專利名稱：腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測試劑，具體涉及一種腸出血性大腸桿菌StXl基因檢測試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
2011年5月德國爆發(fā)腸出血性大腸桿菌(EHEC)感染疫情，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的報(bào)道，截止6月5日，德國已報(bào)告630例HUS病例，死亡15例；1601例EHEC感染病例，死亡6 例。此外，歐洲奧地利、捷克、瑞典、丹麥、荷蘭、波蘭、法國、瑞士、挪威、西班牙、盧森堡和英國等12國共報(bào)道31例HUS (死亡1例)和EHEC感染病例73例。美國報(bào)道2例HUS病例。腸出血性大腸桿菌感染是一種人畜共患病，主要引起腹部絞痛和輕度腹瀉，一些病例為血性腹瀉(出血性腸炎)。多數(shù)病人10天內(nèi)康復(fù)，少數(shù)病人特別是幼兒和老年人，可出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，如以急性腎功能衰竭、溶血性貧血和血小板減少為特點(diǎn)的溶血尿毒綜合癥(HUS)。一般5°/Γ Ο%的EHEC感染者可發(fā)展為溶血尿毒綜合癥，病例死亡率為3%至5%。EHEC致病主要依靠分泌毒素來使人體受到損害。EHEC產(chǎn)生的毒素能使vero細(xì)胞產(chǎn)生病變，故稱vero毒素；又因與志賀菌的毒素在生物學(xué)特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦稱志賀樣毒素(81^8￡1-111 ^0^11，31^)或志賀毒素(計(jì)力。志賀毒素在腸道中能夠殺傷上皮細(xì)胞，并引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)和廣泛的組織病理學(xué)損傷，從而導(dǎo)致血痢或無血性腹瀉。EHEC是大腸桿菌的一個(gè)亞型，0157:H7是EHEC的主要血清型，此外還包括026、 0111、0103、0113、0117、0128等四十多個(gè)血清型，此次引起德國EHEC感染疫情的主要為 0104 :H4血清型。鑒于EHEC危害的嚴(yán)重性以及覆蓋血清型的廣泛性，因此準(zhǔn)確、快速檢測腸出血性大腸桿菌具有十分重要的意義。傳統(tǒng)腸出血性大腸桿菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復(fù)雜、所需試劑繁多等缺點(diǎn)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代檢測要求。以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)為代表的病原核酸檢測技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問題，如普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)需要專門的儀器，而且存在容易交叉污染和操作過程煩瑣的缺點(diǎn)。而熒光實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real time PCR)技術(shù)雖然較好地解決了交叉污染的問題，并簡化了操作過程，但卻需要更復(fù)雜的定量測定儀器，因此不適用于現(xiàn)場快速檢測。而且實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR技術(shù)中熒光探針的成本較高，加大了推廣應(yīng)用的難度。免疫學(xué)檢測技術(shù)快速簡便成本低廉，但要求高質(zhì)量高穩(wěn)定性的單克隆抗體，否則因準(zhǔn)確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。所以及時(shí)運(yùn)用生物技術(shù)發(fā)展的最新成果對滿足病原微生物檢測要求的不斷提高具有重要意義。其中恒溫?cái)U(kuò)增 (Isothermal Amplification)核酸快速檢測技術(shù)是病原核酸檢測技術(shù)上的長足進(jìn)步，現(xiàn)已建立起來的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有很多的優(yōu)越性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于解決現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種檢測效果更全面、特異性高、漏檢率低的腸出血性大腸桿菌檢測試劑盒。本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)一種腸出血性大腸桿菌Stxl基因檢測試劑盒，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒包括以stxl基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。志賀毒素由原噬菌體所編碼，它由A、B 2個(gè)亞單位組成，stx-A為RNA- N-糖苷酶 (RNA- N- glucosidase)催化亞單位，是毒素的毒力區(qū)。StxB為靶受體結(jié)合區(qū)，可以激發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，是開發(fā)疫苗可選擇的重要靶分子。stx可分成2類即stxl和stx2。本專利檢測的是stxl基因(GeneBank的gi為32400301 )，具有很高的特異性。作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌StXl基因檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩對引物為
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒還包括feiDNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；
所述的反應(yīng)液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；
所述的樣品預(yù)處理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；
所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為腸出血性大腸桿菌基因組DNA ；
所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的濃度各為0.2 0.25 μmol/L0作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌Stxl基因檢測試劑盒的最優(yōu)選實(shí)施方式， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；
所述的反應(yīng)液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；
所述的樣品預(yù)處理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2體積 % Triton X-100 ；
所述的顯色液為STOR Green I ；
所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為1.6ymol/L ；
所述的外引物F3/B3的濃度為0. 2 μ mol/L。作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌Stxl基因基因檢測試劑盒的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。作為本發(fā)明腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的更優(yōu)選實(shí)施方式，所述的 A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和fei DNA聚合酶的混合而成。本發(fā)明還提供一種腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的使用方法，該方法包括如下步驟
(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；
(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA;
(3)在反應(yīng)容器中加入BstDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、 外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；
(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；
所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以stxl基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對弓I物。作為本發(fā)明使用腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的兩對引物為
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。作為本發(fā)明使用腸出血性大腸桿菌Stxl基因檢測試劑盒的方法的優(yōu)選實(shí)施方式，步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。本發(fā)明所說的基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplication of DNA,簡稱LAMP)快速檢測腸出血性大腸桿菌的方法，是利用feiDNA聚合酶和根據(jù)靶基因序列設(shè)計(jì)的兩對特殊的內(nèi)、外引物(即內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3)，特異性識別靶序列上的六個(gè)獨(dú)立區(qū)域，啟動(dòng)循環(huán)鏈置換反應(yīng)，在靶標(biāo)DNA區(qū)啟動(dòng)互補(bǔ)鏈合成， 結(jié)果在同一鏈上互補(bǔ)序列周而復(fù)始形成有很多環(huán)的花椰菜結(jié)構(gòu)的莖-環(huán)DNA混合物。LAMP 反應(yīng)過程中，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物——焦磷酸鎂乳白色沉淀，即可通過肉眼觀察判定結(jié)果。LAMP反應(yīng)是在恒溫(63 65°C)條件下 45 90分鐘內(nèi)完成。這種比較溫和的溫度條件以及沒有溫度循環(huán)使所需儀器簡單化，克服了傳統(tǒng)PCR固有的檢測時(shí)間長、容易污染及檢測成本高等缺點(diǎn)。此外，這種檢測方法對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低，實(shí)際操作極為簡便，不需要特殊的試劑和儀器設(shè)備，有利于建立成本低廉的快速篩選體系。LAMP法是一種簡便、快速、高度特異性的基因擴(kuò)增法。將恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)與PCR技術(shù)(包括熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù))進(jìn)行比較，可以發(fā)現(xiàn)該技術(shù)在靈敏度、特異性和檢測范圍等方法學(xué)指標(biāo)上相當(dāng)于或優(yōu)于PCR技術(shù)，且不依賴任何專門的儀器設(shè)備即可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，而且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR技術(shù)。目前國家標(biāo)準(zhǔn)中以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化分析和血清學(xué)分型鑒定的通行方法， 初步鑒定需2 3天，完成鑒定報(bào)告需10 15天；采用本發(fā)明的檢測試劑盒僅需2小時(shí)。 并且，本發(fā)明的反應(yīng)體系中加入了顯色液，鑒定結(jié)果更為直觀清晰。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明的檢測試劑盒只需一個(gè)恒定溫度就能擴(kuò)增反應(yīng)，不需要特殊試劑與設(shè)備，檢測成本低；2.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒應(yīng)用六個(gè)區(qū)段，四條引物，根據(jù)是否擴(kuò)增就能判斷靶標(biāo)物質(zhì)的存在與否，因此具有高特異性；3.本發(fā)明的檢測試劑盒擴(kuò)增快速且高效，在不到1小時(shí)即可完成擴(kuò)增，且產(chǎn)率高； 4.本發(fā)明的檢測試劑盒靈敏度高，擴(kuò)增模板僅需10拷貝或更少；5.本發(fā)明的基因快速診斷試劑盒鑒定簡便，從dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生副產(chǎn)物—— 焦磷酸鎂沉淀，可通過肉眼觀察鑒定，并且加入顯色液后，陰陽性結(jié)果顯色差異顯著，驗(yàn)證率高，更加明顯可靠；6.由于選擇了高保守性的stxl基因作為靶基因設(shè)計(jì)引物，使得本發(fā)明的檢測試劑盒檢測腸出血性大腸桿菌的準(zhǔn)確率更高；7.在本發(fā)明檢測試劑盒中采用特制的反應(yīng)管，減少了氣溶膠污染的可能性，同時(shí)方便操作。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面將進(jìn)一步闡述本發(fā)明的具體實(shí)施例。下列縮略語適用于本發(fā)明
LAMP loop-mediated isothermal amplification,環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增
dNTP :deoxyribonucleoside triphosphate,脫氧核苷三憐酸
Bst 酶Bst DNA polymerase (large fragment), Bst DNA 聚合酶(大片段)
EDTA :ethylenediamine tetraacetic acid,乙二胺四乙酸
DNA deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸
Betaine 舌甘菜堿
Triton X-100 聚乙二醇辛基苯基醚 Stxl 1類志賀毒素實(shí)施例1試劑盒的制備
(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物
外引物 F3 (1) :(SEQ ID NO 1)
GTAGATTCGCTGAATGTCATT
外引物 B3 (1) :(SEQ ID NO 2)
TGTTAACAAATCCTGTCACAT
內(nèi)引物 FIP (1) :(SEQ ID NO 3)
TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT
內(nèi)引物 BIP (1) :(SEQ ID NO 4)
CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA。(2)購置DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有2mmol/LdNTP、25mmol/L Tris-Cl、12. 5mmol/L KCl、12. 5mmol/L (NH4)2SO4UOmmo 1/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿、內(nèi)引物FIP/BIP各1. 2ymol/L和外引物F3/B3各0. 2 μ mol/L，置于容器；
(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有20mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),2 mmol/ L EDTA 和 1. 2 體積 % Triton X-100，置于容器；
(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(6)購置顯色液STORGreen I，置于容器；
(7)提取陽性對照提取腸出血性大腸桿菌基因組DNA，置于容器；
(8)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。制備工藝簡述如下
1、將內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3合成純化后，定量配制，濃度檢測，抽樣質(zhì)檢；
2、將上述(2廣(4)步驟配制的液體無菌分裝，并按照實(shí)驗(yàn)用進(jìn)行濃度確定，抽樣質(zhì)檢；
3、將穩(wěn)定液分裝，抽樣質(zhì)檢；
4、將陽性對照標(biāo)本制備，分裝，抽樣質(zhì)檢；
5、組裝試劑盒。實(shí)施例2試劑盒的制備(1)按以下序列經(jīng)DNA合成儀合成寡聚脫氧核酸引物
外引物 F3 (2) :(SEQ ID NO 5)
TGCAGGGATCAGTCGTAC
外引物 B3 (2) :(SEQ ID NO 6)
AGATCATCCAGTGTTGTACG
內(nèi)引物 FIP (2) :(SEQ ID NO 7)
GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC
內(nèi)引物 BIP (2) :(SEQ ID NO 8)
TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。(2)購置DNA聚合酶-.Bst DNA聚合酶置于容器；
(3)配制反應(yīng)液和引物反應(yīng)液含有1. 6mmol/LdNTP、20mmol/L Tris-Cl、10mmol/L KClUOmmol/L (NH4) 2SO4、8mmol/L MgS04、0. 1 體積％ TritonX_100、0. 8mol/L 甜菜堿、內(nèi)弓丨物FIP/BIP各2. 0 μ mol/L和外引物F3/B3各0. 25 μ mol/L,置于容器；
(4)配制樣品預(yù)處理液樣品預(yù)處理液含有10mmol/L Tris- HCl (pH 8.0),1 mmol/ L EDTA 和 1. 0 體積 % Triton X-100，置于容器；
(5)購置穩(wěn)定液石蠟油，置于容器；
(6)購置顯色液EVAGreen I，置于容器；
(7)提取陽性對照提取腸出血性大腸桿菌基因組DNA，置于容器；
(8)將上述7個(gè)容器裝成試劑盒，封裝。其他同實(shí)施例1。實(shí)施例3腸出血性大腸桿菌Stxl基因檢測試劑盒的應(yīng)用 1材料與方法
1. 1材料 1. 1. 1菌株
本發(fā)明采用菌株有25株，主要來源于廣州出入境檢驗(yàn)檢疫局、臨床分離菌株和環(huán)境分離菌株。詳見表1。 表1菌株名稱及來源
權(quán)利要求
1.一種腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒包括以stxl基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的兩對引物為外引物F3 (1) GTAGATTCGCTGAATGTCATT 外引物B3 (1) TGTTAACAAATCCTGTCACAT 內(nèi)引物FIP (1)TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT 內(nèi)引物BIP (1)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或外引物F3 (2) TGCAGGGATCAGTCGTAC 外引物B3 (2) AGATCATCCAGTGTTGTACG 內(nèi)引物FIP (2)GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC 內(nèi)引物BIP (2)TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒還包括fei DNA聚合酶、反應(yīng)液、穩(wěn)定液、樣品預(yù)處理液、顯色液和陽性對照液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度4-10 U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含1. 6 2mmol/L dNTP、20 25mmol/L Tris-HCl、10 12. 5mmol/L KCl、10 12. 5mmol/L (NH4)2SO4,8 10mmol/L MgS04、0. 1 0· 125 體積％ TritonX-100、 0.8 lmol/L甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含10 20 mmol/L pH 8.0的Tris- HC1、1 2 mmol/L EDTA和 1 1. 2 體積 % Triton X-100 ；所述的顯色液為SYBR Green I或Eva Green ； 所述穩(wěn)定液為石蠟油；所述的陽性對照為腸出血性大腸桿菌基因組DNA ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP各為1.2 2. Oymol/L，外引物F3/B3的濃度各為0.2 0.25 μmol/L0
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于， 所述的fei DNA聚合酶酶濃度8 U/ μ L ；所述的反應(yīng)液含2mmol/L dNTP、25mmol/L Tris-HCl、12. 5mmol/L KC1、12. 5mmol/L (NH4) 2S04UOmmol/L MgS04、0. 125 體積 ％ TritonX-100、lmol/L 甜菜堿；所述的樣品預(yù)處理液含20 mmol/L pH 8. 0的Tris- HCl,2 mmol/L EDTA和1. 2體積 % Triton X-100 ；所述的顯色液為STOR Green I ；所述的內(nèi)引物FIP/BIP的濃度為1.6ymol/L ；所述的外引物F3/B3的濃度為0. 2 μ mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3、4或5所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒還包括反應(yīng)管，所述的反應(yīng)管由管體和管蓋兩部分組成，管體內(nèi)腔的下部設(shè)有將其分隔成A、B兩個(gè)空腔的縱向延伸的隔板。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒，其特征在于，所述的A、B兩個(gè)空腔中分別裝有工作液或顯色液，兩個(gè)空腔中的液體上層均由穩(wěn)定液封存，所述工作液為反應(yīng)液和fei DNA聚合酶的混合而成。
8.一種使用如權(quán)利要求3所述的腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟(1)將待測樣品離心，去上清，得到沉淀；(2)將步驟(1)的沉淀加入樣品預(yù)處理液，混合均勻，沸水浴滅活后冰上冷卻，高速離心，上清即為樣品模板DNA;(3)在反應(yīng)容器中加入feiDNA聚合酶0. 9 1. 8體積份數(shù)、反應(yīng)液38 40體積份數(shù)、 穩(wěn)定液52 54. 5體積份數(shù)、樣品模板DNA 4. 5、體積份數(shù)、內(nèi)引物FIP/BIP各2體積份數(shù)、 外引物F3/B3各4體積份數(shù)，恒溫反應(yīng)；(4)在上述反應(yīng)容器和陽性對照中分別加入顯色液，混勻，樣品組顯色與對照組相同則為陽性，否則為陰性；所述步驟(3)中的內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3為以stxl基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對弓I物。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的使用腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的方法，其特征在于，所述的兩對引物為外引物F3 (1) GTAGATTCGCTGAATGTCATT 外引物B3 (1) TGTTAACAAATCCTGTCACAT 內(nèi)引物FIP (1)TCAATCATCAGTAAAGACGTACCTCTTTTCGCTCTGCAATAGGTACT 內(nèi)引物BIP (1)CAGGGGATAATTTGTTTGCAGTTGATTTTCGTTCAACAATAAGCCGTAGA 或外引物F3 (2) TGCAGGGATCAGTCGTAC 外引物B3 (2)AGATCATCCAGTGTTGTACG 內(nèi)引物FIP (2)GTCAGTGAGGTTCCACTATGCGTTTTAATCGCCATTCGTTGACTAC 內(nèi)引物BIP (2)TCTGTGGCAAGAGCGATGTTTTTTCCCTCTGTATTTGCCGAA。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的使用腸出血性大腸桿菌stxl基因檢測試劑盒的方法， 其特征在于，步驟(3)中，恒溫反應(yīng)的反應(yīng)條件為溫度63 65°C，反應(yīng)時(shí)間45 90min。
全文摘要
本發(fā)明提供一種腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒，所述的腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒包括以stx1基因?yàn)榘谢?、基于環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)設(shè)計(jì)的兩對引物內(nèi)引物FIP/BIP和外引物F3/B3。本發(fā)明的腸出血性大腸桿菌stx1基因檢測試劑盒檢測效果更全面、漏檢率低。
文檔編號C12Q1/04GK102251044SQ201110211370
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者盧鐘山, 曹以誠, 杜正平, 王傳現(xiàn), 田楨干, 章琪, 譚慧媚, 陸曄, 陳洵 申請人:中華人民共和國上海出入境檢驗(yàn)檢疫局, 廣州華峰生物科技有限公司