專利名稱：甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縫cr檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時檢測甲型中甲1和甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
流感是一種季節(jié)性疾病，在溫帶地區(qū)，流感會在整個冬季流行，在熱帶地區(qū)，流感病毒一年四季均存在，雨季流行多見。常見的甲型流感，俗稱傷風(fēng)，是由病原體為甲型流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，主要傳播方式是空氣飛沫傳播。流感發(fā)病嚴(yán)重程度與個體免疫狀況有關(guān)。一般來說，僅約50%的感染病人會發(fā)展成典型流感臨床癥狀。流感典型癥狀以突然發(fā)熱、頭暈頭痛、肌痛、全身癥狀輕、同時可伴有喉嚨痛和咳嗽、鼻塞、流涕、胸痛、 眼痛、畏光等癥狀。發(fā)熱體溫可達(dá)39 40°C，一般持續(xù)2 3天后漸退。甲型和乙型流感的臨床癥狀相似，但是甲型流感病毒導(dǎo)致的住院率四倍于乙型流感病毒。乙型流感通常有肌炎及胃腸道癥狀。流感病毒是一種造成人類及動物患流行性感冒的RNA病毒，屬于正黏液病毒科， 其病毒基因組由8條負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成(如

圖1)。根據(jù)核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同， 分為甲型、乙型和丙型。甲型流感病毒根據(jù)表面血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶(NA)的不同，分為16個HA亞型和9個NA亞型；乙型和丙型流感病毒不分亞型。甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的；乙型和丙型流感僅在人之間轉(zhuǎn)播，以局部暴發(fā)和散發(fā)流行為特征。引起流感大流行的主要是甲型流感病毒。流感病毒的檢測方法主要有病毒的分離培養(yǎng)，免疫學(xué)診斷和分子生物學(xué)診斷。病毒的分離培養(yǎng)和免疫學(xué)診斷是流感的實(shí)驗(yàn)室診斷的常規(guī)方法，分子生物學(xué)診斷中出現(xiàn)了許多快速特異的方法，三種方法具有以下特點(diǎn)
1)病毒分離培養(yǎng)對技術(shù)要求較高，費(fèi)用較昂貴，耗時長，且各實(shí)驗(yàn)室分離陽性率各不相同，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要，目前僅用于實(shí)驗(yàn)研究。2)血清學(xué)方法不能高通量處理樣本，不能準(zhǔn)確反映當(dāng)前是否感染或攜帶病毒。血清學(xué)的診斷還存在滯后性，該方法費(fèi)時、費(fèi)力，無法滿足快速、早期診斷的要求。3)病毒核酸檢測由于以上兩種方法費(fèi)時、費(fèi)力，為了提高檢測速度，可直接從臨床標(biāo)本(咽拭子、鼻拭子、鼻咽或氣管抽取物、痰)中檢測病毒的核酸。該方法具有快速性、準(zhǔn)確性和高靈敏性等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)α鞲胁《靖腥咀鞒鲈缙谠\斷，給疫情的快速分析和控制提供有力的技術(shù)支撐。其中的實(shí)時定量RT-PCR檢測平臺已成為最簡捷和可靠的流感病毒檢測方法。從上面可見，常用的病毒分離法比較費(fèi)時，血清學(xué)診斷方法存在滯后性，基因序列測定方法也較為復(fù)雜和繁瑣的。因此，建立對甲1型和甲3型流感病毒的快速檢測的技術(shù)， 對建立規(guī)范的診療體系、識別重癥及危重癥患者和進(jìn)行流感疾病早期預(yù)警都具有重要的臨床意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒。本發(fā)明的甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括RNA酶抑制劑、RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照，
其中，
所說的RNA酶抑制劑為焦碳酸二乙酯(DEPC)水； 所說的RT-PCR反應(yīng)液包括IOX緩沖液、MgC12和dNIPs ； 所說的甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液包括以下組分
組分(1)由一對檢測甲1型流感病毒的引物和一條檢測甲1型流感病毒的探針組成； 其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探針的堿基序列為 SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；
組分(2):由一對檢測甲3型流感病毒的引物和一條檢測甲3型流感病毒的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)； 所說的酶混合液包括Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。表1為上述甲1/甲3型流感病毒引物和探針的序列。
權(quán)利要求
1.甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，包括RNA酶抑制劑、RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照，其中，所說的RT-PCR反應(yīng)液包括IOX緩沖液、MgC12和dNIPs ；所說的甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液包括以下組分組分(1)由一對檢測甲1型流感病毒的引物和一條檢測甲1型流感病毒的探針組成； 其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；探針的堿基序列為 SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分(2):由一對檢測甲3型流感病毒的引物和一條檢測甲3型流感病毒的探針組成；其中，兩條引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；所說的酶混合液包括Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒， 其特征在于，所說的檢測甲1型流感病毒的引物及探針的配比分別為SEQ ID No. 1:SEQ ID No. 2: SEQ ID No.3為500nM: 500nM: 200nM ；所說的檢測甲3型流感病毒的引物及探針的配比分別為SEQ ID No. 4:SEQ ID No. 5: SEQ ID No. 6 為 600nM: 600nM: 200nM。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所說的熒光報告基團(tuán)選自FAM、HEX、ROX、CT3或CY5熒光報告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)選自BHQ1、BHQ2或BHQ3熒光淬滅基團(tuán)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所說的逆轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，所說的Taq酶為熱啟動Taq酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，其特征在于，所說的陽性對照為滅活的病毒培養(yǎng)液；所說的陰性對照為去RNA酶水。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種甲1/甲3型流感病毒核酸雙重?zé)晒舛縋CR檢測試劑盒，包括RNA酶抑制劑、RT-PCR反應(yīng)液、酶混合液、甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液、陽性對照和陰性對照，其中，所說的甲1/甲3型流感病毒雙重反應(yīng)液包括以下組分組分(1)由一對檢測甲1型流感病毒的引物和一條檢測甲1型流感病毒的探針組成；組分(2)由一對檢測甲3型流感病毒的引物和一條檢測甲3型流感病毒的探針組成；所說的酶混合液包括Taq酶和逆轉(zhuǎn)錄酶。本發(fā)明的試劑盒能夠同時檢測出甲1、甲3型流感病毒，解決了現(xiàn)有產(chǎn)品只能在一管反應(yīng)中檢測一種流感病毒的問題。本發(fā)明還具有操作簡便、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)，在流感病毒體外診斷領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/93GK102251062SQ20111022395
公開日2011年11月23日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月5日
發(fā)明者嚴(yán)浩榮, 劉中華, 張旭, 王國強(qiáng), 魏趙延 申請人:江蘇碩世生物科技有限公司