專利名稱：高穩(wěn)定性耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌及脂肪酶和其基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程與酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌，其耐有機溶劑脂肪酶的基因，以及該耐有機溶劑脂肪酶在有機相中催化拆分手性化合物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酶(lipase，EC 3. 1. 1. 3，甘油三酰酯水解酶)是一類能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長鏈脂肪酸的酶類，在洗滌、制革、食品、生物化工、造紙、醫(yī)藥、環(huán)保等行業(yè)被廣泛應(yīng)用。脂肪酶在有機相中可以完成酯化、交換及轉(zhuǎn)酯等反應(yīng)，并具有區(qū)域選擇性、立體選擇性、較高的穩(wěn)定性，尤其是它的立體選擇催化特性，可以用于化學(xué)法難以進行的消旋化合物的拆分、不對稱合成等。近年來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)致力于應(yīng)用脂肪酶在有機體系中實現(xiàn)手性化合物，尤其是藥物中間體的立體選擇性水解或拆分，如利用微生物脂肪酶可完成酮基布洛芬、反應(yīng)停、心得安等手性藥物的立體選擇性水解或拆分。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，酶催化拆分外消旋化合物具有反應(yīng)條件溫和、節(jié)省能源、專一性強、副反應(yīng)少、產(chǎn)品純度高、反應(yīng)步驟簡單、不需手性源、產(chǎn)品成本低等優(yōu)點。
雖然脂肪酶在有機溶劑中催化具有很多優(yōu)勢，但是酶一般在有機溶劑中不穩(wěn)定。尤其是親水性的有機溶劑往往會剝奪酶表面的水分子而使其失活。為了提高酶的穩(wěn)定性，人們采用了化學(xué)修飾、固定化或者蛋白質(zhì)工程對酶進行改造。然而如果酶天然在有機溶劑中穩(wěn)定，這樣就更利于其在有機相中的應(yīng)用。因此尋找天然耐有機溶劑的脂肪酶，使其在有機溶劑或含有機溶劑的環(huán)境中具有較高的催化活性，已成為脂肪酶研究領(lǐng)域的一個重要方向。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種耐有機溶劑脂肪酶的產(chǎn)生菌、耐有機溶劑脂肪酶、耐有機溶劑脂肪酶基因以及該脂肪酶在有機相中催化手性化合物拆分的應(yīng)用。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明首先從油污土壤等樣品中篩選獲得一株耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌，分類命名為BurWiolderia ambifaria YCJOl，保藏日期為2011年3月6 日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏登記號為CCTCC NO =M 2011058。本發(fā)明對洋蔥伯克霍爾德氏菌^zr姑Weria ambifaria YCJOl的生物學(xué)特征進行鑒定，該菌株為革蘭氏陰性菌株，菌落呈米白色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤；顯微鏡觀察菌體為桿菌，0. 8 1. 0X1. 6 3. 2mm，專性好氧，生長的最適溫度為30°C !35°C。其生理生化特性表現(xiàn)在不出現(xiàn)反硝化反應(yīng)、明膠反應(yīng)結(jié)果為陽性，氧化酶陽性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麥芽糖。經(jīng)BIOLOG全自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，Sim值為0.576 (24h培養(yǎng))，結(jié)果顯示該菌鳳予Burkholderia屬；16S rDNA序列分析結(jié)果表明，該菌株與數(shù)據(jù)庫中^zr姑Weriaambifaria MC40-6菌的同源性為99%。綜合BIOLOG和16S rDNA分析結(jié)果，該菌株鑒定為 Burkholderia ambifaria，^^ 為 Burkholderia ambifaria YCJO1。H呢焚Burkholderia ambifaria YCJOl進行了產(chǎn)酶條件優(yōu)化，優(yōu)化后產(chǎn)酶量高達126. lU/mL,比優(yōu)化前40. 2 U/mL提高了 2. 1倍。本發(fā)明對該菌產(chǎn)生的胞外脂肪酶進行了純化，經(jīng)過兩步分離純化，得到電泳純的耐有機溶劑脂肪酶，命名為脂肪酶YCJ01，純化后脂肪酶的比活性達到4609. 5 U/mg，表觀分子量為33kDa。本發(fā)明對脂肪酶YCJOl進行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，實驗證明該脂肪酶對多種有機溶劑都具有良好的耐受性。脂肪酶YCJOl的最適反應(yīng)PH為7. 5，在PH 5. 0 8. 0的范圍具有較高的穩(wěn)定性。其最佳反應(yīng)溫度為60°C，此酶的最佳人工底物為對硝基苯酚棕櫚酸酯 (C16)。本發(fā)明分離克隆到該菌株所產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的編碼基因，它具有
SEQ ID NO:所示的核苷酸序列:iatggccagatcgatgcgttccagggtggtggcaggggcagtggcttgcgcgatgagcgtcgcgccgttcgcggggacgaccgcgctgatgacgctcgcgacgacgcgcgcggcgatggcggcaaccgcgccggcggacgactacgcgacgacgcgttatccgatcatcctcgtgcacgggctcaccggcaccgacaagtaCgCgggCgtgctcgagtactggtacggcatccaggaggacctgcagcagcatggcgcgaccgtctacgtcgcgaacctgtcgggattccagagcgacgacgggccgaatgggcgcggtgaacaactgctcgcttacgtcaagacggtgctcgccgcgaccggtgcgaccaaggtgaacctggtcggtcacagccagggcggcctcacgtcgcgctatgtcgcggccgtcgcacccgatctCgtCgCgtCggtgacgacgatcggcacgccgcatcgcggctcagagttcgccgacttcgtgcagagcgtactcgcctacgatccgaccggattgtcgtcgtcggtgatcgcagcgttcgccaatgtgttcggtatcctgacgagcagcagC 3.3. C 3.3. C 3. C CaaccaggacgcgctcgccgcactgaagacgctgacgacttcccaggccgccacgtacaaccagaattacccgagcgcgggcctcggcgcgccgggcagctgccagacgggtgcgccgacggaaaccgtcggtggcaatacgcacctgctgtattcgtgggccggcacggcgatccagccgaccatctccgCgttCggCgtgacgggcgcgacggataccagcacgattccgctgatcgacccggcaaacgcgctggacctgtcgacgcttgcgttgttcggcacgggcacggtgatgatcaatcgcgcctcgggccagaacgacgggctcgtgtcgaagtgcagtgcgctgtacgggaaggtgctgagcacgagctacaagtggaaccatctcgatgagatcaaccagttgctcggtgtgcgcggcgcgaatgcggaagatccggtcgcggtgatccgcacgcatgcgaaccggctgaaaCtCgCgggCg
tgtga為此基因的改造并在各種外源基因表達系統(tǒng)中高效表達提供了優(yōu)良的基因材料。通過PCR法分離克隆了這一耐有機溶劑脂肪酶基因，DNA全序列分析結(jié)果表明，該耐有機溶劑脂肪酶基因全長1095個核苷酸，編碼364個氨基酸，與Burkholderiei c印aciaS31脂肪酶
基因同源性為92.4%，氨基 狻序列同源性為96. 4%c 氨基酸序列示于SEQID NO 2 :MetAla ArgSerMetArgSerArgValValAla GlyAlaValAlaCysAla MetSerVal AlaPro PheAlaGlyThrThrAlaLeuMetThr LeuAlaThrThrArgAla AlaMetAla AlaThr AlaProAlaAspAspTyrAlaThrThr ArgTyrProlielieLeu ValHisGly LeuThr GlyThrAspLysTyrAlaGlyValLeu GluTyrTrpTyrGlylie GlnGluAsp LeuGln GlnHisGlyAlaThrValTyrValAla AsnLeuSerGlyPheGln SerAspAsp GlyPro AsnGlyArgGlyGluGlnLeuLeuAla TyrValLysThrValLeu AlaAlaThr GlyAla ThrLysValAsnLeuValGlyHisSer GlnGlyGlyLeuThrSer ArgTyrVal AlaAla ValAlaProAspLeuValAlaSer ValThrThrlieGly ThrPro HisArgGly SerGlu PheAlaAspPheValGlnSerVal LeuAlaTyrAspPro ThrGly LeuSerSer SerVal IleAlaAlaPheAlaAsnValPhe GlylieLeuThrSer SerSer AsnAsnThr AsnGln AspAlaLeuAlaAlaLeuLysThr LeuThrThrSerGln AlaAla ThrTyrAsn GlnAsn TyrProSerAlaGlyLeuGlyAla ProGlySerCysGln ThrGly AlaProThr GluThr ValGlyGlyAsnThrHisLeuLeu TyrSerTrpAlaGly ThrAla lieGlnPro Thrlie SerAlaPheGlyValThrGlyAla ThrAspThrSerThr liePro LeulieAsp ProAla AsnAlaLeuAspLeuSerThrLeu AlaLeuPheGlyThr GlyThr ValMetlie AsnArg AlaSerGlyGlnAsnAspGlyLeu ValSerLysCysSer AlaLeu TyrGlyLys ValLeu SerThrSerTyrLysTrpAsnHis LeuAspGlulieAsn GlnLeu LeuGlyVal ArgGly AlaAsnAlaGluAspProValAla VallieArgThrHis AlaAsn ArgLeuLys LeuAla GlyVal
用SingnalP3. 0軟件分析了脂肪酶蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)，在網(wǎng)站http://WWW. cbs. dtu. dk/services/SignalP/上提交了脂肪酶蛋白質(zhì)序列，預(yù)測參數(shù)選為革蘭氏陰性菌、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)和隱馬科夫模型，預(yù)測結(jié)果表明該蛋白有100%的幾率擁有信號肽，信號肽最可能的切割微點在第40和41個氨基酸間，、這與XU分BurkhoMeria屬菌所產(chǎn)相近分子量大小的脂肪酶吻合。本發(fā)明還提供耐有機溶劑脂肪酶YCJOl在有機相催化手性拆分的應(yīng)用。所述的耐有機溶劑脂肪酶在有機溶劑異丙醚體系中，催化底物扁桃酸和乙酸乙烯酯進行酯交換轉(zhuǎn)化為乙酰氧基扁桃酸，轉(zhuǎn)化率達50%，產(chǎn)物為S型乙酰氧基扁桃酸，^^ 值>99. 9%;拆分后底物為R型扁桃酸，ees值>99. 9%。本發(fā)明的有益效果在于菌株^zr姑Weria ambifaria YCJOl的耐有機溶劑脂肪酶YCJOl產(chǎn)率較高，發(fā)酵60 h脂肪酶活力達到126. 1 U/mL ；耐有機溶劑脂肪酶YCJOl易純化、比活高，經(jīng)過離子交換層析和疏水層析后比活達到4609. 5U/mg ；該脂肪酶溫度穩(wěn)定性良好，在疏水性和親水性有機溶劑中都有較好的耐受性，表明其在雙相和單相有機相催化尤其是手性拆分方面有很好的應(yīng)用前景。


圖1顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1 :Marker ；泳道 2:粗酶液；泳道3:DEAE陰離子交換層析后的酶液；泳道4:純酶液(經(jīng)疏水層析后得到的純酶液)；
圖2顯示用25%有機溶劑處理60天后脂肪酶YCJOl的剩余活力； 圖3顯示40%親水有機溶劑對脂肪酶YCJOl的影響。所用有機溶劑為異丙醇(■)、 丙酮(·)、乙醇(▲)、甲醇(▼ )、DMS0()、DMF()、對照( )； 圖4顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的最適反應(yīng)pH ；
圖5顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的pH穩(wěn)定性(在各pH條件下放置Ih后的剩余酶活)。緩沖液為 0. 05M Citiric acid-citrate sodium (pH 3. 0-6. 1) ( ■ )、0· 05Μ Na2HPO4-NaH2PO4(pH 6. 06-8. 11) ( · )、0· 05Μ Tris-HCl (pH 7. 5-8. 9) ( ▲ )、0· 05Μ Glycine-NaOH (ρΗ 8. 79-10. 6) ( ▼ )、0· 05Μ Na2HP04-Na0H(10. 98—11. 95)()；圖6顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的最適反應(yīng)溫度；
圖7顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的溫度穩(wěn)定性(在各溫度條件下放置Ih后的剩余酶
活)；
圖8顯示耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的底物特異性，其中/7-Nitrophenyl acetate (C2)為對硝基苯酚乙酸酯，/7-Nitrophenyl butyrate (C4)為對硝基苯酚丁酸酯， /7-Nitrophenyl caprate (C8)為對石肖基苯酷辛酸酉旨，p—Nitrophenyl decanoate (ClO) 為對硝基苯酚癸酸酯，/7-Nitrophenyl myristate (C14)為對硝基苯酚豆蔻酸酯， /7-Nitrophenyl palmitate (C16)為對硝基苯酚棕櫚酸酯，/？-Nitrophenyl stearate (C18) 為對硝基苯酚硬脂酸酯(C18)。
具體實施例方式實施例一
本實驗說明產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶天然菌株的篩選程序。初篩采用如下方法以植物油為唯一碳源，不同濃度環(huán)己烷、甲苯、DMSO等有機溶劑為篩選壓力從油污土壤等樣品中篩選獲得耐有機溶劑極端微生物。采用吐溫-80平板培養(yǎng)基，具體配方為酵母膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 10 g/L，吐溫-80 10 mL/L, CaCl2 1 g/L，瓊脂20 g/L。將所篩選到的耐有機溶劑微生物接種于吐溫-80平板，根據(jù)沉淀圈與菌落大小的比值，初步篩選脂肪酶產(chǎn)量高的菌株。此方法篩選到脂肪酶產(chǎn)量高的耐有機溶劑極端微生物5株。為了進一步檢測所分泌脂肪酶的溶劑耐受性，對5株菌的脂肪酶產(chǎn)生能力和所產(chǎn)脂肪酶的耐有機溶劑性質(zhì)進行全面的檢測。將所篩選到的高活力菌株接種到產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基，具體配方為蛋白胨 5 g/L，酵母粉 5 g/L，尿素 5 g/L, K2HP043H20 1.8 g/L, MgS047H20 0.7 g/L，橄欖油 5 mL/L，TritonX-100 0.5 mL/L，pH 8.0。培養(yǎng)溫度為 30°C，培養(yǎng)時間為 60 h，搖床轉(zhuǎn)速為180 rmp。發(fā)酵結(jié)束后，10000 rmp 4°C離心15 min，取上清為粗酶液。取粗酶液1.5 mL分別加入0. 5mL的異丙醚、十六烷、壬烷、正辛烷、異辛烷、正庚烷、正己烷、異丙醇、丙酮、乙醇、甲醇、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMS0)，于30°C、150 rpm震蕩處理M h，以/7NPP為底物檢測脂肪酶剩余酶活；選取具有最高剩余活力的菌株作為耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌株。脂肪酶活力檢測方法(以對硝基苯酚棕櫚酸酯為底物)為A溶液50mM的 Na2HPO412H20-NaH2P042H20 緩沖液(pH 7. 5)，其中含有 0. 6%(m/v)Triton X-100 和 0. l%(m/ ν)的阿拉伯樹膠；B溶液稱取3 mg的對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-Nitrophenylpalmitate， pNPP)，溶解在1 mL的異丙醇中；A溶液與B溶液按體積比9:1制成濃度為16. 5 mM的對硝基苯酚棕櫚酸酯底物溶液。反應(yīng)體系中先加入10 PL稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液，以滅活的酶液為空白對照，再加入MO PL底物溶液，在酶標(biāo)儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)溫度為40°C，反應(yīng)時間為 10 min，在410 nm波長下檢測反應(yīng)結(jié)束時生成的對硝基苯酚(pNP)的量。每1個單位(U) 脂肪酶酶活定義為，在相應(yīng)條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 Mfflol對硝基苯酚(pNP)所需的酶量。 通過酶活性檢測以及有機溶劑穩(wěn)定性檢測，其中一株具有優(yōu)良耐受性的脂肪酶產(chǎn)生菌株所產(chǎn)脂肪酶活力達到40. 2U/mL，該菌株編號YCJOl。實施例二
6本實驗說明耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌YCJOi的生物學(xué)性質(zhì)、鑒定及其產(chǎn)酶條件研究。菌株YCJOl的生物學(xué)性質(zhì)該菌株為革蘭氏陰性菌株，菌落呈米白色，圓形，邊緣整齊，光滑濕潤；菌體為桿菌，0. 8 1. OX 1. 6 3. 2mm,專性好氧，生長的最適溫度為 30°C 35°C。其生理生化特性表現(xiàn)在不出現(xiàn)反硝化反應(yīng)、明膠反應(yīng)結(jié)果為陽性，氧化酶陽性，可分解脂肪，可利用D-核糖、D-阿拉伯糖、海藻糖等，不可利用麥芽糖。菌株YCJOl的菌種鑒定經(jīng)BIOLOG自動細(xì)菌鑒定儀鑒定，Sim值為0. 576 (24h培養(yǎng))，鑒定結(jié)果顯示該菌屬于ifcr姑Weria屬；后經(jīng)16S rDNA序列分析，表明該菌株與數(shù)據(jù)輝中 Burkholderia ambifaria MC40-6 菌的同源性為 99%。綜合 BIOLOG 和 16S rDNA 分析
1 ^ Burkholderia ambifaria, ^^ % Burkholderia ambifaria YCJOl0Burkholderia ambifaria YCJOl產(chǎn)酶條件研究采用單因素替換法研究發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、淀粉、糊精)、氮源(蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、尿素、 大豆粉)、誘導(dǎo)劑(花生油、橄欖油、大豆油、玉米油、菜籽油、葵花籽油)、表面活性劑(Tween 80、SDS,Triton X-100、阿拉伯樹膠)、初始pH，接種量，發(fā)酵溫度，裝液量等對^zr姑Weria ambifaria YCJOl產(chǎn)脂肪酶的影響，得出優(yōu)化后的培養(yǎng)基組分為糊精8 g/L，酵母粉 5. 05g/L，牛肉膏 7. 71g/L，尿素 5g/L, MgSO4 · 7H20 0. 7g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 8 g/L，菜籽油 5 mL/L，TritonX-100 0. 75mL/L，發(fā)酵初始pH 8. 0 ；優(yōu)化后的培養(yǎng)條件為接種量5% (V/V), 發(fā)酵溫度30 °C，搖床轉(zhuǎn)速180 rpm，裝液量40 mL/250 mL。在此優(yōu)化條件下，發(fā)酵60 h后， 酶活力達到126. 1 U/mL，與初始培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件下酶活40. 2U/mL相比，提高了 2. 1倍。實施例三
本實驗說明耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的純化程序。Burkholderia cepacia YCJOl在產(chǎn)酶培養(yǎng)基中培養(yǎng)60h后，發(fā)酵液在10，OOOrmp在4 °C離心15 min，取上清為粗酶液；將以上處理得到的酶液，采用 DEAE-Sepharose FF 離子交換層析柱進行純化，以 0. 05 M 的 Tris-HCl CpH 7. 25，NaCl 1 mol/L)緩沖液階段洗脫，收集脂肪酶活力峰，用0.05 M Tris-HCKpH 7. 25，(NH4) 2S04含量為1 mol/L)透析，再采用Phenyl-S印harose FF疏水層析進行純化，以含20%乙醇的0. 05 M Tris-HCl (pH 7. 25)和含40%乙醇的0. 05M Tris-HCl (pH 7. 25)溶液進行洗脫，收集脂肪酶活力峰。通過SDS-PAGE電泳圖，發(fā)現(xiàn)兩步純化后的耐有機溶劑脂肪酶(命名為耐有機溶劑YCJ01脂肪酶)已達電泳純(圖1)，該脂肪酶表觀分子量約為33 kDa。純化倍數(shù)為12. 5 倍，回收率為24. 2%，純化后脂肪酶比活達到4609. 5U/mg，匯總見表1。表1耐有機溶劑脂肪酶YCJ01的純化步驟及結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌，其特征在于該菌為伯克霍爾德氏菌，命名為 Burkholderia ambifaria YCJO1，保藏日期為2011年3月6日，保藏單位全稱為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，簡稱CCTCC，保藏地址為中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏登記號為CCTCC NO M 2011058。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌產(chǎn)生的脂肪酶，其特征在于所產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶YCJOl的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO: 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐有機溶劑生產(chǎn)菌產(chǎn)生的脂肪酶，其特征在于所產(chǎn)耐有機溶劑脂肪酶YCJOl氨基酸序列為SEQ ID NO: 2，其由SEQ ID NO: 1中所述的核苷酸序列編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的耐有機溶劑脂肪酶生產(chǎn)菌產(chǎn)生的耐有機溶劑脂肪酶YCJOl在手性化合物拆分中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐有機溶劑脂肪酶生產(chǎn)菌產(chǎn)生的耐有機溶劑脂肪酶YCJOl在手性化合物拆分中的應(yīng)用，其特征在于所述耐有機溶劑脂肪酶在有機溶劑體系中，可完成藥物中間體扁桃酸的手性拆分。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物工程與酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及了一種高穩(wěn)定性耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)生菌Burkholderiaambifaria YCJ01，其耐有機溶劑脂肪酶的基因，以及該耐有機溶劑脂肪酶在有機相中催化拆分手性化合物的應(yīng)用。該菌株為革蘭氏陰性菌株，其保藏登記號為CCTCCNOM2011058，其耐有機溶劑脂肪酶產(chǎn)量高，具有較寬的pH適應(yīng)范圍，溫度穩(wěn)定性好，對多種有機溶劑有較好的耐受性，其在手性化合物拆分中具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號C12N15/55GK102329745SQ20111021140
公開日2012年1月25日 申請日期2011年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月27日
發(fā)明者何冰芳, 吳斌, 姚長進, 曹艷, 李霜, 柏中中 申請人:南京工業(yè)大學(xué)