專利名稱：A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備和使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備及使用方法，屬生物芯片領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感病毒(influenza virus)根據(jù)病毒分類學(xué)屬正粘病毒科 (Orthomyxoviridae)。它的基因組是分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA。根據(jù)病毒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原特性及其基因特性不同，把流感分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中A型流感病毒根據(jù)其表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)蛋白結(jié)構(gòu)及其基因特征可以分為多個亞型，至今A型流感病毒已發(fā)現(xiàn)的血凝素有16個亞型(H1-16)，神經(jīng)氨酸酶有9個亞型 (N1-9)。由于流感病毒基因組RNA是分節(jié)段的，因此易產(chǎn)生同型不同株間基因重配。尤其是人A型流感病毒HA基因經(jīng)常發(fā)生點(diǎn)突變，導(dǎo)致其編碼的HA蛋白分子上的氨基酸序列發(fā)生替換，造成其抗原性經(jīng)常不斷的發(fā)生漂移，而每次抗原性漂移常常帶來不同程度的流感流行。流行性感冒(influenza)(簡稱流感)是第一個實(shí)行全球性監(jiān)測的病毒性急性呼吸道傳染病，近100年來，已經(jīng)出現(xiàn)了數(shù)次不同亞型的流感病毒全球大流行。1918年西班牙流感(HlNl)，造成5000-6000萬人死亡；1957年亞洲流感(H2N2)，至少200萬人死亡；1968 年香港流感(H3N2)，死亡人數(shù)超過100萬；1997年香港禽流感(H5W)，死亡人數(shù)雖不比前幾次流感，但死亡率高達(dá)32%。2009年3月，在墨西哥爆發(fā)甲型Hmi流感，并迅速在全球范圍流行，截至2010年5月2日，至少造成18001人死亡。隨著全球人口流動型的不斷增力口，流感病毒交替、混合流行將成為常態(tài)。在流感患者的臨床治療過程中和流感的疫情防控中，流感病毒產(chǎn)生耐藥性是治療和防控失敗的最主要原因。目前有兩類正式上市的藥物可以用于治療流感病毒感染，一類是神經(jīng)氨酸酶抑制劑，包括磷酸奧司他韋(oseltamivir/Tamiflu /達(dá)菲)和扎那米韋 (zanamivir/Relenza /樂感清)；另一類是M2通道阻滯，包括金剛烷胺(amantadine)和金剛乙胺(rimantadine)。由于流感病毒為節(jié)段型RNA病毒，突變發(fā)生率很高；隨著抗病毒治療的展開，藥物選擇壓力等因素導(dǎo)致病毒耐藥性不可避免地出現(xiàn)。據(jù)調(diào)查顯示，目前北美地區(qū)98%的季節(jié)性H3N2流感病毒對金剛烷胺耐藥，98%的季節(jié)性Hmi流感病毒對達(dá)菲耐藥；禽流感H5W病毒對達(dá)菲的耐藥也屢有報(bào)道。2009年6月丹麥報(bào)告了全球第一例甲型 HlNl流感病毒達(dá)菲耐藥病例后，截至2010年2月3日，全球已有20個國家報(bào)告了達(dá)菲耐藥的甲型Hmi流感病例至少225例。流感病毒耐藥的有效檢測技術(shù)對于指導(dǎo)流感預(yù)防和臨床治療具有重要意義，同時(shí)也是流感病毒流行性監(jiān)測和控制的重要技術(shù)支撐。目前流感病毒臨床診斷主要依靠的方法有病原分離和鑒定、血清學(xué)方法檢測感染者抗體、神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)、RT-PCR診斷技術(shù)、基因測序技術(shù)。上述技術(shù)由于受到其自身特點(diǎn)限制，有的不能實(shí)現(xiàn)流感病毒耐藥性檢測，有的不能達(dá)到快速、高通量的臨床檢測和疾病防控的需求。基因芯片，即DNA微陣列(DNA microarray)，自20世紀(jì)80年代末興起以來，廣泛用于醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)的各個領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的檢測方法相比，具有快速、高靈敏度、高特異、高通量的特點(diǎn)，特別適合于對大量樣品進(jìn)行平行快速高通量的分析。目前已有多種病原微生物的檢測使用了基因芯片技術(shù)。目前已有使用基因芯片技術(shù)檢測流感病毒耐藥位點(diǎn)突變情況的報(bào)道，如Michael B等采用基因芯片技術(shù)檢測季節(jié)性H3N2和季節(jié)性Hmi流感病毒金剛烷胺耐藥，可以檢測病毒M2基因上V27A和S31N位點(diǎn)突變。但是，在一次檢測中既可以同時(shí)區(qū)分患者感染的流感病毒為季節(jié)性Hmi、甲型Hmi、季節(jié)性H3N2三種亞型的中哪一種或多種，又同時(shí)可以檢測所感染的流感病毒是否對奧司他韋和金剛胺類藥物耐藥的基因芯片未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種A流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片，該芯片能同時(shí)分析人源季節(jié)性Hmi、甲型Hmi、季節(jié)性H3N2三種亞型流感病毒是否對奧司他韋和金剛胺類藥物耐藥。本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案一種A流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片，包含對季節(jié)性H1N1、甲型H1N1、季節(jié)性H3N2進(jìn)行奧司他韋和金剛胺類耐藥檢測的四條特異性寡核苷酸探針(表1-表幻、一條質(zhì)控探針(表4)和載體，全部探針均分布在載體上。此外還包括用于奧司他韋耐藥相關(guān)NA基因和金剛胺類耐藥相關(guān)M基因耐藥突變位點(diǎn)序列擴(kuò)增的特異性引物9條(表5-表6)。表1對季節(jié)性Hmi進(jìn)行耐藥檢測的特異性寡核苷酸探針序列
權(quán)利要求
1. 一種A型流感病毒流行毒株耐藥檢測的基因芯片，其特征是它包括對季節(jié)型H1N1、 甲型H1N1、季節(jié)型H3N2三種1流感亞型進(jìn)行奧司他韋及金剛胺類耐藥檢測的四條特異性寡核苷酸探針、1條質(zhì)控探針和載體，全部探針均分布于載體上；用于NA基因和M基因耐藥突變位點(diǎn)序列擴(kuò)增的通用引物9條。對季節(jié)型Hmi進(jìn)行耐藥檢測的特異性寡核苷酸探針序列
2.根據(jù)權(quán)利1所述A型流感流行毒株耐藥檢測基因芯片，其特征是所述的載體為醛基化修飾的玻璃片、硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
3.一種A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備方法，包括以下步驟步驟一,探針的設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI網(wǎng)站中Genbank中的hf luenza Virus Resource數(shù)據(jù)庫，對大量的季節(jié)性Hmi、甲型Hmi、季節(jié)性H3N2流感亞型序列進(jìn)行比對，確定檢測的耐藥位點(diǎn)，然后設(shè)計(jì)四條特異性寡核苷酸探針以及1條片基質(zhì)控探針；步驟二，探針的合成，每條探針的3’端加入12個T且末端T進(jìn)行氨基修飾，以使其能固定在醛基化修飾玻璃基片上；質(zhì)控探針除3’端加入12個T且末端T進(jìn)行氨基修飾外，5’ 端同時(shí)標(biāo)記CY3 ；步驟三，芯片的制備將合成后的探針用去離子水稀釋成100 μ Μ,分別取10 μ L，和 IOuL體積芯片點(diǎn)樣液混勻，使探針點(diǎn)樣終濃度為50 μ Μ,裝于384孔板，將芯片表面貼上10 樣品孔膜，用Pixsys 5500芯片制備儀(Catesian Technologies)將探針點(diǎn)于載體上，點(diǎn)樣過程中保持一定濕度，點(diǎn)樣完成后將芯片置于干燥器中避光常溫靜置48h，使探針和芯片表面醛基脫去1分子水后共價(jià)結(jié)合，點(diǎn)制好的芯片常溫干燥保存。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備方法，其特征是步驟一中四條特異性寡核苷酸探針以及1條片基質(zhì)控探針，探針長度在17-21nt，每條探針之間的Tm值相差在5 °C之內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備方法，其特征是步驟二種所述的載體為醛基化玻璃片基或硅片、聚苯乙烯基片、尼龍基片。
6.一種A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的使用方法，其特征是包括以下步驟步驟一，流感病毒RNA的提取，使用市售商品化病毒基因組RNA提取試劑盒提取病毒RNA ；步驟二，RT-PCR 使用市售的一步法RT-PCR試劑，使用權(quán)利要求1中所述的特異性引物進(jìn)行NA基因、M基因含耐藥突變位點(diǎn)片段擴(kuò)增。步驟三，雜交將基因芯片分別置0. 2% SDS和雙蒸水中各清洗30S，離心或氮?dú)獯蹈蓚溆茫粚⒉襟E二得到的RT-PCR產(chǎn)物在95°C變性5min后立即置于冰浴中5min，分別取同一模板NA基因、M基因擴(kuò)增產(chǎn)物各2. 5 μ L與5 μ L雜交液混勻，加于芯片加樣孔使其均勻覆蓋于陣列表面，將基因芯片放入雜交盒內(nèi)，45°C雜交lh。步驟四，雜交后清洗基因芯片基因芯片雜交完成后，將芯片依次在洗液l*SSC+0.2% SDS,0. 2*SSC和0. 1*SSC中各清洗30S，最后將基因芯片表明液體離心或氮?dú)獯蹈?。步驟五，掃描將步驟五中清洗后的基因芯片通過熒光掃描儀進(jìn)行掃描，同時(shí)保存掃描圖像數(shù)據(jù)；步驟六，數(shù)據(jù)分析根據(jù)掃描圖像，根據(jù)相應(yīng)野生型探針與耐藥型探針信號的比值大小來確定所檢測樣本中流感病毒的亞型及耐藥情況。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的使用方法，其特征是步驟二中使用的NA基因、M基因擴(kuò)增的反相引物5 ’端進(jìn)行修飾。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的反向引物5’端修飾分子可以是CY3、CY5、生物素、納米金。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的使用方法，其特征是步驟三中使用的雜交液組分為8*SSC，0. 6% SDS, 10%甲酰胺，10*Denhardt。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種A型流感病毒流行毒株耐藥檢測基因芯片的制備和使用方法。本發(fā)明基因芯片包括對季節(jié)性H1N1、甲型H1N1、季節(jié)性H3N2三種流感亞型進(jìn)行奧司他韋和金剛胺類耐藥檢測的29條特異性寡核苷酸探針及1條質(zhì)控探針、9條RT-PCR擴(kuò)增用特異性引物和載體，全部探針分布在載體上。本發(fā)明還包括了基因芯片的制備方法，包括1.引物探針的設(shè)計(jì)；2.探針的合成；3.芯片的制備。本發(fā)明還包括了基因芯片的使用方法，包括1.流感病毒基因組RNA的提取；2.兩組RT-PCR擴(kuò)增；3.芯片雜交；4.雜交后清洗；5.芯片掃描；6.數(shù)據(jù)分析。本發(fā)明具有快速、準(zhǔn)確、高通量、高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)。
文檔編號C12Q1/68GK102251060SQ201110220760
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月3日
發(fā)明者劉琪琦, 張英杰, 王升啟, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所