專利名稱：貪噬菌cgmcc4969及其在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物技術領域，具體涉及貪噬菌K力CGMCC 4969及其產(chǎn)生的腈水合酶基因簇應用于3-氰基吡啶生物轉化為煙酰胺。
背景技術：
腈水合酶(nitrile hydratase，EC. 4. 2. 1. 84)(簡寫為NHase)催化腈化物水合生成相應的酰胺類化合物。來源于微生物的腈水合酶具有反應條件溫和、產(chǎn)率高、副產(chǎn)物少、 區(qū)域和立體選擇性強等優(yōu)點，已成功應用于醫(yī)藥、農(nóng)藥及其中間體、食品與飼料添加劑等精細化學品的生產(chǎn)，并顯示出巨大發(fā)展?jié)摿?。目前報道的產(chǎn)生腈水合酶的微生物有根癌土壤桿菌Agrobacteriim tumefaciens d3、i |f |if Arthrobac ters\>. J-I > ifa ^ ^ f/K If lif Bacillus cereus、 芽孢桿菌feci/^As sp. BR 449、史氏芽孢桿菌feci/^As smithii SC-J05-1、短桿菌 Brevibacterium imperialis CBS 489-74、諾卡氏菌^^<3了必<38 . 108、綠針假單胞菌 Pseudomonas chlororaphisPseudomonas putida> Bf j[x 1 1 lif Pseudonocardia thermophila JCM ？Rhodococcus rhodochrous Jl、
Rhodococcus rhodochrous R312 >Rhodococcus rhodochrous
LL 100-21、紅平紅球菌 Rhodococcus erythropolis BL1、玫瑰紅紅球菌 Rhodococcus rhodochrous A4、紅球菌 Rhodococcuss^. AJ270、紅球菌 Rhodococcuss^. SHZ-I、紅球菌TSoi/ococciAssp. ZJUT-N595、紅球菌 TSoi/ococciAssp. N 774、高里假絲酵母 gui lliermondii CCT 7207、著明假絲酵母fama ta, H Kt it Sl # Cryp to coccus
flavus UFMG-Y61 (鄭裕國等，腈轉化酶在精細化學品生產(chǎn)中的應用，生物工程學報，2009，25 (12) 1795-1807)。對貪噬菌屬Karioraraz產(chǎn)生的腈水合酶而言，目前在Genbank數(shù)據(jù)庫中有Lourenco等提交的224bp來源于Karioraraz sp. DSM 11402的部分腈水合酶基因片段(genbank 登錄號AJ577856)；來源于 K paradoxus EPS (Genbank 登錄號NC_014931) 和K paradoxus Sl 10 (Genbank登錄號NC_012791)兩個菌株的全基因組序列中的腈水合酶基因，然而上述腈水合酶基因均為生物信息學預測結果，未有實驗證明其腈水合酶功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能產(chǎn)生腈水合酶的菌株及其在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用；以及從該菌株中克隆腈水合酶基因簇并在五coli BL21 (DE3)中誘導表達；重組表達菌株在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用。本發(fā)明的基本原理如圖 1所示。申請人:篩選到一株命名為Jl的菌株，該菌株可生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺。 從該菌株中克隆出完整的腈水合酶α和β亞基基因簇，其堿基由序列表中SEQ ID No 1 組成。將由SEQ ID No 1組成的DNA重組于pET28a質(zhì)粒上，重組質(zhì)粒pET28a_NHase電轉化至五coli BL21 (DE3)菌株中，經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導表達，含表達腈水合酶的五coli BL21 (DE3)菌株可轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺，而不含腈水合酶基因的對照菌株不能轉化3-氰基吡啶為煙酰胺。本發(fā)明所提供的菌株Jl為一種貪噬菌K boronicumulans,該菌株現(xiàn)保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏編號CGMCC 4969。本發(fā)明提供了 K力oro/ ic腫Waas CGMCC 4969菌株在生物轉化3-氰基吡啶生成產(chǎn)物煙酰胺中的應用(如圖2所示)。H boronicumulans CGMCC 4969菌株中克隆出的腈水合酶基因簇，其序列如SEQ ID No:l所示。該基因簇由1304個堿基組成，其中1-642位堿基編碼腈水合酶α亞基基因，638-1304位堿基編碼β亞基基因。上述所說的應用是將由SEQ ID No 1組成的DNA序列插入pET28a質(zhì)粒上，得到重組質(zhì)粒pED8a -NHase，pET28a-NHase質(zhì)粒電轉化至大腸桿菌五coli BL21 (DE3)菌株中， 經(jīng)IPTG誘導，宿主菌表達腈水合酶(圖3)，然后利用含表達蛋白的五coli BL21 (DE3)細胞或細胞提取液生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺。本發(fā)明實驗表明重組K boronicumulans CGMCC 4969的腈水合酶基因簇的大腸桿菌細胞可將3-氰基吡啶生物轉化為煙酰胺(如圖4所示);而不含重組腈水合酶的pET28a 的五coli BL21 (DE3)不轉化3-氰基吡啶(如圖5所示)。


圖1 微生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺。圖 2 boronicumulans CGMCC 4969 生物轉化 3-氰基吡啶的 HPLC 圖。圖3:五coli BL21 (DE3) (pET28a_NHase)的SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳圖。圖coli BL21 (DE3) (pEI^8a_NHase)轉化氰基吡啶生成煙酰胺的HPLC圖。圖 5 五 coli BL21 (DE3) (pED8a)轉化氰基吡啶的 HPLC 圖。
具體實施例方式實例一可生物轉化3-氰基吡啶為煙酰胺的菌株分離篩選、鑒定和生物學特性 1、菌株分離
從江蘇省南京市仙林地區(qū)采集土壤，取Ig 土壤加入含5顆玻璃珠的19mL無菌水中， 振蕩5min，靜置IOmin后，取Iml懸液加入19ml含1%3_氰基吡啶的礦物鹽培養(yǎng)基中。礦物鹽培養(yǎng)基的組成為1. 36 g/L KH2PO4, 2. 13g/L Na2HPO4,0. 5 g/L MgSO4 ·7Η20 和 10ml/L 金屬離子液，pH 7. 5。金屬離子液組成為0. 40 g/L CaCl2 · 2H20, 0. 30 g/L H3BO3, 0. 04 g/L CuSO4 · 5H20, 0. 10 g/L KI, 0. 20 g/L FeSO4 · 7H20，0. 40 g/L MnSO4 · 7H20，0. 20 g/ L NaMoO4 ·2Η20和10. O mL/L濃鹽酸。樣品于30°C、轉速為220rpm的搖床中培養(yǎng)3天。取 ΙΟΟμΙ樣品稀釋到10_3-10_5后，涂布LB培養(yǎng)基的平板。LB培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L ；酵母膏5g/L ；NaCl 10g/L ；pH7. 2。從LB平板挑取形態(tài)不同的單菌落劃線至LB平板上，30°C 培養(yǎng)1-2天后，再次進行菌種平板劃線純化?？偣搏@得15株形態(tài)不同的細菌。、菌株轉化3-氰基吡啶為煙酰胺能力的測定
接種上述純化菌種至LB液體培養(yǎng)基中，300C培養(yǎng)M h后離心收集細胞。細胞懸浮于含2. 5%3-氰基吡啶的0. 2 mol/L的磷酸鹽緩沖液中(pH 7. 5)，采用HPLC分析檢測3-氰基吡啶的降解和煙酰胺的生成，同時以購于Sigma公司的3-氰基吡啶和煙酰胺標準品為對照。 其中命名為Jl的菌株具有較高的將3-氰基吡啶轉化為煙酰胺的能力。轉化4 后，剩余底物3-氰基吡啶的濃度為1. lg/L ；產(chǎn)生煙酰胺的濃度為0. 94 g/L。其他菌株沒有3-氰基吡啶生物轉化能力。、Jl菌株的鑒定及生物學特性
在LB固體培養(yǎng)基上，J1菌落呈米黃色、半透明、光滑、有粘液、凸起、邊緣規(guī)整。革蘭氏陰性。顯微鏡觀察，Jl菌體呈橢圓狀，大小為0.5-0. 7X1. 3-1. 5 μ m。無鞭毛，無芽孢。氧化酶和過氧化氫酶陽性。能利用蔗糖、葡萄糖、麥芽糖，不能利用硝酸鹽。采用16S rDNA序列分析進行Jl菌株的分子鑒定。從含LB固體培養(yǎng)基上用無菌牙簽挑取jl單菌落接種于裝有20mLLB液體培養(yǎng)基的IOOmL三角瓶中，于30°C、20rpm的搖床中培養(yǎng)16h。發(fā)酵液于13000rpm離心5min后收集菌體，采用TaKaRa公司的MiniBEST 細菌基因組提取試劑盒提取Jl菌株的基因組DNA。采用16S核糖體DNA (rDNA)擴增通用引物Kl和K2擴增jl菌株的16S rDNA基因。Kl引物序列為5' -AACTGAAGAGTTTGATCC-3' (SEQ ID No :2)，K2 引物序列為5' -TAGGTTACCTTGTTGTTACGACTT- 3' (SEQ ID No: 3)。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。PCR擴增條件為94°C預變性5 min后， 94°C變性1 min，59°C退火1 min，72°C延伸1 min，共30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。所得序列由生工生物工程(上海)有限公司測序后，得到的部分16S rDNA序列(SEQ ID No :4)在美國國家生物技術信息中心的Genbank數(shù)據(jù)庫中進行blast搜索。比對結果表明Jl菌與貪噬屬K boronicumulans親緣關系最近，相似性達到99%。因而Jl菌株被鑒定為K boronicumulans. Jl菌株于2011年6月21日保藏于中國菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院研究所；菌株和分類命名為貪噬菌 Variovoraxboronicumulans，保藏編號為 CGMCC No. 4969。實例二 K力腫Waz7lS CGMCC 4969腈水合酶基因克隆
V. boronicumulans CGMCC 4969的基因組DNA的提取與實例一基因組DNA提取方法相同。所涉及到的四種核苷酸分別為三磷酸脫氧腺嘌呤核苷酸(簡寫為A)、三磷酸脫氧胸腺嘧啶核苷酸(記為T)、三磷酸脫氧鳥嘌呤(簡寫為G)、三磷酸脫氧胞嘧啶核苷酸(簡寫為C)。設計并合成腈水合酶基因的上游與下游引物。引物中R表示該位置的堿基為A或 G，引物中S表示該位置的堿基為C或G，引物中Y表示該位置的堿基為C或T，引物中K表示該位置的堿基為G或T。首先采用簡并引物克隆K力CGMCC 4969腈水合酶α亞基基因片段。合成的引物 NHCo-f 序列為5，- GTSGTGGCSARGGCCTGG -3，( SEQ ID No:5)，引物 NHCo-r序列為:5，_ GRKYGC CGATCATCGAGTC -3，(SEQ ID No :6)，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。合成引物用無菌水溶解至濃度為20Mfflol/L，備用。PCR擴增所用DNA聚合酶及相應擴增緩沖液、四種脫氧核苷酸溶液均由寶生物工程(大連)有限公司購得。在一已滅菌的0. 2mLPCR管中，依次加入10μ 無菌水、2μ 擴增緩沖液、2μ MgCl2溶液，2μ χ!ΝΤΡ、各 0. 4μ 上游和下游引物、2PL步驟1制備的基因組DNA溶液、1 μ 二甲基亞砜(DMSO),0. 2μ 的Ex-taq DNA聚合酶，總體積為20μ ；將PCR管置于PCR儀中，條件設置為升溫至95°C，保持5min，接著按升溫至95°C并保持30s、降溫至63°C并保持40s、升溫至72°C并保持50s 的變化順序循環(huán)30次，最后于72°C保持lOmin，結束擴增反應。PCR擴增產(chǎn)物采用pMD18_T 載體試劑盒(TaKaRa公司)進行TA克隆后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。PCR擴增出長度為42Ibp的DNA序列。該序列位于SEQ ID No :1序列中的184位堿基至604位堿基。采用簡并引物進一步克隆K boronicumulans CGMCC 4969基因組DNA上位于α亞基基因上游至β亞基基因下游保守序列之間的DNA片段，設計引物NHCo-f: 5‘-GTCGTGGCGAGGGCCTGG-3‘ (SEQ ID No :7)和引物NHCo-β-r :5，-CTTGCCSYGCACRTAGCC_3， (SEQ ID No :8)0從基因組DNA上PCR克隆目的DNA片段的步驟同上述方法，PCR反應體系(2(^l):10XEx-taq緩沖液2μ1, ΝΤΡ混合液2μ1，MgCl2溶液2μ1，引物各0. 4μ1，基因組 DNA 2μ1，Ex-taq聚合酶0. 2μ1，DMSO μ ，加水至總體積20μ1。PCR反應條件95°C預變性 5min ；95°C變性 30s ；65°C退火 40s ；72°C延伸 Imin ；共 30 個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR 產(chǎn)物采用pMDIS-T載體試劑盒(TaKaRa公司)進行TA克隆后，送生工生物工程(上海)有限公司測序。共測得927bp的DNA片段。該序列位于SEQ ID No 1序列中的184位堿基至1112 位堿基。采用反向PCR法克隆α亞基基因的上游序列。選擇I^stI內(nèi)切酶酶切基因組DNA， 37°C孵育Mh，用TaKaRa公司的T4連接酶對酶切產(chǎn)物進行連接環(huán)化，16°C孵育Mh，以上述測得的 927bp 的 DNA 片段為模板，設計引物 NHCO- α U-f 5' - CGGTGTAGCCCAGCGAGGCGAT -3' ( SEQ ID No :9)和引物 NHCO-α U-r :5' - GACCTACACGAC GCATGCCGACCT -3' ( SEQ ID No: 10)。反向 PCR 體系(20μ1) :10 X Ex-taq Buffer 2μ1, dNTP Mix 2μ1，MgCl2 溶液 2μ1，引物各0. 4μ1，模板(基因組經(jīng)PstI酶切和環(huán)化后的產(chǎn)物)2μ1, Εχ-taq聚合酶0. 2μ1， DMSO μ ，加水至總體積20μ1。PCR反應條件95°C預變性5min ；95°C變性1. 5min ；65°C退火anin;72°C延伸^iin;共30個循環(huán)；72°C IOmin0 PCR產(chǎn)物進行TA克隆、測序。獲得 1009 bp的DNA片段，其中包含了位于序列表SEQ ID No 1序列中的1位堿基至271位堿基?？寺ˇ聛喕蛳掠涡蛄小ＴO計引物NHC0-i3D-f: 5，-CCGAGAACGTGCCCGCTGTGCT-3，( SEQ ID No 11)禾口弓丨物 NHCO-βD_r 5，-CCGAGAACATCGACACCAAGGCCT-3，( SEQ ID No 12), PCR 反應體系(20μ1) :10XEx_taq 緩沖液2μ1，dNTP混合液2μ1，MgCl2 2μ1，引物各0. 4μ1，基因組模板2μ1，Εχ-taq酶0. 2μ1， DMSO μ ，加水至總體積20μ1。PCR反應條件95°C預變性5min ；95°C變性1. 5min ；65°C退火anin;72°C延伸^iin;共30個循環(huán)；72°C IOmin0 TA克隆測序，得到989 bp的堿基序列。其中包含了位于序列表SEQ ID No 1序列中的903位堿基至1304位堿基。將上述PCR獲得的1009，927和989 bp的三段DNA序列進行拼接得到包括腈水合酶基因完整序列在內(nèi)的序列26 bp的DNA片段。將上述DNA片段序列進行開放閱讀框(ORF)分析以及和K paradoxus SllO的腈水合酶基因進行比對。K boronicumulans CGMCC 4969腈水合酶α和β亞基編碼基因組成的基因簇由序列表中的SEQ ID No :1組成。SEQ ID No :1序列由1304個堿基組成，其中位于1-642堿基編碼腈水合酶α亞基基因，位于638-1304堿基編碼腈水合酶β亞基基因。翻譯后的α亞基基因編碼213個氨基酸，β亞基基因編碼221個氨基酸。
實例三腈水合酶基因的表達及含重組腈水合酶基因簇的五C^i用于3-氰基吡啶的生物轉化
1、腈水合酶基因DNA片段連接至質(zhì)粒pET28a
設計含EcoRI酶切位點的引物NHCo-E-f和含BioI酶切位點的引物NHCo-E-r，引物NHCo-E-f的序列由觀個核苷酸殘基組成，依次為5 ‘-GGGGAATTCATGACCGGCCATGACCACT-3 ‘ (SEQ ID No 13);引物 NHCo-E-r 的序列由 27 個核苷酸殘基組成，依次為5' -GGGCTCGAGTGCCGCG GGCTCCAGGTA-3‘ (SEQ ID No :14)。在一已滅菌的0. 2mLPCR薄壁管中，依次加入10. 8μ 無菌水、2μ 的擴增緩沖液、2μ 的四種脫氧核苷酸、0. 5μ 的引物一、0. 5μ 的引物二、3μ 的步驟1制備的基因組DNA溶液、WL的DMSO、 0. 2μ 的Angel DNA聚合酶，總體積為20μ ；將PCR管置于PCR儀中，條件設置為升溫至 95°C，保持5min，接著按升溫至95°C并保持1 min、降溫至55°C并保持1. 5min、升溫至72°C 并保持;3min的變化順序循環(huán)35次，最后于72°C保持lOmin，結束擴增反應。質(zhì)粒pEI^Sa、限制性核酸內(nèi)切酶和相應緩沖液由寶生物工程(大連)有限公司購得。取MML上述PCR產(chǎn)物和40μ pET28a質(zhì)粒DNA分別進行酶切，酶切反應的體系組成分別為
權利要求
1.一種產(chǎn)生腈水合酶的菌株J1，其特征在于是貪噬菌V. boi^idcmmlmis CGMCC 4969。
2.—種權利要求1所述菌株Jl的腈水合酶基因簇，其特征在于具有SEQ ID No:l所示的DNA堿基序列；該基因簇由α亞基和β亞基的兩個編碼基因組成，其中1-642位堿基編碼α亞基基因，638-1304位堿基編碼β亞基基因。
3.權利要求1所述的菌株Jl在生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺中的應用。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于，是將SEQID No :1所示序列的DNA片段重組于pET28a質(zhì)粒上，并在大腸桿菌五coli BL21 (DE!3)中誘導表達；然后利用重組五 coli BL21 (DE!3)細胞或細胞提取液生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺。
全文摘要
本發(fā)明公開了貪噬菌(Variovoraxboronicumulans)CGMCC4969生物轉化3-氰基吡啶生成煙酰胺；該菌株產(chǎn)生的腈水合酶基因簇由具有序列表中SEQIDNo1所示的DNA序列組成；由SEQIDNo1序列組成的DNA重組于pET28a質(zhì)粒上，并在大腸桿菌EscherichiacoliBL21(DE3)菌株中誘導表達，含表達蛋白的大腸桿菌細胞和細胞提取液可將3-氰基吡啶生物轉化為煙酰胺。
文檔編號C12N15/60GK102286406SQ20111021598
公開日2011年12月21日 申請日期2011年7月30日 優(yōu)先權日2011年7月30日
發(fā)明者周倩雯, 張會娟, 戴亦軍, 曹玉敏, 袁生 申請人:南京師范大學