專利名稱：兩階段溶氧量控制發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種兩階段溶氧量控制發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)憐酸腺苷(cyclicadenosine monophosphate,簡稱 cAMP),是一種核苷酸的衍生物，對于糖與脂肪的代謝，核酸和蛋白質(zhì)的合成等發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在臨床上，環(huán)磷酸腺苷在特定條件下對癌細(xì)胞有抑制作用，且血漿及體組織中cAMP代謝水平測定對腫瘤患者的早期診斷、腫瘤監(jiān)視及患者預(yù)后有一定參考價(jià)值；cAMP可激活脂肪分解酶，促進(jìn)脂肪分解及脂類代謝，防止動(dòng)脈粥樣硬化(牛淑玲，劉靜波.1996.環(huán)核苷酸的應(yīng)用效應(yīng).吉林畜牧獸醫(yī)，5 42 43)。在畜牧業(yè)上，cAMP有著廣闊的應(yīng)用前景，其作用機(jī)理為 cAMP作為激素的第二信使，激活蛋白激酶，使代謝酶活性增強(qiáng)，從而加強(qiáng)體內(nèi)蛋白的合成，增快動(dòng)物的生長速度；誘導(dǎo)激素(如生長激素等)或酶的合成，促進(jìn)機(jī)體的合成代謝(汪善鋒，陳安國.2003.環(huán)腺苷酸的生理功能及在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用.10 :3 5)。目前，環(huán)磷酸腺苷國內(nèi)需求以每年20%的速度增長，而全球市場也以15%的速度遞增，年用量達(dá)上百噸，具有良好的市場前景。cAMP的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、酶法和發(fā)酵法三種。國內(nèi)外產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全部采用化學(xué)合成法，以AMP為原料，采用高效分離柱進(jìn)行中間體分離，溶劑損耗量大，收率低，成本偏高，產(chǎn)量小，以及嚴(yán)重的環(huán)境污染制約著它的大規(guī)模生產(chǎn)。酶法只在國外有報(bào)道，是利用液化短桿菌提取的腺苷酸環(huán)化酶，在丙酮酸存在下，可以高效地催化ATP生成cAMP,收率幾乎達(dá)到了 100% (Kurashina Y, Takai T,Hori C, Okamoto H. 1974.Adenylate cyclase from Brevibacterium liquefaciens.Reversibility and thermodynamic studies. J Biol Chem. 249 :4824 4827)。但是該方法的生產(chǎn)規(guī)模有限(僅僅達(dá)到克規(guī)模)，離真正的產(chǎn)業(yè)化還有較大的距離。相比之下，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)cAMP，條件溫和，副產(chǎn)物少，環(huán)境污染小，是一種以生物技術(shù)為特征的綠色工業(yè)，在低碳經(jīng)濟(jì)的背景下，具有很重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此，很有必要開發(fā)新的發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是，基于本發(fā)明人早期篩選出的高產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的菌株，提供一種兩階段溶氧量控制發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明提供一種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法，所述方法采用兩階段溶氧量控制的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584的節(jié)桿菌。所述節(jié)桿菌(Arthrobacter sp.) A302,菌落呈圓形，濕潤，表面光滑，直徑為約I. 5 2mm，革蘭氏陽性，菌株為專性好氧，不生孢，不抗酸，化能異養(yǎng)，最適PH值為7.0。
優(yōu)選地，所述兩階段溶氧控制的操作如下在菌體生長期階段控制溶氧量為20 30%，菌體量達(dá)到穩(wěn)定之后，控制溶氧量為5 10%，直至發(fā)酵結(jié)束。優(yōu)選地，其中所述菌體生長期階段為O 18h，所述菌體量達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間約為18h。優(yōu)選地，所述方法中pH控制為6. 5 7. 5。優(yōu)選地，所述pH的控制通過流加堿性物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，所述堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水和碳酸鈉中的一種或幾種。優(yōu)選地，所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和環(huán)磷酸前體物質(zhì)。優(yōu)選地，所述碳源選自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一種或幾種；更優(yōu)選地，所述碳源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L。 優(yōu)選地，所述氮源選自酵母粉、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、尿素、硫酸銨中的一種或幾種；更優(yōu)選地，所述氮源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為10 30g/L。優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、碳酸鹽、硫酸鹽中的一種或幾種；更優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。優(yōu)選地，所述環(huán)磷酸前體物質(zhì)選自腺苷、腺苷單磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一種或幾種；更優(yōu)選地，所述磷酸前體物質(zhì)的初始濃度為0.01 100g/L，優(yōu)選為 I 10g/L。優(yōu)選地，所述分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的條件如下接種量5 10% (v/v)，pH為
6.5 7. 5，發(fā)酵溫度25 40°C，優(yōu)選28 32°C，培養(yǎng)時(shí)間50 60h，通過攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量按照以下要求控制溶氧量在菌體生長期，例如O 18h，控制溶氧量為20 30%，在菌體量達(dá)到穩(wěn)定之后，例如18h 60h，控制溶氧量為5 10%。在本發(fā)明提供的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟1)斜面培養(yǎng)將冷藏的發(fā)酵菌株接種到斜面上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h活化；2)種子培養(yǎng)從活化的斜面挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min，培養(yǎng)18h ；3)分批發(fā)酵培養(yǎng)5 10% (v/v)，pH為6. 5 7. 5，發(fā)酵溫度25 40°C，培養(yǎng)時(shí)間50 60h，初始通氣量I. O I. 5vvm,初始攪拌轉(zhuǎn)速300 400r/min，通過攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量按照以下要求控制溶氧量在O 18h，控制溶氧量為20 30%，在18h至發(fā)酵結(jié)束，控制溶氧量為5 10%。由于cAMP的生物合成是一個(gè)好氧反應(yīng)，氧氣充足而合適的供應(yīng)是產(chǎn)物提高的前提，通過以往的發(fā)酵溶氧曲線可知，恒定轉(zhuǎn)速下的溶氧曲線會(huì)出現(xiàn)前期幾乎為零的溶氧饑餓狀態(tài)，而在后期又會(huì)超過50%，并沒有被菌體充分利用的情況。溶氧過低，會(huì)對菌體的生長不利，從而影響cAMP的產(chǎn)量，溶氧過高，則會(huì)使菌體大量迅速合成，底物大量被消耗，導(dǎo)致流向產(chǎn)物的碳源相對不足，也使終產(chǎn)率下降。綜上所述，本發(fā)明人摸索出發(fā)酵菌體不同階段的溶氧需求，由此提供一種兩階段溶氧控制策略，第一階段菌體生長階段(O 18h)控制溶氧量為20 30%，避免了發(fā)酵前期溶氧過低對菌體的生長不利，同時(shí)可以減少副產(chǎn)物乳酸、乙酸等有機(jī)酸的形成；18h后，當(dāng)菌體量達(dá)到穩(wěn)定時(shí)，調(diào)整溶氧量為5 10%，繼續(xù)培養(yǎng)30 40h，直至發(fā)酵結(jié)束，此時(shí)避免發(fā)酵后期無需過高溶氧而產(chǎn)生的攪拌功率和空氣供應(yīng)的浪費(fèi)。所述溶氧量的控制以離線檢測發(fā)酵液中乳酸濃度作為參考信號(hào)，使整個(gè)發(fā)酵過程乳酸濃度控制在20mmol/L以下，過高則適當(dāng)增加溶氧。此外，發(fā)酵液的PH設(shè)定點(diǎn)為6. 5，當(dāng)pH降到設(shè)定點(diǎn)以下時(shí)，加入堿性物質(zhì)流加液，例如6 10mol/L的氫氧化鈉，氫氧化鉀，氨水或碳酸鈉，直至pH回到設(shè)定點(diǎn)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的兩階段溶氧控制策略發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法的優(yōu)益之處在于，根據(jù)菌體不同階段的溶氧需求特點(diǎn)，提供一種兩階段溶氧控制策略，工藝簡單易行，可以大大提高底物的利用效率，與不控制溶氧相比，發(fā)酵產(chǎn)物環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)量提高56.2%。并且減少發(fā)酵過程中有機(jī)酸的產(chǎn)生。而且本發(fā)明參考發(fā)酵過程中乳酸的濃度信號(hào)適時(shí)變化溶氧，操作更加合理有據(jù)，發(fā)酵過程中無需增加額外設(shè)備，還可以節(jié)約發(fā)酵后期的攪拌和供氣的電能，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，與傳統(tǒng)的化學(xué)法合成相比，還具有反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，副產(chǎn)物少等優(yōu)點(diǎn)。生物材料的保藏節(jié)桿菌(Arthrobacter sp. )A302已經(jīng)于2010年I月18日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院，中科院微生物研究所(郵編=100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584。關(guān)于節(jié)桿菌A302的詳細(xì)信息，還可參見本申請人于2010年6月4日提交的中國發(fā)明專利申請201010191515. 6。
具體實(shí)施例方式以下參照具體的實(shí)施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實(shí)施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實(shí)施例中所使用的菌株擴(kuò)培方法如下I)斜面培養(yǎng)基(g/L)配方葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化鈉3、瓊脂20。將冷藏的發(fā)酵菌株接種到斜面上，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h活化。
0030]2)種子培養(yǎng)基(g/L)配方葡萄糖10、蛋白胨10、酵母膏5、牛肉膏10、氯化鈉3、生物素O. 001、酸水解酪蛋白5。從活化的斜面挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，300C，200r/min,培養(yǎng)18h擴(kuò)培。以下各實(shí)施例中發(fā)酵產(chǎn)物cAMP含量所采用的分析方法如下發(fā)酵液中的產(chǎn)物cAMP采用Agilent 1100高效液相色譜儀測定(HPLC)。色譜柱江蘇淮陰漢邦科技有限公司Lichrospher C18 (4. 6x250mm, 5 μ m),柱溫30°C,檢測器為紫外檢測器(254nm)，流動(dòng)相為V (甲醇)V (pH6. 6的磷酸三乙胺溶液)=30 : 70 ;流速O. 8mL/min ;進(jìn)樣量20μ L。精確稱取環(huán)磷腺苷的標(biāo)準(zhǔn)品，用重蒸三重水配制成質(zhì)量濃度約50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；將經(jīng)預(yù)處理的樣品用去離子水稀釋至適當(dāng)濃度，并用O. 45 μ m微孔膜進(jìn)行過濾后，作為樣品溶液待檢測，發(fā)酵樣品根據(jù)峰面積計(jì)算cAMP產(chǎn)量。實(shí)施例I發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50、磷酸氫二鉀10、磷酸二氫鉀10、硫酸鎂I、蛋白胨4、生物素O. 003、次黃嘌呤6 ;于121°C高壓蒸汽滅菌15min。在發(fā)酵罐(BioFlo110 7. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培養(yǎng)基，裝液量3L，滅菌后，以10%接種量接種，溫度30°C，通氣量I. 5vvm，轉(zhuǎn)速300r/min，標(biāo)定溶氧百分點(diǎn)。溶氧參數(shù)和葉輪轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，并配以適當(dāng)?shù)耐L(fēng)量，在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為30 %，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為10 %。通過流加質(zhì)量濃度為20 %的氨水控制pH 7.0。發(fā)酵60h結(jié)束后，HPLC檢測，cAMP含量為9. 87g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 165g/ (L · h)。
實(shí)施例2發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜50、磷酸氫二鉀10、磷酸二氫鉀10、硫酸鎂10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺苷6，于121°C高壓蒸汽滅菌15min。在發(fā)酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培養(yǎng)基，裝液量3. 5L，滅菌后，以8 %接種量接種，溫度32°C，通氣量I. 2vvm，轉(zhuǎn)速350r/min，標(biāo)定溶氧百分點(diǎn)。溶氧參數(shù)和葉輪轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，并配以適當(dāng)?shù)耐L(fēng)量，在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為30%，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為8%。通過流加質(zhì)量濃度為20%的氫氧化鈉控制PH7. 2。發(fā)酵54h結(jié)束后，HPLC檢測，cAMP含量為9. 64g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 179g/(L · h)。實(shí)施例3發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖50、磷酸氫二鉀10、磷酸二氫鉀10、硫酸鎂10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺苷三磷酸6，于121 °C高壓蒸汽滅菌15min。在發(fā)酵罐(BioFlo110 7. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培養(yǎng)基，裝液量4L，滅菌后，然后以5 %接種量接種，溫度28 V，通氣量I. Ovvm,轉(zhuǎn)速400r/min，標(biāo)定溶氧百分點(diǎn)。溶氧參數(shù)和葉輪轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，并配以適當(dāng)?shù)耐L(fēng)量，在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為25%，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為5%。通過流加質(zhì)量濃度為20%的氫氧化鉀控制PH 7.5。發(fā)酵60h結(jié)束后，HPLC檢測，cAMP含量為9. 04g/L,生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 151g/(L · h)。實(shí)施例4發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):糖蜜50、磷酸氫二鉀10、磷酸二氫鉀10、硫酸鎂10、蛋白胨4、生物素O. 003、腺嘌呤6，于121°C高壓蒸汽滅菌15min。在發(fā)酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培養(yǎng)基，裝液量
3.5L，滅菌后，然后以8 %接種量接種，溫度30°C，通氣量I. 2vvm，轉(zhuǎn)速350r/min，標(biāo)定溶氧百分點(diǎn)。溶氧參數(shù)和葉輪轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，并配以適當(dāng)?shù)耐L(fēng)量，在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為30 %，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為5 %，通過流加質(zhì)量濃度為20 %的氨水控制pH 7. 2。發(fā)酵54h結(jié)束后，HPLC檢測，cAMP含量為8. 89g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 165g/ (L · h)。實(shí)施例5發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖50、磷酸氫二鉀10、磷酸二氫鉀10、硫酸鎂10、蛋白胨
4、生物素O.003、肌苷6，于121°C高壓蒸汽滅菌15min。在發(fā)酵罐(BioFlo1107. 5L NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)中加入培養(yǎng)基，裝液量3L,滅菌后，然后以10%接種量接種，溫度32°C，通氣量I. 5vvm,轉(zhuǎn)速300r/min，標(biāo)定溶氧百分點(diǎn)，然后溶氧參數(shù)和葉輪轉(zhuǎn)速關(guān)聯(lián)，并配以適當(dāng)?shù)耐L(fēng)量，在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為25 %，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為8 %。通過流加質(zhì)量濃度為20 %的氫氧化鈉控制pH 7.0。
發(fā)酵60h結(jié)束后，HPLC檢測，cAMP含量為9. 43g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 157g/(L · h)。對比例I未采取兩階段溶氧控制進(jìn)行分批培養(yǎng)，其他條件均與實(shí)施例I的方法相同。最終檢測發(fā)酵產(chǎn)物cAMP的含量為6. 32g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 105g/ (L · h)。對比例2 在發(fā)酵第一階段(約O 18h)控制溶氧量為5%，第二階段(約18 60h)控制溶氧量為40%，其他條件均與實(shí)施例I的方法相同。最終檢測發(fā)酵產(chǎn)物cAMP的含量為7. 52g/L，生產(chǎn)強(qiáng)度為O. 125g/ (L · h)。
權(quán)利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法，所述方法采用兩階段溶氧量控制的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號(hào)為CGMCC No. 3584的節(jié)桿菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述兩階段溶氧量控制的操作如下在菌體生長期階段控制溶氧量為20 30%，在菌體量達(dá)到穩(wěn)定之后控制溶氧量為5 10%。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法中pH控制為6.5 7. 5 ;優(yōu)選地，所述PH的控制通過流加堿性物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)；更優(yōu)選地，所述堿性物質(zhì)選自氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨水和碳酸鈉中的一種或幾種。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述初始發(fā)酵培養(yǎng)基中含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和環(huán)磷酸前體物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述碳源選自糖蜜、葡萄糖、蔗糖、果糖中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述碳源的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為30 50g/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述氮源選自酵母粉、酵母膏、玉米漿、蛋白胨、尿素、硫酸銨中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述氮源的初始濃度為0.01 .100g/L，優(yōu)選為 10 30g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I至5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)鹽選自鉀鹽、鈉鹽、鎂鹽、碳酸鹽、硫酸鹽中的一種或幾種；優(yōu)選地，所述無機(jī)鹽的初始濃度為O. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求I至7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述環(huán)磷酸前體物質(zhì)選自腺苷、腺苷單磷酸、腺苷三磷酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、肌苷、肌苷酸中的一種或幾種，優(yōu)選地，所述磷酸前體物質(zhì)的初始濃度為0. 01 100g/L，優(yōu)選為I 10g/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求I至8中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的條件如下接種量5 10%卜八)，？!1為6.5 7.5，發(fā)酵溫度25 401，培養(yǎng)時(shí)間.50 60h，通過攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量按照以下要求控制溶氧量在菌體生長期，例如O 18h，控制溶氧量為20 30 %，在菌體量達(dá)到穩(wěn)定之后，例如18 60h，控制溶氧量為5 10 %。
10.根據(jù)權(quán)利要求I至9中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟 1)斜面培養(yǎng)將冷藏的發(fā)酵菌株接種到斜面上，30°c培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h活化； 2)種子培養(yǎng)從活化的斜面挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基，30°C，200r/min，培養(yǎng)18h； 3)分批發(fā)酵培養(yǎng)5 10%(v/v), pH為6. 5 7. 5，發(fā)酵溫度25 40°C，培養(yǎng)時(shí)間.50 60h，初始通氣量I. O I. 5vvm,初始攪拌轉(zhuǎn)速300 400r/min，通過攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量按照以下要求控制溶氧量在O 18h，控制溶氧量為20 30%，在18 60h，控制溶氧量為5 10%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種兩階段溶氧量控制發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷的方法。本發(fā)明提供的方法采用兩階段溶氧量控制的方式分批發(fā)酵生產(chǎn)環(huán)磷酸腺苷，發(fā)酵菌株為保藏編號(hào)為CGMCC No.3584的節(jié)桿菌，在菌體生長期階段控制溶氧量為20～30％，在菌體量達(dá)到穩(wěn)定之后控制溶氧量為5～10％。本發(fā)明提供的方法可以顯著提高環(huán)磷酸腺苷的產(chǎn)量，發(fā)酵過程中無需增加額外設(shè)備，還可以節(jié)約發(fā)酵后期的攪拌和供氣的電能，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12P19/32GK102899372SQ20111021088
公開日2013年1月30日 申請日期2011年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月26日
發(fā)明者應(yīng)漢杰, 陳曉春, 李磊, 柏建新, 陳勇, 謝婧婧, 吳菁嵐 申請人:南京工業(yè)大學(xué)