專利名稱：一種脂肪酶的高效生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種脂肪酶的生產(chǎn)方法，是一種高密度發(fā)酵與高效分離耦合的清潔生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
在脂肪酶下游提取分離上，實(shí)驗(yàn)室規(guī)模提取常用絮凝——離心處理，然后膜超濾進(jìn)一步除菌，這種方法的酶活回收率較低，而且只適合小規(guī)模處理，不易于工業(yè)放大。工業(yè)大規(guī)模的脂肪酶提取常用板框壓濾除菌(圖1)，因?yàn)榘l(fā)酵液菌體濃度高，粘度較大，而且發(fā)酵液板框處理時(shí)間較長(zhǎng)，且發(fā)酵液放罐后放置過程中，衰亡菌體數(shù)量不斷增加、粘度不斷增大，除菌難度很大，甚至無法進(jìn)行。由于板框壓濾過程中濾餅的可壓縮性，使過濾阻力增大， 液體透過性差，工業(yè)上應(yīng)用助濾劑來解決這個(gè)問題，菌體難以分離回收利用。板框設(shè)備系統(tǒng)昂貴，占用空間大，能耗高，手動(dòng)操作，需要配備的工人多，用水量大，繁瑣的濾布清洗、安裝，廢渣廢水產(chǎn)生量大，且難以回收利用。板框壓濾一般分為明濾、暗濾兩種方式，暗濾方式難預(yù)防料液泄露，明濾的濾出液處于開放環(huán)境中，容易發(fā)生交叉污染，難以滿足微生物限量要求嚴(yán)格的食品和醫(yī)藥級(jí)生物制品的生產(chǎn)要求。畢赤酵母重組菌的發(fā)酵目前的發(fā)酵方式為補(bǔ)料分批發(fā)酵，中后期菌體達(dá)到很高的密度、粘度很大。發(fā)酵、除菌、超濾濃縮操作單元離散化，產(chǎn)量的進(jìn)一步提高存在著瓶頸效應(yīng)，畢赤酵母誘導(dǎo)表達(dá)相較長(zhǎng)，發(fā)酵中后期酶活達(dá)到了較高水平，但酶不斷產(chǎn)生的過程中也同時(shí)存在著酶的不斷降解和酶在發(fā)酵過程的穩(wěn)定性問題。放罐后發(fā)酵液在預(yù)濾儲(chǔ)罐待濾過程中，菌體處于缺氧和營(yíng)養(yǎng)匱乏狀態(tài)，菌體衰亡加速，發(fā)酵液則變得越來越粘稠，給下游處理帶來了很大的困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種脂肪酶高效生產(chǎn)方法，包括耦合的脂肪酶高密度發(fā)酵表達(dá)與膜提取步驟，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的高效表達(dá)、高效分離與高提取得率的清潔生產(chǎn)。具體步驟如下如圖2所示。在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，采用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動(dòng)后，控制溶氧為初始溶氧值40% 50%，當(dāng)菌體濃度達(dá)到100 110g/L后，適當(dāng)限制溶氧于10 % 20 %，整個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇濃度維持于0. 08 0. 12 %。從誘導(dǎo)相60 士 2h后開始進(jìn)行發(fā)酵提取耦合，不斷進(jìn)行料液循環(huán)以及滲透液循環(huán)操作，持續(xù)約20 30h。陶瓷膜工藝參數(shù)膜截留分子量800kDa、膜操作壓力0. 25MPa、溫度20 28°C、濕菌體含量30% 40%，耦合啟動(dòng)時(shí)，先往陶瓷膜儲(chǔ)罐中加約為原發(fā)酵液體積三分之一至五分之一的水，然后啟動(dòng)耦合陶瓷膜微濾、膜超濾等。超濾膜的工藝條件膜截留分子量10 30kDa、膜操作壓力0. 5MPa、溫度20 26°C、濃縮倍數(shù)以總蛋白質(zhì)濃度為控制指標(biāo)，約為 20 24g/L。所述發(fā)酵罐與陶瓷膜之間設(shè)置一個(gè)緩沖儲(chǔ)罐用于控制料液的循環(huán)速度。
脂肪酶酶活測(cè)定橄欖油法，參照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T23535-2009。濕菌體含量測(cè)定料液固形物含量是陶瓷膜微濾工藝控制的一個(gè)重要指標(biāo)，為了方便檢測(cè)與調(diào)控，本發(fā)明以濕菌體含量為控制指標(biāo)，即取IOml發(fā)酵液，6000rpm離心lOmin， 棄上清液，離心管倒置于濾紙上數(shù)分鐘，稱重，再折算成IOOml發(fā)酵液的菌體濕重，以重量體積百分比表示。膜通量測(cè)定用量筒測(cè)量濾出液，同時(shí)秒表計(jì)時(shí)，按以下公式計(jì)算膜通量J = V/St,式中J為膜通量(L/m2 · h)、V為透過液體積(L)、S為有效膜面積(m2)、 t為微濾時(shí)間(h)。通常以膜衰減曲線和膜擬穩(wěn)態(tài)通量來評(píng)價(jià)過濾效果，微濾啟動(dòng)后，膜通量迅速衰減至某個(gè)值后在一段時(shí)間內(nèi)維持?jǐn)M穩(wěn)定狀態(tài)，這時(shí)的膜通量稱為膜擬穩(wěn)態(tài)通量。粘度利用NDJ-IB旋轉(zhuǎn)粘度計(jì)進(jìn)行測(cè)量?？偟鞍诐舛瓤捡R斯亮藍(lán)法。微生物的檢測(cè)根據(jù)中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789. 2-2010, GB4789. 3-2010、 GB4789. 15-2010檢驗(yàn)菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)量、霉菌和酵母菌落數(shù)。致病菌(沙門氏菌、 志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌)則按照GB4789. 4-2010、GB/T4789. 5-2003、 GB4789. 10-2010、GB/T4789. 11-2003 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)。誘導(dǎo)階段，溶氧分段控制，以100 110g/L菌體濃度為控制點(diǎn)，前階段給予較高溶氧是為了讓菌體盡快長(zhǎng)至高密度，后階段控制較低溶氧，并在較低溶氧的條件下優(yōu)化得到最佳的其他工藝條件，既能使較高的產(chǎn)物比生成率維持較長(zhǎng)的時(shí)間，也能使終菌體濃度控制于適當(dāng)水平，改善發(fā)酵液的粘度，降低下游提取的難度，另外，較低的溶氧工藝條件，在工業(yè)生產(chǎn)上容易實(shí)現(xiàn)，使生產(chǎn)工藝容易放大到產(chǎn)業(yè)規(guī)模。陶瓷膜的應(yīng)用彌補(bǔ)了板框的不足。陶瓷膜微濾是以壓力差為推動(dòng)力的分子篩膜分離過程，在生化制藥、果汁飲料、乳制品、精細(xì)化工、污水處理、工業(yè)/民用/飲用水領(lǐng)域，得到了廣泛的應(yīng)用，在除菌方面也得到了廣泛的推廣。陶瓷膜可以除去幾乎所有的微生物。升或噸級(jí)規(guī)?；奶沾赡のV技術(shù)在畢赤酵母除菌中的應(yīng)用還未見報(bào)道。本發(fā)明創(chuàng)新性地在誘導(dǎo)階段采用了兩段式溶氧控制策略，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的高效表達(dá)，降低后續(xù)提取的難度，便于工業(yè)化放大；建立了發(fā)酵罐、陶瓷膜和超濾膜三者耦合的生產(chǎn)方式，工藝路線流程如圖2所示，使得酶不斷被實(shí)時(shí)的分離和濃縮富集，減少了發(fā)酵罐中酶表達(dá)的同時(shí)被蛋白酶降解的程度，提高了總產(chǎn)量。在發(fā)酵罐與陶瓷膜之間設(shè)置緩沖儲(chǔ)罐， 易于控制料液的循環(huán)速度，也便于添加消泡劑，減少料液的氣含量，避免陶瓷膜供料泵與內(nèi)循環(huán)泵的空轉(zhuǎn)或泵功率減弱，提高了料液也膜的有效接觸面積和料液循環(huán)效率。滲透液循環(huán)減少了培養(yǎng)基成分的流失，維持發(fā)酵體系中水、培養(yǎng)基成分、微量元素含量等的穩(wěn)定，也大幅減少了用水量和廢水產(chǎn)生量，節(jié)能減排。另外，滲透液循環(huán)的同時(shí)不斷回收流失的酶， 提高了提取得率。在發(fā)酵表達(dá)階段連續(xù)流加甲醇，使得耦合系統(tǒng)中循環(huán)液也保持一定濃度的甲醇，利用甲醇對(duì)雜菌的抑制作用，保證了膜濾液的高度無菌狀態(tài)。


圖1板框壓濾工藝流程圖；圖2脂肪酶清潔生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。生物材料的獲得本發(fā)明以含有華根霉(Rhizopus chinensis)CCTCC No. M201021脂肪酶基因的重組酵母菌株GS115/pPIC9K-proRCL為生產(chǎn)菌株。生產(chǎn)菌株GS115/pPIC9K_proRCL已在 Xiao-ffei Yu, Le-Le Wang, Yan Xu. Rhizopus chinensis lipase :gene cloning, expression in Pichia pastoris and properties. (2009)Journal of Molecular Catalysis B =Enzymatic 57 304-311 中公開。實(shí)施例1脂肪酶的生產(chǎn)方法取菌種甘油保存管，吸200 μ m接到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，搖床30°C培養(yǎng)18小時(shí)左右，當(dāng)種子液0D_達(dá)2 5后，完成搖瓶種子液的制備。然后轉(zhuǎn)入5L發(fā)酵罐BSM基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行種子培養(yǎng)，當(dāng)菌體濕重(DCW)達(dá)到23g/L左右，移種至50L發(fā)酵罐中進(jìn)行培養(yǎng)，各級(jí)接種量皆為10%。50L罐發(fā)酵，起始裝液量為18L，在30°C、pH5. 5、溶氧50% 80%條件下進(jìn)行甘油生長(zhǎng)相培養(yǎng)。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基中甘油消耗完，溶氧值大幅度上升，然后進(jìn)入過渡相，流加50% 甘油(含12mL/L PTM1)，使菌體濃度長(zhǎng)至35 39g/L，停止甘油補(bǔ)加，饑餓0. 5h，然后進(jìn)入誘導(dǎo)相，進(jìn)行甲醇(每Kg甲醇含30ml PTM1)流加，溫度控制于26 28°C。在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，采用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動(dòng)后，控制溶氧為初始溶氧值40% 50%， 當(dāng)菌體濃度達(dá)到100 110g/L，適當(dāng)限制溶氧于10% 20%，整個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇濃度維持于0. 08 0. 12%。誘導(dǎo)60h后，啟動(dòng)耦合操作，如圖2所示不斷進(jìn)行料液循環(huán)以及滲透液循環(huán)，持續(xù)約20h。耦合啟動(dòng)時(shí)，先往陶瓷膜儲(chǔ)罐中加約為原發(fā)酵液體積三分之一的水，然后啟動(dòng)耦合陶瓷膜微濾、膜超濾。當(dāng)殘料液酶活低于初始發(fā)酵液酶活的10% -20% 時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，撤去超濾滲透液的循環(huán)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行微濾濃縮，當(dāng)膜通量由擬穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)為下降至50%時(shí)停止陶瓷膜微濾操作，最后超濾濃縮至總蛋白濃度約20 25g/L，停止操作。陶瓷膜微濾工藝參數(shù)膜面積為0. 11m2、膜截留分子量800kDa、膜操作壓力 0. 25MPa、溫度20 28°C、濕菌體含量30% 40%。有機(jī)卷式超濾工藝條件膜截留分子量10 30kDa、膜操作壓力0. 5MPa、溫度20 26°C、濃縮倍數(shù)以總蛋白質(zhì)濃度為控制指標(biāo)， 約為20 24g/L。涉及的培養(yǎng)基YPD 蛋白粉20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/LBSM =CaSO4 (cp) 1. lg/L, K2SO4(AR) 18. 2g/L,無水硫酸鎂(AR) 7. 27g/L， KOH (AR) 4. 128g/L，甘油 40g/L,85% Η3Ρ0426· 7ml/LPTMl 五水硫酸銅6g/L，碘化鉀0. 089g/L, 一水硫酸猛3. 0g/L,鉬酸鈉0. 2g/L，硼酸0. 02g/L,七水硫酸鋅42. 2g/L，七水硫酸亞鐵65g/L，生物素0. 2g/L，六水氯化鈷0. 5g/L， 硫酸5ml/L。結(jié)果分析生產(chǎn)水平發(fā)酵液終體積40L，菌體干重DCW為180g/L，最高單位酶活26，000U/ ml，產(chǎn)物對(duì)菌體得率69. 333U/gDCff,比活力為2. 730X 106U/g，提取酶活得率82. 17%。
除菌效果菌落總數(shù)小于10CFU/ml，大腸菌群小于3，酵母與霉菌小于10CFU/ml， 致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌)未檢出。水用量與廢水產(chǎn)生量水用量約176L，清洗用水約占88%，廢水產(chǎn)生量約182L。本發(fā)明滲透液循環(huán)，節(jié)約了陶瓷膜獨(dú)立單元操作中常規(guī)需要的3 5倍發(fā)酵液體積的洗濾用水，即減少了 115 190L用水及廢水產(chǎn)生量。實(shí)施例2脂肪酶的生產(chǎn)方法涉及的培養(yǎng)基同實(shí)施例1實(shí)施方法 用YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)一級(jí)、二級(jí)搖瓶種子液，在火焰保護(hù)下接種種子罐，種子罐的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基BSM。培養(yǎng)條件為30°C，pH5. 5，溶氧30% 80%。11 14h后，種子罐中的菌體濃度長(zhǎng)至23g/L左右，移種至3m3發(fā)酵罐，各級(jí)接種量皆為10%。3KL罐發(fā)酵，起始裝液量為1KL，生長(zhǎng)相培養(yǎng)條件30°C，pH5. 5，溶氧30% 80%， 用氨水來控制PH，當(dāng)甘油耗盡，溶氧激劇上升時(shí)，甘油生長(zhǎng)相結(jié)束，進(jìn)入甘油過渡相，流加 50%甘油，同時(shí)按每升50%甘油添加12ml PTMl的比例流加離子液，使菌體濃度長(zhǎng)至35 39g/L，停止補(bǔ)料，饑餓0. 5h，進(jìn)行甲醇流加，并按30ml每Kg甲醇進(jìn)行PTMl的流加，溫度控制于26 28°C。在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，采用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動(dòng)后，控制溶氧為初始溶氧值40% 50%，當(dāng)菌體濃度達(dá)到100 110g/L，適當(dāng)限制溶氧于10% 20%，整個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇濃度維持于0. 08 0. 12%。誘導(dǎo)60h后，啟動(dòng)耦合操作， 如圖2所示不斷進(jìn)行料液循環(huán)以及滲透液循環(huán)，持續(xù)約20h。耦合啟動(dòng)時(shí)，先往陶瓷膜儲(chǔ)罐中加約為原發(fā)酵液體積四分之一水，然后啟動(dòng)耦合陶瓷膜微濾、膜超濾。當(dāng)殘料液酶活低于初始發(fā)酵液酶活的10% -20%時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，撤去超濾滲透液的循環(huán)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行微濾濃縮，當(dāng)膜通量由擬穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)為下降至50%時(shí)停止陶瓷膜微濾操作，最后超濾濃縮至總蛋白濃度約20 25g/L，停止操作。陶瓷膜微濾工藝參數(shù)膜面積6. 66m2，其他參數(shù)同實(shí)施例1。有機(jī)卷式超濾工藝條件膜面積25m2，其他條件同實(shí)施例1。結(jié)果分析生產(chǎn)水平發(fā)酵液終體積1. 75KL，菌體干重DCW為146g/L，最高單位酶活 20，500U/ml，產(chǎn)物對(duì)菌體得率81，4384U/gDCff,比活力為2. 910X 106U/g，提取酶活得率 85. 24%。除菌效果菌落總數(shù)小于10CFU/ml，大腸菌群小于3，酵母與霉菌小于10CFU/ml， 致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌)未檢出。水用量與廢水產(chǎn)生量水用量約6. 32噸，清洗用水約占83%，廢水產(chǎn)生量約6. 5 噸。本發(fā)明滲透液循環(huán)，節(jié)約了陶瓷膜獨(dú)立單元操作中常規(guī)需要的3 5倍發(fā)酵液體積的洗濾用水，即減少了 5. 1 8. 5噸用水及廢水產(chǎn)生量。實(shí)施例3脂肪酶的高密度發(fā)酵與高效分離提取耦合生產(chǎn)方法涉及的培養(yǎng)基同實(shí)施例1實(shí)施方法經(jīng)過500ml和5LYPD培養(yǎng)基搖瓶培養(yǎng)，300L YPD培養(yǎng)基種子罐、3KL BSM培養(yǎng)基種子罐二級(jí)種子培養(yǎng)，最后移種至30KL罐進(jìn)行發(fā)酵進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，各級(jí)接種量皆為10%。
30KL罐發(fā)酵，起始裝液量為10KL，生長(zhǎng)相培養(yǎng)條件30°C，pH5. 5，溶氧30% 80%，用氨水來控制pH，當(dāng)甘油耗盡，溶氧激劇上升時(shí)，甘油生長(zhǎng)相結(jié)束，進(jìn)入甘油過渡相， 流加50%甘油，同時(shí)按每升50%甘油添加12ml PTMl的比例流加離子液，使菌體濃度長(zhǎng)至 35 39g/L，停止補(bǔ)料，饑餓0. 5h，進(jìn)行甲醇流加，并按30ml每Kg甲醇進(jìn)行PTMl的流加，溫度控制于26 28°C。在甲醇誘導(dǎo)表達(dá)階段，采用溶氧兩段式控制策略，甲醇流加啟動(dòng)后，控制溶氧為初始溶氧值40% 50%，當(dāng)菌體濃度達(dá)到100 110g/L，適當(dāng)限制溶氧于10% 20 %，整個(gè)誘導(dǎo)表達(dá)過程中，甲醇濃度維持于0. 08 % 0. 12 %。誘導(dǎo)60h后，啟動(dòng)耦合操作， 如圖2所示不斷進(jìn)行料液循環(huán)以及滲透液循環(huán)，持續(xù)約20h。耦合啟動(dòng)時(shí)，先往陶瓷膜儲(chǔ)罐中加約為原發(fā)酵液體積四分之一水，然后啟動(dòng)耦合陶瓷膜微濾、膜超濾。當(dāng)殘料液酶活低于初始發(fā)酵液酶活的10% -20%時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，撤去超濾滲透液的循環(huán)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行微濾濃縮，當(dāng)膜通量由擬穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)為明顯下降時(shí)停止陶瓷膜微濾操作，最后超濾濃縮至總蛋白濃度約20 24g/L，停止操作。陶瓷膜微濾工藝參數(shù)膜面積140m2，其他參數(shù)同實(shí)施例1。有機(jī)卷式超濾工藝條件膜面積225m2，其他條件同實(shí)施例1。結(jié)果分析 生產(chǎn)水平發(fā)酵液終體積17. 3KL，菌體干重DCW為134g/L，最高單位酶活 17，300U/ml，產(chǎn)物對(duì)菌體得率80，045U/gDCff,比活力為2. 830 X 106U/g，提取酶活得率 86. 07%。除菌效果菌落總數(shù)小于10CFU/ml，大腸菌群小于3，酵母與霉菌小于10CFU/ml， 致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌)未檢出。水用量與廢水產(chǎn)生量水用量約80噸，清洗用水約占86%，廢水產(chǎn)生量約83噸。 本發(fā)明滲透液循環(huán)，節(jié)約了陶瓷膜獨(dú)立單元操作中常規(guī)需要的3 5倍發(fā)酵液體積的洗濾用水，即減少了 49 83噸用水及廢水產(chǎn)生量。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶的高效生產(chǎn)方法，其特征在于將脂肪酶的高密度發(fā)酵生產(chǎn)與分離提取相耦合，所述提取步驟包括陶瓷膜微濾及超濾膜超濾。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述高密度發(fā)酵生產(chǎn)采用溶氧兩段式控制策略，具體為甲醇誘導(dǎo)相啟動(dòng)后，溶氧控制于40% 50%，菌體濃度DCW達(dá)到100 110g/L 后，溶氧控制于10% 20%。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述耦合通過料液循環(huán)與滲透液循環(huán)實(shí)現(xiàn)。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述料液循環(huán)與滲透液循的工藝條件為啟動(dòng)料液循環(huán)與滲透液循環(huán)后，當(dāng)殘料液酶活低于初始發(fā)酵液酶活的10% -20%時(shí)結(jié)束發(fā)酵， 撤去滲透液的循環(huán)，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行陶瓷膜微濾濃縮；當(dāng)膜通量從擬穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)為下降至50%時(shí)停止陶瓷膜微濾操作，最后超濾濃縮至總蛋白濃度約20-24g/L，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵與提取的耦合。
5.權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述陶瓷膜微濾工藝參數(shù)為膜截留分子量800kDa、膜操作壓力0. 25MPa、溫度20_28°C、濕菌體含量30-40%。
6.權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征在于所述超濾膜工藝參數(shù)為膜截留分子量 10-30kDa、膜操作壓力0. 5MPa、溫度20_26°C、濃縮總蛋白質(zhì)濃度為20_25g/L。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵罐與陶瓷膜之間設(shè)置一個(gè)緩沖儲(chǔ)罐用于控制料液循環(huán)的速度。
全文摘要
本發(fā)明公開一種脂肪酶的高效生產(chǎn)方法，發(fā)酵階段采用了兩段式溶氧控制策略，實(shí)現(xiàn)脂肪酶的高效表達(dá)，降低后續(xù)提取的難度；分離提取階段通過過料液循環(huán)與滲透液循環(huán)實(shí)現(xiàn)發(fā)酵與提取的偶聯(lián)。應(yīng)用本本發(fā)明使得酶不斷被實(shí)時(shí)的分離和濃縮富集，減少了發(fā)酵罐中酶表達(dá)的同時(shí)被蛋白酶降解的程度，提取酶活得率可達(dá)85％以上，菌落總數(shù)小于10CFU/ml，大腸菌群小于3，酵母與霉菌小于10CFU/ml，致病菌(沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌)未檢出。通過滲透液循環(huán)可大幅減少了用水量和廢水產(chǎn)生量，節(jié)能減排。本方法實(shí)現(xiàn)了脂肪酶的高效清潔生產(chǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12R1/84GK102250855SQ20111022276
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者喻曉蔚, 徐巖, 穆曉清 申請(qǐng)人:江南大學(xué)