專利名稱：中間補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種中間補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)憐酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,簡稱cAMP)為當(dāng)今分子生物學(xué)研究的重要內(nèi)容之一，具有第二信使的作用?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)研究證明，至少40多種疾病(包括癌癥、高血壓、冠心病、心肌梗塞和心源性休克、牛皮癬等)與cAMP的代謝有關(guān)(Hong D，Peng X R. 2003. Role of the cAMP in immunological liver injury in mi ce comparingLPS-induced model with LPS+BCG-indudced model. Chinese Pharmacol Bull. 19 :940 943)。在制藥方面，環(huán)磷酸腺苷也可以作為藥物中間體制備二丁酰環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷腺苷葡甲胺，提高脂溶性，從而發(fā)揮更有效地生理與藥理作用。在畜牧業(yè)上，采用外源性cAMP可以摸擬生產(chǎn)激素的作用，促進(jìn)畜禽生長、提高飼料報(bào)酬、增加優(yōu)質(zhì)畜產(chǎn)品產(chǎn)量(關(guān)榮發(fā)，王淑彩，許梓榮.2002.外源性環(huán)核苷酸在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用.飼料與飼養(yǎng).9 :40 42)，是提高畜牧業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益開辟一條新途徑。目前，環(huán)磷酸腺苷國內(nèi)需求以每年20%的速度增長，而全球市場也已15%的速度遞增，年用量達(dá)上百噸，具有良好的市場前景。cAMP的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法三種。國內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用化學(xué)合成法，該方法以AMP為原料，采用高效分離柱進(jìn)行中間體分離，由于該方法的溶劑損耗量大，收率低，成本偏高，產(chǎn)量小，以及嚴(yán)重的環(huán)境污染，制約著它的大規(guī)模生產(chǎn)。酶法只在國外有報(bào)道，是利用液化短桿菌提取的腺苷酸環(huán)化酶，在丙酮酸存在下，可以高效地催化ATP生成cAMP,收率幾乎達(dá)到了 100% (Kurashina Y, Takai T,Hori C, Okamoto H. 1974.Adenylate cyclase from Brevibacterium liquefaciens.Reversibility and thermodynamic studies. J Biol Chem. 249 :4824 4827)。但是的生產(chǎn)規(guī)模有限(僅僅達(dá)到克規(guī)模)，離真正的產(chǎn)業(yè)化還有較大的距離。因此，還有必要開發(fā)出可以應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是，基于本發(fā)明人早期篩選出的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的菌株，提供一種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供了一種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法，所述方法采用間歇勻速補(bǔ)料的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號為CGMCC No. 3584的節(jié)桿菌。優(yōu)選地，所述間歇勻速補(bǔ)料的操作如下在發(fā)酵的指數(shù)期之后，以每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料碳源，共流加4 10次。優(yōu)選地，所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和環(huán)磷酸前體物質(zhì)。
優(yōu)選地，所述碳源選自糖蜜、葡萄糖、蔗糖和果糖中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述碳源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L。優(yōu)選地，所述氮源選自酵母粉、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、尿素和硫酸銨中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述氮源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L。優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、碳酸鹽和硫酸鹽中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸前體物質(zhì)選自腺苷、腺苷單磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷和肌苷酸中的一種或幾種。
優(yōu)選地，所述磷酸前體物質(zhì)的初始濃度為0. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。
優(yōu)選地，所述分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的條件如下接種量I 15% (v/v)，pH為
5.O 8. 0，發(fā)酵溫度25 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速200 400r/min，培養(yǎng)時(shí)間50 80h，并且在發(fā)酵的指數(shù)期之后，例如20 40h開始，以每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料濃度為400 800g/L的碳源,共流加4 10次,每次10 50mL。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法包括以下步驟1)斜面培養(yǎng)將冷藏的發(fā)酵菌株接種到斜面上，30°c培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h活化；2)種子培養(yǎng)從活化的斜面挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min，培養(yǎng)18h ；3)分批發(fā)酵培養(yǎng)接種量I 15% (v/v)，pH為5. O 8. 0，發(fā)酵溫度25 40°C，攪拌轉(zhuǎn)速200 400r/min,培養(yǎng)時(shí)間50 80h，并且在發(fā)酵的指數(shù)期之后，例如20 40h開始，以每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料濃度為400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。綜上所述，本發(fā)明建立在篩選出的環(huán)磷酸腺苷高產(chǎn)菌株(分類命名為節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )A302,目前該菌株已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 3584，保藏日期為2010年I月18日)，對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，可進(jìn)行300L發(fā)酵罐中試生產(chǎn)的基礎(chǔ)上，通過進(jìn)行補(bǔ)料分批發(fā)酵調(diào)控，即根據(jù)菌株生長和起始培養(yǎng)基的特點(diǎn)，在分批生產(chǎn)的某階段適當(dāng)補(bǔ)加培養(yǎng)基的一種或幾種成分，使菌株保證一定的生長密度，消除底物抑制，同時(shí)延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，從而提高cAMP的產(chǎn)量?？梢?，本發(fā)明提供的中間補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法，有效克服了分批發(fā)酵時(shí)的底物抑制效應(yīng)，使cAMP發(fā)酵的最終濃度提高。本發(fā)明的關(guān)鍵在于，使用SBA生物傳感分析儀在線監(jiān)測發(fā)酵液中的底物濃度，通過此參數(shù)反饋流加培養(yǎng)液，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，使底物濃度較低，消除底物抑制，同時(shí)延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，而且發(fā)酵結(jié)束基本被耗盡，過程的控制和分析也比較簡單，可以極大方便工業(yè)化中的自動化生產(chǎn)控制。因此，采用中間補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的優(yōu)勢在于，生產(chǎn)設(shè)備簡單，選擇性高、反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少，可以減輕環(huán)境壓力，符合低碳經(jīng)濟(jì)，而且成本低、適合于工業(yè)化。具體而言，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢I)與傳統(tǒng)的化學(xué)法合成相比，生產(chǎn)設(shè)備簡單，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，副產(chǎn)物少。2)該方法生物合成環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵培養(yǎng)基成分簡單，價(jià)格低廉，生產(chǎn)成本低，適合于工業(yè)化。
3)在整個(gè)培養(yǎng)過程中，碳源濃度較低，可以消除底物抑制，同時(shí)延長次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)時(shí)間，而且發(fā)酵結(jié)束基本被耗盡。4)本發(fā)明所用的微生物菌株，具有高產(chǎn)性狀穩(wěn)定，不易丟失的特點(diǎn)，傳代10代以
上轉(zhuǎn)接，產(chǎn)量保持穩(wěn)定。5)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間短，生產(chǎn)強(qiáng)度高，可達(dá)約11. 21g/L，與不補(bǔ)料相比，產(chǎn)量提高39. 1%。生物材料的保藏節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )A302已經(jīng)于2010年I月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路 I號院，中科院微生物研究所(郵編=100101)，保藏編號為CGMCC No. 3584。關(guān)于節(jié)桿菌Arthrobacter A302的詳細(xì)信息,可參見本申請人于2010年6月4日提交的中國發(fā)明專利申請 201010191515. 6。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實(shí)施例所采用的分析方法如下發(fā)酵液中的產(chǎn)物cAMP采用Agilent 1100高效液相色譜儀測定(HPLC)。色譜柱江蘇淮陰漢邦科技有限公司Lichrospher C18 (4. 6x250mm, 5 μ m),柱溫30°C,檢測器為紫外檢測器(254nm)，流動相為V (甲醇)V (pH6. 6的磷酸三乙胺溶液)=30 : 70 ;流速O. 8mL/min ;進(jìn)樣量20μ L。精確稱取環(huán)磷腺苷的標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸三重水配制成質(zhì)量濃度約50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將經(jīng)預(yù)處理的樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，并用O. 45 μ m微孔膜進(jìn)行過濾后，作為樣品溶液待檢測，發(fā)酵樣品根據(jù)峰面積計(jì)算cAMP產(chǎn)量。以下各實(shí)施例中所采用的斜面培養(yǎng)基(g/L)組成如下葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化鈉3及瓊脂20。以下各實(shí)施例中所采用的液體種子培養(yǎng)基(g/L)組成如下葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化鈉3、生物素O. 001及酸水解酪蛋白5。實(shí)施例I發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，磷酸氫二鉀10，磷酸二氫鉀10，硫酸鎂1，蛋白胨4，生物素O. 003，次黃嘌呤6，pH 6. 0，121 °C高壓蒸汽滅菌15min。將斜面試管上的節(jié)桿菌(Arthrobacter)A302接2環(huán)于種子培養(yǎng)基，30°C,搖床200r/min,培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的8% (v/v)的接種量接入含3L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度 28°C，通氣量 I. 5vvm,攪拌轉(zhuǎn)速 350r/min，在 20h、28h、36h、44h、52h，分別勻速流加 600g/L的葡萄糖溶液，每隔8h流加一次，流加5次，每次40mL，流加量在200ml左右。培養(yǎng)到72h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為11. 21g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 156g/(L *h)。實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖45，磷酸氫二鉀10，磷酸二氫鉀5，硫酸鎂O. 5，蛋白胨4，生物素O. 005，腺嘌呤6，pH 7. 0，121 °C高壓蒸汽滅菌15min。其他條件與實(shí)施例I的方法相同，將斜面試管上的節(jié)桿菌(Arthrobacter) A302接2環(huán)于種子培養(yǎng)基，30°C，搖床200r/min，培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的10% (v/v)的接種量接入3. 5L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度32°C，通氣量I. 2vvm,攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，在20 50h之間每3h流加濃度為400g/L的葡萄糖溶液，共流加10次，每次20ml，流加量在200ml左右。培養(yǎng)到72h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為10. 88g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 151g/(L *h)。實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜50，磷酸氫二鈉10，磷酸二氫鈉10，硫酸鎂I，尿素4，生物素O. 005，腺苷6，pH 6. 0，121°C高壓蒸汽滅菌15min。
其他條件與實(shí)施例I的方法相同，將斜面試管上的節(jié)桿菌(Arthrobacter) A302接2環(huán)于種子培養(yǎng)基，30°C，搖床200r/min，培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的4% (v/v)的接種量接入4L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度34°C，通氣量I. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min，在20h、26h、32h、38h、44h，50h分別勻速流加300g/L的糖蜜，每隔6h流加一次，流加6次，每次30mL。流加量在180ml左右。培養(yǎng)到66h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為8. 83g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 134g/(L *h)。實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖45，磷酸氫二鉀10，磷酸二氫鉀10，硫酸鎂O. 5，玉米漿4，生物素O. 003，肌苷酸6，pH 8. 0，121 °C高壓蒸汽滅菌15min。其他條件與實(shí)施例I的方法相同，將斜面試管上的節(jié)桿菌(Arthrobacter) A302接2環(huán)于種子培養(yǎng)基，30°C，搖床200r/min，培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的8% (v/v)的接種量接入3. 5L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度28°C，通氣量I. 2vvm，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min，在20h、30h、40h、50h，分別勻速流加600g/L的蔗糖溶液，每隔IOh流加一次，流加4次，每次50mL。流加量在200ml左右。培養(yǎng)到72h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為9. 66g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 134g/(L *h)。實(shí)施例5發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜50，磷酸氫二鉀5，磷酸二氫鉀10，硫酸鎂1，尿素4，生物素O. 005,腺嘌呤6, pH 6. 0,121°C高壓蒸汽滅菌15min。其他條件與實(shí)施例I的方法相同，將斜面試管上的節(jié)桿菌(Arthrobacter) A302接2環(huán)于種子培養(yǎng)基，36°C，搖床200r/min，培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的8% (v/v)的接種量接入3L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度30°C，通氣量I. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速350r/min，在20 50h之間每3h流加濃度為400g/L的糖蜜，共流加10次，每次20ml，流加量在200ml左右。培養(yǎng)到72h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為10. 54g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 146g/(L -h)實(shí)施例6發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50，磷酸氫二鉀10，磷酸二氫鉀5，硫酸鎂O. 5，尿素4，生物素O. 003，次黃嘌呤8，pH 7. 0，121 °C高壓蒸汽滅菌15min。其他條件與實(shí)施例I的方法相同,將斜面試管上的節(jié)桿菌Arthrobacter A302接
2環(huán)于種子培養(yǎng)基，30°C，搖床200r/min，培養(yǎng)18h，獲得指數(shù)期的種子液。將種子液按發(fā)酵體積的10% (v/v)的接種量接入4L發(fā)酵液的發(fā)酵罐中，發(fā)酵溫度30°C，通氣量1.2VVH1，攪拌轉(zhuǎn)速300r/min，在20h、28h、36h、44h、52h，分別勻速流加600g/L的葡萄糖，每隔8h流加一次，流加5次，每次30mL。流加量在150ml左右。培養(yǎng)到66h后，HPLC檢測，產(chǎn)物cAMP含量為12. lg/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 183g/(L *h)。對比例I未采取間歇勻速補(bǔ)料的方法進(jìn)行分批培養(yǎng)，其他條件均與實(shí)施例I的方法相同。最終檢測產(chǎn)物cAMP含量為8. 06g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 112g/(L · h)。對比例2
在20h、35h、50h，分別勻速流加600g/L的葡萄糖溶液，每隔15h流加一次，流加3次，每次60mL，流加量在180ml左右，其他條件均與實(shí)施例I的方法相同。最終檢測產(chǎn)物cAMP含量為9. 52g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 132g/ (L · h)。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法，所述方法采用間歇勻速補(bǔ)料的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號為CGMCC No. 3584的節(jié)桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述間歇勻速補(bǔ)料的操作如下在發(fā)酵的指數(shù)期之后，每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料碳源，共流加4 10次。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和環(huán)磷酸前體物質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述碳源選自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述碳源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氮源選自酵母粉、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、尿素、硫酸銨中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述氮源的初始濃度為0.01 100g/L，優(yōu)選為 10 30g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、碳酸鹽、硫酸鹽中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述環(huán)磷酸前體物質(zhì)選自腺苷、腺苷單磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一種或幾種，優(yōu)選地，所述磷酸前體物質(zhì)的初始濃度為0. 01 100g/L，優(yōu)選為110g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的條件如下接種量I 15% (v/v), pH為5. O 8.0，發(fā)酵溫度25 40°C，通氣量I. 2 I. 5vvm，攪拌轉(zhuǎn)速200 400r/min，培養(yǎng)時(shí)間50 80h，并且在發(fā)酵的指數(shù)期之后，例如20 40h開始，每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料濃度為400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)斜面培養(yǎng)將冷藏的發(fā)酵菌株接種到斜面上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h活化； 2)種子培養(yǎng)從活化的斜面挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min，培養(yǎng)18h； 3)分批發(fā)酵培養(yǎng)接種量I 15%(v/v), pH為5. O 8.0，發(fā)酵溫度25 40°C，通氣量I. 2 I. 5vvm,攪拌轉(zhuǎn)速200 400r/min，培養(yǎng)時(shí)間50 80h，并且在發(fā)酵的指數(shù)期之后，例如20 40h開始，每隔3 IOh間歇勻速流加補(bǔ)料濃度為400 800g/L的碳源，共流加4 10次，每次10 50mL。
全文摘要
本發(fā)明提供一種中間補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法采用間歇勻速補(bǔ)料的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號為CGMCC No.3584的節(jié)桿菌，在發(fā)酵的指數(shù)期之后，以每隔3～10h間歇勻速流加補(bǔ)料碳源，共流加4～10次。本發(fā)明提供的方法優(yōu)點(diǎn)在于，在整個(gè)培養(yǎng)過程中，碳源濃度較低，而且發(fā)酵結(jié)束基本被耗盡，在減少反饋抑制的同時(shí)，使環(huán)磷酸腺苷產(chǎn)量有較大幅的提高。
文檔編號C12P19/40GK102899373SQ201110210858
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者應(yīng)漢杰, 李磊, 陳曉春, 柏建新, 陳勇, 吳菁嵐, 謝婧婧 申請人:南京工業(yè)大學(xué)