專利名稱:一種分泌結(jié)晶型纖維素的藍(lán)藻工程菌及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及一種分泌結(jié)晶型纖維素的藍(lán)藻工程菌及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù):
細(xì)菌纖維素近幾十年來一直是國內(nèi)外生物材料領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。英國科學(xué)家 Brown早在1886年就發(fā)現(xiàn)靜置培養(yǎng)的木醋桿菌培養(yǎng)基表面有一層片狀的纖維素物質(zhì)漂浮。隨著研究的逐漸深入,人們發(fā)現(xiàn)這種纖維素物質(zhì)具備高度有序的晶體排列結(jié)構(gòu)(X射線衍射結(jié)果證實(shí)這種纖維素的結(jié)晶型為I型),高物理強(qiáng)度,高吸水性等特質(zhì)。所以人們逐漸將此種細(xì)菌纖維素工廠化生產(chǎn),進(jìn)而用于生產(chǎn)乙醇,用于制造人造皮膚,高質(zhì)量的膜類物質(zhì) (如音響振動(dòng)膜),以及食品添加劑等等。但是木醋桿菌的培養(yǎng)成本極其昂貴,而且其生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的各種次級(jí)代謝物,使培養(yǎng)廢棄物的排放對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重污染,因此大規(guī)模的生產(chǎn)培養(yǎng)始終受限。菌種的改良工作一直在世界各國進(jìn)行。藍(lán)藻作為一種能夠光合自養(yǎng)的微生物,其低廉的培養(yǎng)成本,高效的生長(zhǎng)速率以及特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu),為其作為產(chǎn)生纖維素的工程菌提供了很大潛力。木醋桿菌分泌結(jié)晶型纖維素的能力與藍(lán)藻光合作用的特性可以進(jìn)行有機(jī)的結(jié)合。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種分泌結(jié)晶型纖維素、培養(yǎng)成本低的藍(lán)藻工程菌。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下一種藍(lán)藻工程菌,其特征在于,所述藍(lán)藻工程菌為cesA基因(SEQ ID N0:1)缺失的藍(lán)藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突變體;該突變體的基因組上整合并表達(dá)木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的包括7個(gè)連續(xù)的纖維素合成相關(guān)基因 cmcase (SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、 acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)、bglxA (SEQ ID NO :10)在內(nèi)的基因組片段 CG27 ;所述基因組片段CG27的長(zhǎng)度為100392bp,起始序列為SEQ ID NO 12,終止序列為 SEQID NO :13ο上述藍(lán)藻工程菌的制備方法,包括如下步驟1)將藍(lán)藻(Synechococcus sp.)PCC 7002 自身的纖維素合成基因 cesA (SEQ ID NO 1)敲除或破壞,得到藍(lán)藻突變體;2)構(gòu)建BAC載體,所述載體上連入紅霉素抗性基因(Em)以及1段與藍(lán)藻 (Synechococcus sp.) PCC 7002的基因組同源的1. 2kb大小的DNA區(qū)域,是圖4中的 Homologous Region(SEQ ID NO :11);3)將木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 5;3582 基因組中包括連續(xù) 7 個(gè)纖維素合成相關(guān)基因 cmcase (SEQ ID NO 4)、ccp (SEQ ID NO 5)、acsA(SEQ ID NO 6)、 acsB(SEQ ID NO :7)、acsC (SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO 9)和 bglxA(SEQ ID NO :10)在內(nèi)的基因組片段CG27構(gòu)建在步驟2)所述BAC載體上(圖4);所述基因組片段CG27的長(zhǎng)度為100392bp,起始序列為SEQ ID NO 12,終止序列為SEQ ID NO 13 ;4)將上一步得到的BAC載體轉(zhuǎn)化至步驟1)產(chǎn)生的藍(lán)藻突變體中,即得到了所需的
藍(lán)藻工程菌。上述步驟1)中,用同源雙交換的方法敲除所述藍(lán)藻的cesA基因。一種生產(chǎn)結(jié)晶型纖維素的方法,其特征在于,包括如下步驟a)用上面所述的方法制備出藍(lán)藻工程菌;b)將所得的藍(lán)藻工程菌培養(yǎng)在A+培養(yǎng)基中約1周時(shí)間,使藍(lán)藻工程菌生長(zhǎng)到OD 值達(dá)到1. 0 2. 0 ;c)將所述藍(lán)藻工程菌離心富集,轉(zhuǎn)移到適合于藍(lán)藻生長(zhǎng)的淡水培養(yǎng)基BGll中約2 周;d)從所述藍(lán)藻工程菌提取纖維素。e)經(jīng)過X射線衍射檢測(cè),此纖維素與木醋桿菌纖維素都為結(jié)晶良好的I型。在所述A+培養(yǎng)基和BGll培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中始終進(jìn)行吹氣培養(yǎng),氣體成分為空氣占98% 99%,CO2占1 % 2% ;培養(yǎng)過程始終保證溫度25°C ,光照強(qiáng)度30 μ E/ m2s 300μ E/m2s。本發(fā)明還提供藍(lán)藻工程菌在生產(chǎn)纖維素方面的應(yīng)用。該纖維素可以用于生產(chǎn)乙醇,進(jìn)而用作生物能源。同時(shí),本發(fā)明生產(chǎn)的纖維素具有良好的結(jié)晶型,有更加廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域,可以用于生產(chǎn)人造皮膚,用于生產(chǎn)高質(zhì)量的膜材料,用于制造食品添加劑等。經(jīng)檢測(cè), 野生型藍(lán)藻Synechococcus sp. PCC 7002的纖維素含量占細(xì)胞壁干重的質(zhì)量百分比約為 2%,而本發(fā)明構(gòu)建的藍(lán)藻工程菌,纖維素含量可以達(dá)到自身細(xì)胞壁干重的約7%,同時(shí),該藍(lán)藻工程菌生產(chǎn)纖維素的生長(zhǎng)周期短(總共約3周時(shí)間),而且不存在木材中的木質(zhì)素的污染問題,其提取和純化過程可以大大簡(jiǎn)化,并且對(duì)環(huán)境的污染程度也可以相應(yīng)的大大減少, 是一種理想的生產(chǎn)纖維素的生物工程菌。所述纖維素用于生產(chǎn)醇,進(jìn)而用作生物能源。同時(shí),經(jīng)過X射線衍射檢測(cè)發(fā)現(xiàn),此種纖維素結(jié)晶型良好,為I型,為日后更廣泛的應(yīng)用打下了 ■石出。
圖 1 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ; (b)Synechococcus sp. PCC 7002cesA缺失突變體。圖 2 (a)野生型 Synechococcus sp. PCC 7002 ; (b) Synechococcus sp. PCC 7002 藍(lán)
藻工程菌。圖3實(shí)施例的藍(lán)藻工程菌纖維素X射線衍射圖與木醋桿菌(GluconacetcAacter xylinum)ATCC 53582的X射線衍射圖對(duì)比。其中三個(gè)箭頭的指向分別表示結(jié)晶型纖維素的 3個(gè)典型衍射峰。圖4本發(fā)明構(gòu)建的BAC載體質(zhì)粒圖。
具體實(shí)施例方式1.首先,通過生物學(xué)中常用的“同源雙交換”的方法將藍(lán)藻Synechococcus sp. PCC7002自身的纖維素合成基因cesA(SEQ ID NO 1)敲除(同源雙交換,也就是在需要敲除的目的基因5,和3,兩端各選取一段長(zhǎng)度適宜的DNA片段,一般從400bp至31Λ均可。在這兩個(gè)片段的中間連入一個(gè)卡那霉素抗性基因,再將連好的這三個(gè)片段一同插入一個(gè)無法在藍(lán)藻中復(fù)制的載體上,將載體轉(zhuǎn)入藍(lán)藻,在卡那霉素的篩選作用下迫使藍(lán)藻基因組上產(chǎn)生同源雙交換,使目的基因被抗生素基因所替代,從而達(dá)到目的基因的敲除?;蚯贸?,原先的cesA基因缺失,而完全被卡那霉素抗性基因所替代。此外,采用將卡那霉素抗性基因插入cesA,而非將此基因完全敲除的方法,同樣也可以使這個(gè)基因失去功能。本實(shí)驗(yàn)采用同源雙交換,選取了 cesA基因上下游各11Λ的片段作為同源交換區(qū),上游片段序列見SEQ ID NO :2,下游片段序列見SEQ ID N0:3),cesA基因的功能喪失導(dǎo)致藍(lán)藻細(xì)胞壁中起到結(jié)構(gòu)交聯(lián)作用的纖維素成分減少,通過超薄切片透射電子顯微鏡,能夠觀察到藍(lán)藻Synechococcus sp. PCC 7002自身cesA缺失突變體的細(xì)胞壁肽聚糖層被嚴(yán)重破壞。若將此突變體培養(yǎng)在低鹽濃度的BGll淡水培養(yǎng)基中,通過掃描電子顯微鏡能夠觀察到其細(xì)胞拉長(zhǎng),同時(shí)細(xì)胞表面凹凸不平,說明此突變體的細(xì)胞壁已經(jīng)十分脆弱(見圖1,(a)野生型Synechococcus sp. PCC 7002,細(xì)胞有較為規(guī)整的結(jié)構(gòu)和平滑的表面;(b) Synechococcus sp. PCC 7002cesA 缺失突變體,細(xì)胞有拉長(zhǎng),變小等形態(tài)變化,表面也極其凹凸不平)。2.接下來,將木醋桿菌 Gluconacetobacter xylinum ATCC 5;3582 基因組中的包括連續(xù) 7 個(gè)纖維素合成相關(guān)基因 cmcase(SEQ ID NO :4),ccp (SEQ ID NO :5),acsA (SEQ ID NO 6),acsB(SEQ ID NO 7),acsC(SEQ ID NO 8),acsD(SEQ ID NO 9),bglxA(SEQ IDNO 10)在內(nèi)的100392bp基因組片段(該片段以SEQ ID NO 12起始,以SEQ ID NO 13終止, 本發(fā)明中,把該片段記作CG27)通過構(gòu)建BAC文庫的方法連接到BAC載體上,BAC載體此前已經(jīng)過了特殊改造(BAC載體的構(gòu)建起始于一個(gè)無法在藍(lán)藻Synechococcus sp. PCC7002 中自主復(fù)制的普通BAC質(zhì)粒,隨后在其上連接了 1段與Synechococcus sp. PCC 7002自身基因組同源的1.2kb大小的DNA區(qū)域,是圖4中的Homologous Region (SEQ ID NO :11)以及一個(gè)紅霉素抗性基因與其自身啟動(dòng)子。通過同源單交換作用,包括7個(gè)纖維素合成相關(guān)基因在內(nèi)的100392bp木醋桿菌的基因組片段,以及Em抗性基因都會(huì)被整合至藍(lán)藻基因組上,使得外源引入的基因得以表達(dá)。將此特定BAC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至自身cesA基因缺失的藍(lán)藻 Synechococcus sp. PCC 7002突變體,從而得到藍(lán)藻工程菌。將此工程菌培養(yǎng)在A+培養(yǎng)基中,使藻體生長(zhǎng)到OD值為1.0 2.0(培養(yǎng)基中加入終濃度100yg/ml的卡那霉素和終濃度25yg/ml的紅霉素作為選擇性壓力,生長(zhǎng)溫度范圍可以從25°C 35°C,光照強(qiáng)度可以從 30 μ E/m2s 300 μ E/m2s,培養(yǎng)過程中始終吹氣培養(yǎng),氣體成分為空氣占98% 99%,CO2占
2%)。此時(shí),部分藻體已經(jīng)具有了纖維素的少量分泌。培養(yǎng)時(shí)間大約需要1周左右。3.最后,把在A+培養(yǎng)基中生長(zhǎng)了 1周的藍(lán)藻工程菌離心收集(離心時(shí)采用無菌的離心杯,轉(zhuǎn)數(shù)為5,000 6,OOOrpm),再轉(zhuǎn)移到淡水培養(yǎng)基BGll中繼續(xù)培養(yǎng)(BG11加入終濃度4 μ g/L左右的VB12,同時(shí)加入終濃度100 μ g/ml的卡那霉素和終濃度25 μ g/ml的紅霉素作為選擇性壓力,生長(zhǎng)溫度范圍可以從25°C 35°C,光照強(qiáng)度可以從30 μ E/m2s 300 μ E/m2s,培養(yǎng)過程中始終吹氣培養(yǎng),氣體成分為空氣占98 % 99 %,CO2占1 % 2 % )。 淡水培養(yǎng)基中的低鹽環(huán)境導(dǎo)致細(xì)胞壁因?yàn)闈B透壓的改變而變脆弱,進(jìn)一步刺激了纖維素的分泌。又經(jīng)過大約2周時(shí)間,幾乎所有藻體的表面都有纖維素的包裹以及穿透。由于纖維素大量分泌對(duì)藍(lán)藻本身的生長(zhǎng)產(chǎn)生了影響,所以兩周后藍(lán)藻細(xì)胞會(huì)由綠色變?yōu)榘咨?。這是纖維素大量分泌的體現(xiàn)(圖2,(a)野生型Synechococcus sp. PCC 7002,細(xì)胞表面平滑,沒有纖維素的分泌;(b) Synechococcus sp. PCC 7002藍(lán)藻工程菌,大量纖維素穿透并包裹了細(xì)胞體)。4.纖維素結(jié)晶型的檢測(cè)以及含量的測(cè)定采用X射線衍射的方法來檢測(cè)藍(lán)藻工程菌分泌的纖維素類型。經(jīng)過測(cè)定,藍(lán)藻工程菌產(chǎn)生的纖維素與木醋桿菌的纖維素均為結(jié)晶良好的I型。兩種纖維素的X射線衍射圖如圖3。隨后使用生化中經(jīng)典的“硫酸蒽酮法”檢測(cè)纖維素的含量。具體步驟為,首先稱取5mg左右已經(jīng)提取完成的Synechococcus sp. PCC 7002野生型和本發(fā)明構(gòu)造的纖維素工程菌細(xì)胞壁材料(干重而非濕重),用72%的硫酸1. 5ml在室溫將細(xì)胞壁中的纖維素降解 2小時(shí),使纖維素充分變?yōu)槠咸烟?。離心將雜質(zhì)沉淀后分別取上清液500 μ L。然后分別配制10,20,30,40,50,60,100 μ g/ μ L的葡萄糖溶液用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線,每種濃度的溶液各取樣500yL。所有樣品中各加入Iml新鮮配制的硫酸蒽酮溶液(即純硫酸中加入0.2%的蒽酮),沸水浴15分鐘,冰上冷卻10分鐘,室溫放置10分鐘,然后用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在 620nm波長(zhǎng)處的紫外吸收值,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算出目標(biāo)樣品中的葡萄糖含量,也就是纖維素的含量,由此計(jì)算出纖維素占細(xì)胞壁的質(zhì)量百分比。經(jīng)過計(jì)算,野生型Synechococcus sp. PCC 7002纖維素約占細(xì)胞壁2%,而本發(fā)明的藍(lán)藻工程菌纖維素含量約占細(xì)胞壁的7%左右(均為干重而非濕重)。5.培養(yǎng)基配方BGll培養(yǎng)基配方如下
NaNO31.5g
權(quán)利要求
1.一種分泌結(jié)晶型纖維素的藍(lán)藻工程菌,其特征在于,所述藍(lán)藻工程菌為cesA基因 (SEQ IDNO :1)缺失的藍(lán)藻(Synechococcus sp. )PCC 7002突變體;該突變體的基因組上整合并表達(dá)木醋桿菌(GluconacetcAacter xylinum)ATCC 53582的包括7個(gè)連續(xù)的纖維素合成相關(guān)基因 cmcase(SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA(SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)、bglxA (SEQ ID NO :10)在內(nèi)的基因組片段 CG27 ;所述基因組片段CG27的長(zhǎng)度為100392bp,起始序列為SEQ ID N0:12,終止序列為 SEQID NO :13ο
2.一種分泌結(jié)晶型纖維素的藍(lán)藻工程菌的制備方法,其特征在于,包括如下步驟1)將藍(lán)藻(Synechococcussp. )PCC 7002 自身的纖維素合成基因 cesA (SEQ ID NO 1) 敲除或破壞,得到藍(lán)藻突變體;2)構(gòu)建BAC載體,所述載體上連入紅霉素抗性基因(Em)以及1段與藍(lán)藻 (Synechococcussp.) PCC 7002 的基因組同源的 1. 2kb 大小的 DNA 區(qū)域,是 Homologous Region(SEQID NO :11)3)將木醋桿菌(Gluconacetobacterxylinum)ATCC 5;3582基因組中包括連續(xù)7個(gè)纖維素合成相關(guān)基因 cmcase(SEQ ID NO :4)、ccp (SEQ ID NO :5)、acsA (SEQ ID NO :6)、acsB (SEQ ID NO :7)、acsC(SEQ ID NO :8)、acsD (SEQ ID NO :9)和 bglxA(SEQ ID NO :10)在內(nèi)的基因組片段CG27構(gòu)建在步驟幻所述BAC載體上;所述基因組片段CG27的長(zhǎng)度為100392bp,起始序列為SEQ ID NO 12,終止序列為SEQ ID NO 13 ;4)將上一步得到的BAC載體轉(zhuǎn)化至步驟1)產(chǎn)生的藍(lán)藻突變體中,即得到了所需的藍(lán)藻工程菌。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法,其特征在于,步驟1)中,用同源雙交換的方法敲除所述藍(lán)藻的cesA基因。
4.一種生產(chǎn)結(jié)晶型纖維素的方法,其特征在于,包括如下步驟a)用權(quán)利要求2所述的方法制備出藍(lán)藻工程菌;b)將所得的藍(lán)藻工程菌培養(yǎng)在A+培養(yǎng)基中約1周時(shí)間,使藍(lán)藻工程菌生長(zhǎng)到OD值達(dá)到 1. O 2. O ;c)將所述藍(lán)藻工程菌離心富集,轉(zhuǎn)移到適合于藍(lán)藻生長(zhǎng)的淡水培養(yǎng)基BGll中約2周;d)從所述藍(lán)藻工程菌提取纖維素。
5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,在所述A+培養(yǎng)基和BGl1培養(yǎng)基的培養(yǎng)過程中始終進(jìn)行吹氣培養(yǎng),氣體成分為空氣占98% 99%,CO2占 2% ;培養(yǎng)過程始終保證溫度25°C 35°C,光照強(qiáng)度30 μ E/m2s 300 μ E/m2s。
6.權(quán)利要求1所述藍(lán)藻工程菌在生產(chǎn)纖維素方面的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于,所述纖維素用于生產(chǎn)乙醇,進(jìn)而用作生物能源。
8.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于,所述纖維素用于生產(chǎn)膜材料。
9.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用,其特征在于,所述纖維素用于用于生產(chǎn)人造皮膚或制造食品添加劑。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種分泌結(jié)晶型纖維素的藍(lán)藻工程菌及其制備方法和應(yīng)用。所述藍(lán)藻工程菌為cesA基因缺失的藍(lán)藻(Synechococcus sp.)PCC 7002突變體;該突變體的基因組上整合有包含木醋桿菌(Gluconacetobacter xylinum)ATCC 53582的7個(gè)纖維素合成相關(guān)基因cmcase、ccp、acsA、acsB、acsC、acsD、bg1xA在內(nèi)的長(zhǎng)度100392bp的基因組片段。所述藍(lán)藻工程菌的纖維素含量達(dá)到自身細(xì)胞壁干重的約7%,是一種理想的生產(chǎn)結(jié)晶型纖維素的生物工程菌。該結(jié)晶型纖維素除了用于生產(chǎn)乙醇而用作生物能源之外,經(jīng)過X射線衍射檢測(cè),發(fā)現(xiàn)此種纖維素結(jié)晶型良好,為I型,因此還可以用于生產(chǎn)人造皮膚,用于生產(chǎn)高質(zhì)量的膜材料,以及用于制造食品添加劑等。
文檔編號(hào)A23L1/30GK102250774SQ20111020749
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年7月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月22日
發(fā)明者趙進(jìn)東, 趙馳 申請(qǐng)人:北京大學(xué)