專利名稱：一種改進(jìn)的生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本技術(shù)屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種改進(jìn)的生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，以及β -甘露聚糖酶水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物細(xì)胞壁包含2種主要的多糖纖維素和半纖維素。由β -1,4-D-糖苷鍵連接的半纖維素主要由甘露聚糖組成。甘露聚糖大部分存在于初級(jí)植物細(xì)胞壁中，在次級(jí)細(xì)胞壁中含量較少。全世界每年產(chǎn)生大量含有甘露聚糖的農(nóng)業(yè)廢棄物。在東南亞，每年產(chǎn)生數(shù)百萬噸含有甘露聚糖的棕櫚仁餅。在南美洲，咖啡產(chǎn)業(yè)和椰子油產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生數(shù)百萬噸的咖啡廢物和椰子餅。棕櫚仁餅、椰子餅由于富含甘露聚糖等抗?fàn)I養(yǎng)因子，只能作為低級(jí)的反芻動(dòng)物飼料。β -甘露聚糖酶是一類能夠水解含β-1，4-甘露糖甘鍵的甘露寡糖和甘露多糖 (包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖等)的內(nèi)切水解酶。甘露聚糖酶處理過的棕櫚仁餅和椰子餅已經(jīng)顯示出良好的飼料價(jià)值，可以在畜禽飼料中使用。另外，甘露聚糖酶在造紙業(yè)和去污劑行業(yè)已經(jīng)有良好的作用。當(dāng)用包含甘露聚糖的生物材料生產(chǎn)生物燃料成為現(xiàn)實(shí)以后，甘露聚糖酶會(huì)越來越重要。畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)性酵母，能在普通培養(yǎng)基中產(chǎn)生較高細(xì)胞密度。它優(yōu)良的表達(dá)系統(tǒng)可以產(chǎn)生大量的酶和蛋白質(zhì)，比如,葡聚糖酶、木聚糖酶、鞣酸酶、植酸酶和甘露聚糖酶?，F(xiàn)有技術(shù)中，生產(chǎn)甘露聚糖酶的技術(shù)如下PCT W0/1999/024588公布了一個(gè)來源于番茄的具有編碼β-甘露聚糖內(nèi)切酶的cDNA克隆體，用啟動(dòng)子過度表達(dá)這個(gè)基因可以加快果實(shí)的成熟。PCT W0/1993/024622公布了一個(gè)編碼甘露聚糖內(nèi)切酶的木霉的DNA序列，并將其導(dǎo)入到酵母或者真菌，誘導(dǎo)產(chǎn)生甘露聚糖內(nèi)切酶，也是一種分離編碼甘露聚糖內(nèi)切酶基因的方法。PCT W0/2006/126589公布了蝸牛，尤其是太平洋鮑魚，產(chǎn)生的一種甘露聚糖酶的特性，以及適用于水產(chǎn)領(lǐng)域大量生產(chǎn)酶制劑的技術(shù)。PCT W0/2008/062317公布了咖啡豆產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶、編碼該蛋白的多核苷酸、表達(dá)系統(tǒng)以及含有該多核苷酸的宿主細(xì)胞。PCT W0/2001/098462和美國(guó)專利6，984，406公布了一株可產(chǎn)生在中性和酸性培養(yǎng)基中表現(xiàn)高酶活的甘露聚糖酶的芽孢桿菌菌株。甘露聚糖酶在飼料中用作添加劑，在半纖維素的分解中有很好的作用。PCT W0/2004/113538公布了一個(gè)地衣芽孢桿菌WL-12的編碼甘露聚糖酶的新基因，一個(gè)攜帶這個(gè)基因的重組質(zhì)粒以及一個(gè)包含重組質(zhì)粒的大腸桿菌轉(zhuǎn)化體。甘露聚糖酶把半乳甘露糖降解為甘露糖、甘露二糖和甘露三糖，酶在中性PH值和適當(dāng)溫度條件下具有較高的活性，這個(gè)條件是動(dòng)物生理?xiàng)l件相近。PCT W0/2003/012110 和美國(guó)專利 7,112,429 公布了 Acidothermuscellulolyticus產(chǎn)生的耐熱甘露聚糖酶。此項(xiàng)發(fā)明進(jìn)一步公布了制造ManA重組型的方式以及酶制劑在食品加工和食品添加劑中的應(yīng)用。PCT W0/1994/025576公布了棘孢曲霉CBS. 101. 43.產(chǎn)生的能表現(xiàn)甘露聚糖酶活的酶，認(rèn)為這種酶用于降解或者改良植物或藻類細(xì)胞壁材料。PCT W0/2008/009673揭示了一個(gè)野生型里氏木霉產(chǎn)生的甘露聚糖酶的突變體及其核酸和氨基酸序列，該突變體插入、刪除和/或替代了一段氨基酸，具有更高的熱穩(wěn)定性、蛋白水解穩(wěn)定性、比活性、低PH條件下的穩(wěn)定性。PCT W0/2000/077155,W0/1999/009126,ff0/2000/042146,and W0/1999/009128 公布了一個(gè)包含甘露聚糖酶的配方，提高對(duì)于食品、化妝品臟污以及增白劑可能更好的清潔性能。PCT W0/1995/014809公布了用甘露聚糖酶制備漂白纖維素紙漿的工藝。
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PCT W0/2001/062951 and W0/2001/064932公布了一個(gè)用乳化劑和甘露聚糖酶復(fù)合處理椰子柏生產(chǎn)改性椰子柏的工藝。通過這種方法，可以有效、經(jīng)濟(jì)的釋放甘露聚糖。PCT W0/2001/064830公布了一個(gè)含有纖維素內(nèi)切酶、木聚糖酶、β -甘露聚糖酶和/或α-淀粉酶的復(fù)合酶制劑處理方木中釀酒單寧酸的工藝。PCT W0/2003/062409公布了一個(gè)針對(duì)動(dòng)物飼料的至少含有2種耐熱酶的配方，
這2種酶是從葡聚糖內(nèi)切酶，木聚糖酶，植酸酶，蛋白酶，半乳聚糖酶，甘露聚糖酶，聚糖酶，a_半乳糖苷酶中篩選出來的。首選的木聚糖酶從曲霉，芽孢桿菌屬，腐質(zhì)霉屬，茶毒菌屬和木霉屬分離獲得。PCT W0/1996/036569公布了 I個(gè)阻止或者去除表面生物膜的配方，其中至少含有甘露聚糖酶，選擇性地和糖酶、蛋白酶、脂肪酶以及糖蛋白酶中的至少一種組合。PCT W0/2001/075084公布了從咖啡中獲得的至少可以編碼一種酶的DNA片段，這個(gè)酶可以水解由直鏈或支鏈甘露聚糖通過1，4_糖苷鍵連接組成的多糖。PCT W0/1994/020667公布了一種用酶預(yù)處理木材原材料的工藝，本處理可以減少機(jī)械打漿的能耗，提高纖維的性能，所用的酶為纖維二糖水解酶和甘露聚糖酶。PCT W01998/020750公布了甘露聚糖酶制劑在提高飼料植物蛋白原料價(jià)值的應(yīng)用。PCT W0/1997/041739公布了在低能飼料中添加半纖維素酶(如甘露聚糖酶)提高單胃動(dòng)物能量利用率的方法。PCT W0/2005/003319 and PCT W0/2007/095398 公布了甘露聚糖酶活性的多肽。美國(guó)專利7，148，399公布了從咖啡中獲得的至少可以編碼一種酶的DNA片段，這個(gè)酶可以水解由直鏈或支鏈甘露聚糖通過I，4-糖苷鍵連接組成的多糖。美國(guó)專利6，566，114公布了由芽孢桿菌1633基因編碼的新的甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶為堿性，可用作清洗劑成分，以及用在壓裂液中用于壓裂地層，用于改良植物材料，以及用于處理纖維織物。美國(guó)專利6，060，299公布了一個(gè)枯草芽孢桿菌168多核苷酸分子編碼產(chǎn)生的新甘露聚糖酶。該甘露聚糖酶為堿性，可用作清洗劑成分，用于改良植物材料，以及用于處理纖維織物。美國(guó)專利4，895，800描述了克隆載體；畢赤酵母中甲醇誘導(dǎo)啟動(dòng)子的使用以及變性蛋白的表達(dá)。有關(guān)在畢赤酵母中蛋白表達(dá)平臺(tái)的信息，比如，啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)化方法等，在美國(guó)專利 4，683，293 ;4，808，537 ;4，812，405 ;4，818，700 ;4，837，148 ;4，855，231 ;4，857，467 ；4，879，231 ;4，882，279 ;4，885，242 ;4，929，555 ;5，002，876 5，004，688 5，032，516 ；5，122，465 ;5，135，868 ;5，166，329 中可以見到。

發(fā)明內(nèi)容
首先，本發(fā)明提供了一種β -甘露聚糖酶的高產(chǎn)方法。包括以下步驟(I) 一種合成的甘露聚糖酶基因與DNA載體中的啟動(dòng)子結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)表達(dá)框；(2)將DNA載體接種到一個(gè)酵母細(xì)胞中，接種的酵母是巴斯德畢赤酵母，屬于畢赤酵母屬；(3)小規(guī)模培養(yǎng)條件下，通過測(cè)定β_甘露聚糖酶活性篩選出高表達(dá)菌株；(4)在500L的生物反應(yīng)器中，篩選高表達(dá)甘露聚糖酶的菌株，高表達(dá)甘露聚糖酶的菌株產(chǎn)生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。 表達(dá)框由一個(gè)指示β -甘露聚糖酶分泌到細(xì)胞外培養(yǎng)液中的信號(hào)肽組成。首選的信號(hào)肽是α -因子，β -甘露聚糖酶成熟肽被插入到完整α -因子編碼序列的下方，并且表達(dá)框與外膜蛋白進(jìn)行了結(jié)合，因而可以使表達(dá)的β_甘露聚糖酶分泌到細(xì)胞外，這有利于酶的獲得和活性的提高。其中β_甘露聚糖酶基因含有Seq IDl序列的主要部分，Seq IDl的多核苷酸序列號(hào)見序列表所不。β -甘露聚糖酶基因是一種含有與SeqIDl有至少85%同源性片段的多核苷酸。啟動(dòng)子是一個(gè)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，易受酒精誘導(dǎo)，作為巴斯德畢赤酵母的AOXl啟動(dòng)子最易受甲醇誘導(dǎo)。其次，本發(fā)明提供了一個(gè)改進(jìn)的水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的方法，水解后的產(chǎn)物為適合液體生物燃料生產(chǎn)和動(dòng)物飼用的游離糖。用β_甘露聚糖酶對(duì)甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的水解方法包括以下步驟(I)對(duì)含有甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等的底物進(jìn)行預(yù)處理。(2)將含有β_甘露聚糖酶的酶混合物的緩沖液和預(yù)處理后的底物進(jìn)行培養(yǎng)。預(yù)處理可以增加底物與酶的接觸機(jī)會(huì)；反應(yīng)時(shí)需向體系中添加一定量的緩沖液，并調(diào)節(jié)pH在4. 5-6. 5之間，最好為5. 5，然后再向預(yù)處理底物中添加低濃度的Mn2+、Co2+和Fe2+的鹽溶液，離子濃度大約在O. l-10mmol/L之間。酶的混合物含有甘露聚糖酶。水解的底物是富含甘露聚糖的棕櫚柏和椰子柏等。


圖I :不同金屬離子和化學(xué)試劑對(duì)甘露聚糖酶的影響。a代表與對(duì)照組相比差異顯著(P < O. 05)。圖2 :生物反應(yīng)器培養(yǎng)基中甘露聚糖酶的積累。2-9泳道分別表示甲醇誘導(dǎo)后24、36、48、50、64、76、96和108小時(shí)后收集的樣品。每一個(gè)泳道加入4μ I的培養(yǎng)基上清液。M泳道是Bio-Rad蛋白標(biāo)記(Catalog#161-0373)。I號(hào)泳道是誘導(dǎo)之前的培養(yǎng)基上清液。圖3A :甘露聚糖酶的最適pH值。被測(cè)pH值的變化范圍是I. 5-10.0，在其中確定最適pH。圖3B :不同pH值條件下甘露聚糖酶的穩(wěn)定性。在pHl. 0-10. O的緩沖液中培養(yǎng)I小時(shí)后的殘余酶活。
圖4A :甘露聚糖酶的最適溫度。在20_80°C的溫度范圍內(nèi)測(cè)定酶的活性，確定最適溫度。圖4B :甘露聚糖酶的熱穩(wěn)定性。在30°C、40°C、5(TC、6(rC和70°C溫度下培養(yǎng)150分鐘后的殘余酶活。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I : β -甘露聚糖酶基因的化學(xué)合成基因序列通過DNA Star程序分析，預(yù)測(cè)化學(xué)合成了一個(gè)編碼分子量為35. SkDa含有355個(gè)氨基酸的甘露聚糖酶前體蛋白基因，這個(gè)前體蛋白能在Glyl8和Alal9之間被切開，產(chǎn)生一個(gè)分子量為35.8kDa的由317個(gè)氨基酸組成的成熟蛋白。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)甘露聚糖酶進(jìn)行blast序列比對(duì)，結(jié)果顯示在氨基酸水平上與黑曲霉C513. 88的假定蛋白·Anl5g07760有98 %的相似度，而與硫色曲霉、棘孢曲霉和里氏木霉中的同源蛋白分別只有6. 6%,9. 3%,8. 7%相同。實(shí)施例2 :表達(dá)甘露聚糖酶基因的巴斯德畢赤酵母轉(zhuǎn)化株的構(gòu)建為構(gòu)建巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體，利用引物 5’CCGGAATTCGCTTCCAACCAGACTCTGTCCTAT 和 5’ATATGCGGCCGCTTAAGCCCCCTCCCAGTTCAGAGC擴(kuò)增編碼甘露聚糖酶成熟肽(根據(jù)預(yù)測(cè)從Gly18到Ala335)的DNA序列。用限制性內(nèi)切酶EcoRI和NotI將PCR產(chǎn)物酶解，并將酶解產(chǎn)物插入到pPIC9的相應(yīng)位點(diǎn)，形成P-甘露聚糖酶。按照畢赤酵母表達(dá)試劑盒的說明書制備巴斯德畢赤酵母電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞，并將質(zhì)粒DNA通過電泳方式轉(zhuǎn)入已制備好的感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen，USA)。利用BglII將10 μ gP-甘露聚糖酶酶切使之線性化(New England Biolabs, USA)。比較MD板上形成的菌落在ImL BMMY (來自3mL BMGY次代培養(yǎng)細(xì)胞)培養(yǎng)基中的甘露聚糖酶活性。1000多個(gè)轉(zhuǎn)化株中有54個(gè)表現(xiàn)出β -甘露聚糖酶活性，再?gòu)倪@54株中篩選甘露聚糖酶酶活最高的菌株在500L的生物反應(yīng)器中進(jìn)行大規(guī)模的酶生產(chǎn)。實(shí)施例3 : β -甘露聚糖酶活性測(cè)定β -甘露聚糖酶活性通過DNS法測(cè)定。首先，酶液用O. lmol/L醋酸鈉緩沖液(pH
5.5)稀釋至1000到5000倍之間，然后取500 μ L酶液與500 μ L含I %刺槐豆膠的預(yù)處理后的甘露聚糖底物溶液(用相同的緩沖液稀釋)混合。在50°C溫度下反應(yīng)5分鐘，然后加入3mL DNS終止反應(yīng)并煮沸5分鐘。用甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品在540nm處的吸光度來計(jì)算釋放的還原糖的數(shù)量。在溫度為50°C、pH5. 5條件下，以每分鐘生成I μ mo I甘露糖所需要的酶量定義為一個(gè)甘露聚糖酶活性單位。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定培養(yǎng)基中的總蛋白含量來求出比活性。實(shí)施例4 :重組的巴斯德畢赤酵母菌體的高密度培養(yǎng)在500L生物反應(yīng)器中采用分批補(bǔ)料方式培養(yǎng)巴斯德畢赤酵母生產(chǎn)甘露聚糖酶。每小時(shí)注入大約3ml/L甲醇溶液來誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。每隔12小時(shí)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行取樣，測(cè)定上清液中β_甘露聚糖酶酶活、蛋白水平和細(xì)胞數(shù)量。β_甘露聚糖酶的積累量通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和酶活性檢測(cè)方法測(cè)定。甘露聚糖酶表示為一組分子量在大約70到IOOkDa之間的蛋白。蛋白表達(dá)的峰值在第8-9天出現(xiàn)(圖2)。誘導(dǎo)結(jié)束時(shí)，在溫度為50°C下，在含有l(wèi)mmol/L Mn2+的醋酸鈉緩沖溶液中測(cè)定β -甘露聚糖酶活性，活性為4305U/mL。通過BCA蛋白測(cè)定法檢測(cè)培養(yǎng)基濾出液中蛋白含量約為4g/L，轉(zhuǎn)換成比活力為1075U/mg。實(shí)施例5 :重組后的β -甘露聚糖酶的性質(zhì)通過在一系列緩沖溶液中進(jìn)行LBG水解反應(yīng)來確定β -甘露聚糖酶的最適pH值，緩沖液包括例如0. lmol/L甘氨酸-鹽酸鹽(pH I. 5-3. O)，O. lmol/L醋酸鈉(pH
3.5-6.0)，O. lmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(pH 6.0-8. 5),0. lmol/L甘氨酸-氫氧化鈉(pH 8. 5-10)，所有的測(cè)定均在50°C反應(yīng)5分鐘。結(jié)果見圖3A。用上述方法在50°C下培養(yǎng)I小時(shí)來測(cè)定在不同緩沖液pH條件下酶的穩(wěn)定性。在標(biāo)準(zhǔn)條件下檢測(cè)殘留的酶活性。結(jié)果見圖3B。在20_100°C范圍內(nèi)檢測(cè)酶的活性，確定酶的最適反應(yīng)溫度。酶在30，40，50，60或 70°C下培養(yǎng)1-150分鐘后(在O. lmol/L醋酸鈉緩沖溶液中)，在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定剩余的酶活性來比較酶的熱穩(wěn)定性。結(jié)果見圖4A和4B。實(shí)施例6 :不同的金屬離子對(duì)甘露聚糖酶酶活的影響通過在酶液中添加lmmol/L的硫酸鉀、氯化鈉、硫酸鈷、氯化銫、硫酸銅、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化錳、硫酸鋅和硝酸銀，測(cè)定不同的金屬離子對(duì)酶活性的影響。添加lmmol/L的Mn2+和Co2+使甘露聚糖酶活性分別增加75%和44%。結(jié)果見表I。實(shí)施例7 :甘露聚糖酶的專一性甘露聚糖酶液用0. lmol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH5. 5)稀釋2000倍，取500 μ I酶與500 μ I預(yù)處理后的底物溶液混合，預(yù)處理后的底物溶液(包括1% LGB、淀粉、濾紙和CMC)在緩沖液中100°C下加熱I小時(shí)。水解反應(yīng)在溫度為50°C條件下反應(yīng)5分鐘，然后加入3mLDNS試劑煮沸5分鐘終止反應(yīng)。用甘露糖標(biāo)準(zhǔn)品在540nm處的吸光度來內(nèi)計(jì)算釋放的還原糖的量，當(dāng)?shù)矸?、濾紙或CMC作為底物時(shí)未檢測(cè)到活性。這證明甘露聚糖酶是一個(gè)專一性水解甘露聚糖的酶。實(shí)施例8 :甘露聚糖底物的預(yù)處理將IgLGB緩慢添加到IOOmLO. lmol/L醋酸鈉緩沖溶液中(pH5. 5)，在100°C不斷攪拌條件下持續(xù)加熱60分鐘。底物在4°C存放2周才能使用。實(shí)施例9 : β -甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)通過檢測(cè)不同pH、反應(yīng)溫度和金屬離子條件下的酶活，分析了甘露聚糖酶的最適水解條件。從圖3A中可以看出，酶活的pH范圍在4. 5-6. O之間，最適pH為5. 5。pH在
2.5-4. 5和6. 0-7. 5時(shí)，酶活快速降低。pH在4. 0-8. 5之間時(shí)酶也非常穩(wěn)定，培養(yǎng)Ih后有大于65%的酶活。pH在4以下和9以上時(shí)，酶的穩(wěn)定性大幅度下降(圖3B)。酶活的最適溫度約為50°C (圖4A)。當(dāng)溫度升高到55°C時(shí)，酶極不穩(wěn)定，達(dá)到80°C時(shí)幾乎完全失活。不同溫度下酶穩(wěn)定性的詳細(xì)變化如圖4B。溫度為50°C時(shí)，酶的半衰期為為65分鐘，當(dāng)溫度升高到60°C和70°C時(shí)，酶活的半衰期分別只有20和15分鐘。酶在與室溫相近的溫度下可以保持較高的活性。40°C時(shí)酶的活性大約為50°C時(shí)的70%。實(shí)施例10 :本發(fā)明生產(chǎn)甘露聚糖酶的優(yōu)越性到目前為止，本發(fā)明是首先采用化學(xué)合成的基因表達(dá)產(chǎn)生甘露聚糖酶。這個(gè)基因的表達(dá)水平(3. 6g/L)是硫色曲霉(262mg/L)的14倍(Chen, et al，2007)，比以前報(bào)道的結(jié)果都要高。本發(fā)明所得酶活為4305U/ml，比以前報(bào)道的350U/ml高12倍(Chen，et al,2007)。重組酶的最適pH大約為5. 5，顯著高于以前由黑曲霉固體發(fā)酵所產(chǎn)甘露聚糖酶的 最適PH值3，盡管最適溫度相似，大約為50°C。本發(fā)明所生產(chǎn)的重組β_甘露聚糖酶的在37-40°C條件下具有較高的活性，是適合在低溫條件下使用的酶。然而，在它能用作洗滌劑添加劑之前，它對(duì)洗滌劑的抵抗力還有待進(jìn)一步改善。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的方法，包括以下步驟(1)一種合成的β-甘露聚糖酶基因與DNA載體中的啟動(dòng)子結(jié)合，產(chǎn)生一個(gè)表達(dá)框， (2)將DNA載體接種到一個(gè)酵母細(xì)胞中， (3)小規(guī)模培養(yǎng)條件下，通過測(cè)定β_甘露聚糖酶活性篩選出高表達(dá)菌株， (4)在500L的生物反應(yīng)器中，篩選高表達(dá)β-甘露聚糖酶的菌株
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，高表達(dá)β-甘露聚糖酶的菌株產(chǎn)生4305U/mL的β -甘露聚糖酶酶活。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，甘露聚糖酶基因含有SeqIDl序列的主要部分，Seq IDI的多核苷酸序列號(hào)見圖I。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，β-甘露聚糖酶基因是一種含有與Seq IDl有至少85%同源性片段的多核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，甲醇是啟動(dòng)子最好的誘導(dǎo)劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，接種的酵母屬于畢赤酵母屬。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，接種的酵母是巴斯德畢赤酵母。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，β_甘露聚糖酶被分泌到胞外培養(yǎng)液中。
9.一種酵母細(xì)胞,包含權(quán)利要求I中的DNA載體。
10.用甘露聚糖酶對(duì)甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖的水解方法包括以下步驟 (1)對(duì)含有甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖等的底物進(jìn)行預(yù)處理。
(2)將含有β_甘露聚糖酶的酶混合物的緩沖液和預(yù)處理后的底物進(jìn)行培養(yǎng)。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的水解方法，緩沖液中含有Mn2+、Fe2+和Co2+金屬離子中的一種。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的水解方法，緩沖液的pH在4.5-6. 5之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的水解方法，酶混合物含有β-甘露聚糖酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種β-甘露聚糖酶的高產(chǎn)方法，本方法是通過將一個(gè)編碼為內(nèi)切β-甘露聚糖酶的多核苷酸被化學(xué)合成、克隆以及與a-因子信號(hào)肽結(jié)合后在胞外表達(dá)(受到乙醇氧化酶基因AOX1啟動(dòng)子的控制)等過程。在一個(gè)500L的生物反應(yīng)器中，所選的高表達(dá)工程菌株能分泌大約4g/L蛋白至培養(yǎng)液中，高表達(dá)菌株能產(chǎn)生約4305U/mL的β-甘露聚糖酶酶活。Co2+和Mn2+能顯著增強(qiáng)甘露聚糖的水解活性。產(chǎn)生的β-甘露聚糖酶能高效水解甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳甘露聚糖。
文檔編號(hào)C12P19/14GK102888415SQ201110206380
公開日2013年1月23日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者項(xiàng)文勝, 王俊峰, 李尚坤 申請(qǐng)人:江蘇奕農(nóng)生物工程有限公司