGCATTCCGTCAATTAAAACAAG-3，。(2)以Bacillus subtil is基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增目的基因片段，反應(yīng)條件為94°C，5 min ； (94°C 45 s，55°C 45 s，72°C 100 s，;35 個(gè)循環(huán))；72°C，10 min。純化擴(kuò)增出的Pd基因和表達(dá)質(zhì)粒pTrC99a-/7_Fc分別用Λ /7 /ΙΙΙ單酶切、連接獲得重組質(zhì)粒 ρ Tr c 9 9 -pyc -pck。3、將質(zhì)粒pTrC99a-/7_FC-/7d導(dǎo)入之前消除安普霉素抗性，已敲除磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PPC)基因的NZmil菌株的感受態(tài)，獲得的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子即為fecAericAia coli BA207。實(shí)施例5
本實(shí)施例說(shuō)明實(shí)施例1的新構(gòu)建的重組大腸桿菌BA204與出發(fā)菌株大腸桿菌NZmil發(fā)酵產(chǎn)酸能力的對(duì)比。大腸桿菌federicAia coli BA204能夠高效利用木糖發(fā)酵，并大量積累丁二酸， 采用兩階段發(fā)酵方式，其特征在于按1% (ν/ν)接種量從凍存管接入三角瓶中，當(dāng)有氧培養(yǎng)菌體OD6tltl至0. 4 0. 6左右用0. 3 mM的IPTG誘導(dǎo)至0D6(1(1=3左右時(shí)，按接種量10%轉(zhuǎn)接至血清瓶中厭氧發(fā)酵，發(fā)酵48 h。有氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+ Amp (氨芐青霉素50 μ g/mL)。厭氧階段培養(yǎng)基為L(zhǎng)B+木糖QO g/L) +堿式碳酸鎂0.48 g+Amp (氨芐青霉素50 μ g/mL)+0. 3 mM IPTG。發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表1。表1 Escherichia coli BA204與出發(fā)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的結(jié)果比較
權(quán)利要求
1. 一種利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟(1)以缺乏乳酸脫氫酶基因，丙酮酸甲酸裂解酶基因活性的大腸桿菌菌株為出發(fā)菌株， 敲除其中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因，得到同時(shí)缺乏ldhA、pflB勒PPC的感受態(tài)菌株；(2)單獨(dú)純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，或者純化擴(kuò)增出磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶基因，以及選擇自蘋(píng)果酸酶基因、蘋(píng)果酸脫氫酶基因或丙酮酸羧化酶基因這三種基因中的一種，構(gòu)建得到單獨(dú)過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋(píng)果酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種的表達(dá)質(zhì)粒；(3)將步驟(2)所述的質(zhì)粒導(dǎo)入步驟(1)得到的感受態(tài)菌株，獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子；(4 )利用步驟(3 )的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單獨(dú)過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，或者過(guò)量表達(dá)磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，以及選擇自蘋(píng)果酸酶、蘋(píng)果酸脫氫酶或丙酮酸羧化酶這三種酶中的一種，恢復(fù)其在厭氧條件下代謝木糖的能力，得到可利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸基因工程菌。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及利用木糖代謝產(chǎn)丁二酸大腸桿菌基因工程菌的構(gòu)建方法及其發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。本發(fā)明通過(guò)分子生物學(xué)手段改造大腸桿菌的ATP生物合成途徑，過(guò)量表達(dá)與該途徑有關(guān)的酶的活性，有效的提高了大腸桿菌胞內(nèi)ATP的總量，使重組大腸桿菌能夠利用木糖代謝生長(zhǎng)，大幅度提高了丁二酸的合成效率。
文檔編號(hào)C12P7/46GK102296082SQ20111020074
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月18日
發(fā)明者劉嶸明, 姜岷, 梁麗亞, 陳可泉, 韋萍, 馬江鋒 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)