專(zhuān)利名稱(chēng)：豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因工程疫苗，尤其是一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，在最大程度上得益于科技的進(jìn)步，但同時(shí)也帶來(lái)了隱患?？萍嫉倪M(jìn)步使養(yǎng)殖業(yè)向集約化和工廠化發(fā)展，畜禽對(duì)病原微生物的易感性增加，病害頻繁發(fā)生， 交叉感染，混合感染嚴(yán)重，在生產(chǎn)上造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，大型集約化豬場(chǎng)的相繼出現(xiàn)，疾病問(wèn)題也接踵而至， 各種畜禽疾病頻繁發(fā)生，由于各養(yǎng)殖場(chǎng)的技術(shù)力量參差不齊，診斷檢測(cè)設(shè)備也很有限，導(dǎo)致許多臨床獸醫(yī)在用藥方面較為混亂，濫用和無(wú)針對(duì)性的用藥問(wèn)題成為普遍現(xiàn)象。如此就進(jìn)一步促使細(xì)菌耐藥株不斷產(chǎn)生，畜禽疾病的預(yù)防和治療更加困難，甚至治療無(wú)效。眾所周知，病毒性傳染病至今尚未有效的治療辦法，一旦爆發(fā)，只能立即剖殺、隔離。近幾年來(lái)因各種疾病死亡的畜禽至少占飼養(yǎng)總數(shù)的8 10%。因此對(duì)于烈性傳染病重在預(yù)防。目前病毒性傳染病主要靠疫苗接種預(yù)防和治療，為此我國(guó)投入了大量人力、財(cái)力開(kāi)發(fā)各種疫苗產(chǎn)品， 對(duì)控制疾病流行起到了關(guān)鍵作用。針對(duì)目前國(guó)內(nèi)養(yǎng)殖業(yè)的用藥狀況，迫切需要研制一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，以滿足廣大養(yǎng)殖業(yè)和臨床獸醫(yī)需求。豬偽狂犬病(PRV)和豬細(xì)小病毒病(PPV)均是引起豬繁殖障礙的主要病原，PRV和 PPV引起的疾病在我國(guó)有很高的感染率和發(fā)病率，給養(yǎng)豬企業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。此外，兩者在臨床上混合感染的現(xiàn)象也多有報(bào)道。傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗在這兩種疾病的預(yù)防控制中起到了一定的作用，但是各種疫苗均有不同程度的缺陷和不足，如弱毒疫苗存在發(fā)生重組及毒力返強(qiáng)的潛在威脅，滅活疫苗免疫效果不穩(wěn)定等。為了更好的控制PRV和PPV感染， 急需研制一種更加安全有效的PRV-PPV 二價(jià)基因工程活載體疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種安全有效的豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗。本發(fā)明還提供了該疫苗的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其主要材料由豬細(xì)小病毒的 VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細(xì)胞等組成；該疫苗由豬細(xì)小病毒的VP2基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經(jīng)病毒篩選而得。所述豬細(xì)小病毒的VP2基因是由豬細(xì)小病毒通過(guò)PCR擴(kuò)增而得；所述豬偽狂犬病毒載體為基因缺失載體。上述基因工程活載體疫苗的制備方法，包括如下步驟
①以豬細(xì)小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因；
②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質(zhì)粒；③將構(gòu)建的PCK-VP2質(zhì)粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞；
④篩選得到豬細(xì)小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。然后對(duì)篩選得到的病毒進(jìn)行純化和鑒定、對(duì)重組病毒進(jìn)行生物學(xué)特性研究及病毒滴度的測(cè)定、用重組病毒進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。目前我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)養(yǎng)殖環(huán)境差、疫病交叉感染嚴(yán)重，生豬免疫力低下，在大量使用抗生素等化學(xué)藥品后，造成豬肉肉質(zhì)欠佳、藥物殘留嚴(yán)重。這一系列問(wèn)題不僅給我國(guó)的養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大損失，影響我國(guó)的生豬出口，也為廣大人民群眾的健康埋下了隱患。研制豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗疫苗，將利于提高我國(guó)農(nóng)村生豬的養(yǎng)殖水平， 改善養(yǎng)豬業(yè)的現(xiàn)狀。本發(fā)明通過(guò)采用基因工程、細(xì)胞工程等先進(jìn)技術(shù)，研發(fā)豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，利用偽狂犬病毒(PRV)作基因表達(dá)載體，將具有良好免疫原性的豬細(xì)小病毒(PPV) VP2基因插入該載體中使其毒力相關(guān)基因缺失而構(gòu)建重組載體，將該重組載體與偽狂犬病毒基因組重組進(jìn)而得到重組病毒。該疫苗的生產(chǎn)技術(shù)具有安全、穩(wěn)定、可規(guī)?；葍?yōu)點(diǎn)，疫苗能夠達(dá)到良好的預(yù)防效果。本疫苗的研制和應(yīng)用，開(kāi)拓了生物醫(yī)藥研發(fā)的新方向，使新一代動(dòng)物生物制品更加安全、廉價(jià)、使用方便，有利于促進(jìn)我國(guó)生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，造福廣大人民，對(duì)促進(jìn)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)進(jìn)步意義重大，具有很好的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。


圖1為VP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳圖，圖1中M為Mark2000，1-6 為VP2基因PCR產(chǎn)物；
圖2為構(gòu)建的重組質(zhì)粒PCK- VP2酶切鑒定結(jié)果，圖2中M為Mark，1為構(gòu)建的重組質(zhì)粒，2為重組質(zhì)粒雙酶切鑒定；
圖3為重組病毒PCK-VP2-PRV的酶切鑒定結(jié)果，圖3中M和4為Mark, 1-3為重組病毒的BamHI和Kpn I雙酶切；
圖4為重組病毒PCK-VP2-PRV的PCR鑒定結(jié)果，圖4中M為Mark，1-2為重組病毒的 PCR鑒定。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例所用LB液體培養(yǎng)基組成為1% 胰蛋白胨、1%氯化鈉和0. 5%酵母提取物；LB固體培養(yǎng)基組成為1%胰蛋白胨、1%氯化鈉、 0. 5%酵母提取物和1. 5%瓊脂。實(shí)施例1
一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗的制備方法，其包括如下步驟 ①以豬細(xì)小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因，具體為 根據(jù)Anal. Ranz等報(bào)道的豬細(xì)小病毒NADL-2株病毒基因組序列設(shè)計(jì)了一對(duì)包含其結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的PCR引物，上游引物Pl帶有BamH I酶切位點(diǎn)，下游引物P2帶有Kpn I 酶切位點(diǎn)。引物委托寶生物工程(大連)有限公司合成。引物序列如下
Pl 5' -TT GGA TCC ATG GCA ACC TCA CCA CC-3'(劃線處為 BamH I 酶切位點(diǎn))
4P2 5' -TACA GGT ACC GTA AAC ACA TGA GAG CTTG-3‘(劃線處為 Kpn I 酶切位點(diǎn)) 以PI、P2為引物，以豬細(xì)小病毒NADL-2株病毒基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)采用50 μ L反應(yīng)體系，在50 μ L反應(yīng)體系中加入10XPCR buffer 5 μ L，dNTP 2yL，模板 1口1^，上、下游引物各14 1^，Taq酶0. 5 μ L，滅菌水39. 5 μ L，總體積50 μ L。反應(yīng)參數(shù)為 95°C預(yù)變性5min后進(jìn)入循環(huán)，95°C變性lmin，52°C退火50S，72°C延伸1. 5min, 35個(gè)循環(huán)后，72°C再延伸lOmin，擴(kuò)增得到1780bp，結(jié)果見(jiàn)圖1。 ②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質(zhì)粒，具體為
用BanHI和Kpn I將PCR擴(kuò)增回收的VP2基因及目的載體PCK (購(gòu)于三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司)雙酶切，然后進(jìn)行連接，ΙΟμ 連接體系如下
權(quán)利要求
1.一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其特征在于，其主要材料由豬細(xì)小病毒的VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細(xì)胞組成；該疫苗由豬細(xì)小病毒的VP2 基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經(jīng)病毒篩選而得。
2.如權(quán)利要求1所述的基因工程活載體疫苗，其特征在于，所述豬細(xì)小病毒的VP2基因是由豬細(xì)小病毒通過(guò)PCR擴(kuò)增而得；所述豬偽狂犬病毒載體為基因缺失載體。
3.權(quán)利要求1或2所述基因工程活載體疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟①以豬細(xì)小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因；②將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中，得到PCK-VP2質(zhì)粒；③將構(gòu)建的PCK-VP2質(zhì)粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞；④篩選得到豬細(xì)小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬細(xì)小病毒重組偽狂犬病毒基因工程活載體疫苗，其主要材料由豬細(xì)小病毒的VP2基因、豬偽狂犬病毒載體和VERO細(xì)胞組成；該疫苗由豬細(xì)小病毒的VP2基因與豬偽狂犬病毒載體重組，再經(jīng)病毒篩選而得。具體方法如下先以豬細(xì)小病毒NADL-2株基因組為模板，PCR擴(kuò)增豬細(xì)小病毒VP2基因；然后將VP2基因克隆到豬偽狂犬病毒載體PCK中得PCK-VP2質(zhì)粒；再將構(gòu)建的PCK-VP2質(zhì)粒與偽狂犬病毒PRV基因組共轉(zhuǎn)染VERO細(xì)胞；最后篩選得到豬細(xì)小病毒病-豬偽狂犬病重組病毒PCK-VP2-PRV。試驗(yàn)證明其在仔豬體內(nèi)具有良好的免疫保護(hù)性。
文檔編號(hào)C12N15/869GK102266557SQ20111020315
公開(kāi)日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2011年7月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月20日
發(fā)明者吳寧鵬, 張遂平, 李奇, 李明魁, 楊慧敏, 王菊萍, 邵艷華, 郭芳茹 申請(qǐng)人:河南亞衛(wèi)動(dòng)物藥業(yè)有限公司