專利名稱：變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測黃酒麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測黃酒麥曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的方法，尤其是一種利用 PCR-DGGE(Denaturing gradient gel electrophoresis,^ ^^!!!) ii^^llJII 酒麥曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，本發(fā)明屬于微生物生態(tài)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
變性梯度凝膠電泳技術(shù)是一種檢測DNA突變的電泳技術(shù)。Muzyer等在微生物生態(tài)研究中首次采用了該技術(shù)，并且證實(shí)了該技術(shù)在研究微生物多樣性方面具有明顯的優(yōu)越性。DGGE能夠分離長度相同但是堿基組成不相同的DNA片段混合物，變性劑——尿素和去離子甲酰胺添加到普通的丙烯酰胺凝膠中從而形成從低到高的線性梯度。在一定的溫度條件下，不同堿基組成的DNA片段解鏈溫度是不相同的，從而會造成不同的電泳遷移率，故將這些DNA片段在添加變性劑的凝膠中進(jìn)行電泳時，會遷移到凝膠的不同位置，最終將長度相同但堿基組成不同的DNA片段分離開來。將PCR和DGGE聯(lián)合起來，在適宜的變性梯度條件下能夠分辨出一個堿基對的差異，分辨率高。染色后的凝膠圖譜通過條帶數(shù)的多少在一定程度上可以反應(yīng)樣品中微生物組成的差異，條帶的亮度在一定程度上可以反應(yīng)出樣品中微生物的多少。傳統(tǒng)的研究微生物多樣性的方法主要依賴于培養(yǎng)法，即通過菌株的分離純化、形態(tài)和顯微鏡觀察、生理生化特征的比較后進(jìn)行菌株的分類鑒定，該方法步驟復(fù)雜、工作量大，而且對于生理生化特征相似的菌株難以進(jìn)行正確的鑒定和分類。黃酒是中國傳統(tǒng)的釀造酒之一，“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色。麥曲在黃酒的釀造過程中發(fā)揮重要的作用，為黃酒的釀造提供多種復(fù)合酶、風(fēng)味物質(zhì)。目前對于黃酒麥曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要集中于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和初步鑒定。應(yīng)用PCR-DGGE技術(shù)分析黃酒麥曲中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，對判斷和鑒定麥曲中的優(yōu)勢微生物、功能微生物具有重要的理論和實(shí)踐
眉、ο

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法存在的問題，利用變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測黃酒麥曲中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)。本發(fā)明不依賴傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，利用適合DGGE分離的細(xì)菌通用引物，結(jié)合PCR-DGGE技術(shù)分析黃酒麥曲中的優(yōu)勢細(xì)菌和功能微生物。本方法具有簡便、快捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)，結(jié)合傳統(tǒng)的分離方法能夠更加全面的反應(yīng)麥曲中的細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成，為研究黃酒麥曲的功能微生物提供有力的證明。本發(fā)明的技術(shù)方案利用氯化芐法提取黃酒麥曲樣品的基因組DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)，DGGE電泳分離DNA片段，切膠回收微生物對應(yīng)的條帶，二次PCR擴(kuò)增及 T-克隆和挑選陽性克隆子，DGGE電泳條帶比對，測序鑒定切膠條帶對應(yīng)的微生物。本發(fā)明通過PCR-DGGE技術(shù)檢測黃酒麥曲中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)，可廣泛用于分析不同工藝、不同地區(qū)的黃酒麥曲樣品及同一種黃酒麥曲樣品制作過程中細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)變化的規(guī)律，為功能微生物的分離鑒定提供參考。具體實(shí)施方法實(shí)施例1基因組DNA提取稱取l.Og麥曲樣品放入IOmL離心管中，同時加入2. 5mL提取液(100mmol/L Tris-HCl, pH8. 0,40mmol/L EDTA, pH8. 0)振蕩混勻后，再加入 lmL10% SDS 和 2mL 氯化芐， 50°C保溫 Ih (每 IOmin 上下顛倒混勻)，加入 ImL 3mol/L 的 NaAc，冰浴 15min, 12，000r/min 離心15min，取上清，加入等體積的異丙醇，_20°C放置2h，12，000r/min離心15min，棄上清， 加入70%乙醇洗滌，離心15min，棄上清，待乙醇揮發(fā)完后加入50 μ L TE溶解。實(shí)施例2PCR-DGGE分析設(shè)計(jì)擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)的引物對，并在正向引物的5，端加上GC夾；引物是=Fl 5’ -CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’Rl :5，-ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。50μ L 反應(yīng)體系包括36 μ L雙蒸水，5 μ LlO XPCR Buffer, 4 μ L dNTP，2 μ L 的引物，1 μ L 的模板，0. 25 μ L 的 ExTaq 酶(5u/ μ L)。94°C預(yù)變性 4min，94°C變性 45S，55°C退火 45S，72°C延伸 45S，35 個循環(huán)，最后 72°C延伸 IOmin0 將 PCR 產(chǎn)物在變性梯度凝膠電泳上進(jìn)行分離；電泳的相關(guān)參數(shù)是電壓150V，60°C下電泳4h，丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度是50% -65% (100%的變性劑由7mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 40%的去離子甲酰胺組成，電泳結(jié)果如

圖1所示，三個泳道為設(shè)置的三個重復(fù)。實(shí)施例3細(xì)菌群落分析對DGGE膠上的條帶進(jìn)行切膠回收將10000 X STOR-Green稀釋成IXSTOR-Green 進(jìn)行染色，其染色過程分3次，每次染色15min ；切膠回收的方法用無菌小刀將優(yōu)勢條帶切下后放入滅過菌的離心管中，加入200 μ L的滅菌雙蒸水4°C冰箱過夜；切膠條帶PCR后進(jìn)行T-克隆PCR擴(kuò)增采用的引物及擴(kuò)增程序?qū)嵤├? —樣。將實(shí)施例2中得到的PCR產(chǎn)物與本實(shí)施例中陽性克隆子對應(yīng)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE比對。把比對正確的陽性克隆子進(jìn)行測序，在Genbank進(jìn)行結(jié)果比對；獲得黃酒麥曲細(xì)菌微生物群落的結(jié)構(gòu)。選取圖1中A、B條帶為例子進(jìn)行說明，A條帶測序結(jié)果如SEQ ID N0. 3所示，B條帶測序結(jié)果如SEQ ID N0. 4 所示。A、B的Genbank部分比對結(jié)果分別如圖2、圖3所示。最終確定A、B最可能的微生物如下表(表1)所示。表1微生物相似度鑒定
權(quán)利要求
1.變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測黃酒麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于提取麥曲樣品基因組DNA后，通過特定引物PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)、DGGE電泳進(jìn)行條帶分離， 條帶回收后進(jìn)行二次PCR及T-克隆，挑選陽性克隆子DGGE條帶比對，比對正確后測序并到 GenBank獲取微生物的相關(guān)信息。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述樣品為任一種待檢測的黃酒麥曲樣品，樣品采用縮分法取樣，最終樣品的重量為lg。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述特定引物為Fl5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3，，Rl 5， -ATTACCGCGGCTGCTGG-3，。
4.權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性％iin， 94°C變性45S，55°C退火45S，72°C延伸45S，35個循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
5.權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于所述變性梯度凝膠電泳的相關(guān)參數(shù)是電壓 150V，60°C下電泳4h，丙烯酰胺凝膠濃度為8%，變性梯度是50% -65 %，100%的變性劑由 7mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的去離子甲酰胺組成。
6.權(quán)利要求1-2所述的方法，其特征在于所述對DGGE膠上的條帶回收過程為將 10000 X SYBR-Green稀釋成1 X SYBR-Green進(jìn)行染色，染色過程分3次，每次染色15min ；用無菌小刀將優(yōu)勢條帶切下后放入滅過菌的離心管中，加入200 μ L的滅菌雙蒸水4°C冰箱過夜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種變性梯度凝膠電泳技術(shù)檢測黃酒麥曲中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的方法，采用氯化芐法提取麥曲樣品基因組DNA，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)，DGGE電泳條帶分離，割膠回收后二次PCR及T-克隆，挑選陽性克隆子DGGE條帶比對，比對正確后測序并到GenBank獲取微生物的相關(guān)信息。本發(fā)明簡便、快捷、重復(fù)性好，對分析黃酒麥曲中的優(yōu)勢細(xì)菌和功能微生物具有很好的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12Q1/04GK102277432SQ201110222810
公開日2011年12月14日 申請日期2011年8月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月4日
發(fā)明者張中華, 管政兵, 陸健, 陳亮亮 申請人:江南大學(xué)