專利名稱：一種定量檢測dna特定位點甲基化程度的方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測DNA甲基化的方法及試劑盒，尤其是一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、 遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。DNA甲基化是最早發(fā)現(xiàn)的基因表觀修飾方式之一，存在于所有生物的DNA遺傳物中。DNA甲基化能關(guān)閉或啟開某些基因的活性，去甲基化則誘導(dǎo)或鈍化了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發(fā)生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMTs)的作用下使CpG 二核苷酸5'端的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?'甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調(diào)控了基因的表達[1]。脊椎動物基因的甲基化狀態(tài)有三種持續(xù)的低甲基化狀態(tài)，如管家基因；去甲基化狀態(tài)，如發(fā)育階段中的一些基因；高度甲基化狀態(tài)，如女性的一條失活的X染色體[2]。在哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現(xiàn)的頻率僅有1%，遠低于基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區(qū)域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區(qū)，形成所謂的CpG島ω。通常，CpG島大約含有500多個堿基。 在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化[4]，CpG島通常位于基因的啟動子區(qū)或是第一個外顯子區(qū)[5]。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態(tài)，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩(wěn)定的保留[6]。當腫瘤發(fā)生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態(tài)，以致于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤的一個重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發(fā)生癌癥的機率提高[7]。因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預(yù)測、分類、分級及預(yù)后評估提供了新的依據(jù)。隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發(fā)出來以滿足不同類型研究的要求。這些方法概括起來可分為三類序列檢測法，甲基化DNA特異性內(nèi)切酶法和化學(xué)法。Eads等[8]2000年報道的熒光法利用實時PCR(Real-time PCR)檢測特定位點甲基化的情況，其過程如下先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設(shè)計一個能與待測位點區(qū)互補的探針，探針的5'端連接報告熒光，3'端連接淬滅熒光，隨后進行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性會將探針序列上5'端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，使得報告熒光發(fā)光，檢測每個循環(huán)報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發(fā)光。同樣的方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平。 高敏感、快速是本方法最顯著的特點，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復(fù)、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點，可以為臨床標本的分子生物學(xué)研究提供可靠的技術(shù)支持?；谏鲜鲈O(shè)計理念，通常采用一條甲基化探針對樣本特異位點進行甲基化檢測， 以特定位點甲基化絕對量作為甲基化程度評定的標準。但是在實際臨床應(yīng)用過程中，由于難以獲得均一的完全病變的臨床樣本，因此在上述實時PCR檢測過程中，不可避免的在病變樣本中摻入了正常樣本的甲基化或非甲基化因素，造成甲基化程度判定的誤差，從而影響了檢測結(jié)果的準確性。在這種情況下，上述實時PCR檢測特定位點甲基化的方法就受到了限制。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的試劑盒。本發(fā)明的方法是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的。一方面，本發(fā)明提供一種定量檢測 DNA特定位點甲基化程度的方法，所述方法包括1)針對待測DNA序列設(shè)計PCR引物，用于擴增待測DNA ；2)針對1)中擴增得到的PCR產(chǎn)物中的CpG位點富集區(qū)設(shè)計一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設(shè)計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設(shè)計的TG探針，它們可以特異地與PCR產(chǎn)物結(jié)合并檢測PCR產(chǎn)物；3) 利用設(shè)計的引物和探針進行實時定量PCR，檢測待測DNA的甲基化程度。優(yōu)選地，所述待測DNA先經(jīng)過化學(xué)處理；更優(yōu)選地，所述化學(xué)處理為重亞硫酸鹽處理。優(yōu)選地，所述步驟1)中設(shè)計的PCR引物為兼并引物，其中對應(yīng)CpG位點處的堿基設(shè)計為CG/TG，這樣的引物可以對甲基化或者非甲基化的待測DNA均進行擴增。優(yōu)選地，所述步驟2、中設(shè)計的CG探針和TG探針長度相同，且二者只在CpG位點處存在差異，其中CG探針中所有的對應(yīng)甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為CG，而TG探針中所有的對應(yīng)非甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為TG。優(yōu)選地，所述步驟3)可以通過檢測到的雙探針的Cq值，計算待測DNA中特定位點的甲基化程度，并且所述甲基化程度分值(Methylation score, MS)通過下式計算MS = 100/[1+2 fcq^cqu']其中CqM和CqU分別為CG探針和TG探針檢測的Cq值。優(yōu)選地，所述步驟2~)中設(shè)計的TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端；更優(yōu)選地，所述熒光標記物選自FAM和HEX。優(yōu)選地，所述步驟2~)中設(shè)計的TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連；優(yōu)選地， 所述淬滅基團選自BHQl。優(yōu)選地，所述步驟3)中的實時定量PCR為TaqMan法。優(yōu)選地，所述待測DNA可以來源于任何生物樣品；更優(yōu)選地，所述待測DNA選自細胞、組織(包括石蠟包埋組織)、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便、及其他分泌物。另一方面，本發(fā)明提供一種用于定量檢測DNA特定位點甲基化程度的試劑盒，所述試劑盒包括1)針對待測DNA序列設(shè)計的PCR引物，用于擴增待測DNA;和2、針對1)中擴增得到的PCR產(chǎn)物中的CpG位點富集區(qū)設(shè)計的一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設(shè)計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設(shè)計的 TG探針，它們可以特異地與與PCR產(chǎn)物結(jié)合并檢測PCR產(chǎn)物。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括重亞硫酸鹽，用于對待測DNA預(yù)先進行化學(xué)處理。優(yōu)選地，所述試劑盒還包括實時定量PCR所需的DNA聚合酶、氯化鎂、dNTP和緩沖液等。優(yōu)選地，所述試劑盒中包括的PCR引物為兼并引物，其中所包含的CpG位點處序列設(shè)計為CG/TG，能夠同時擴增甲基化和非甲基化的待測DNA。優(yōu)選地，所述試劑盒中包括的CG探針和TG探針長度相同，且二者只在CpG位點存在差異，其中CG探針中所有對應(yīng)甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為CG，而TG探針中所有對應(yīng)非甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計成TG。優(yōu)選地，所述試劑盒中包括的TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端；更優(yōu)選地，所述熒光標記物選自FAM和HEX。優(yōu)選地，所述試劑盒中包括的TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連；優(yōu)選地， 所述淬滅基團選自BHQl。優(yōu)選地，所述待測DNA可以來源于任何生物樣品；更優(yōu)選地，所述待測DNA選自細胞、組織(包括石蠟包埋組織)、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便、及其他分泌物。綜上所述，本發(fā)明提供一種利用特異的不含甲基化位點的引物擴增待測的甲基化 DNA,同時利用雙探針和PCR(多聚酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物相結(jié)合并通過實時定量PCR對DNA特定位點的甲基化進行定量分析的方法及其相應(yīng)的試劑盒。具體地，所述方法包括以下步驟1) 針對待測DNA設(shè)計引物，該引物可同時擴增預(yù)先用重亞硫酸鹽處理過的甲基化和非甲基化 DNA片段；幻設(shè)計一對CG和TG熒光標記探針，這對探針可以分別和甲基化或非甲基化的 PCR產(chǎn)物結(jié)合，檢測PCR所有產(chǎn)物；以及幻通過實時定量PCR檢測重亞硫酸鹽處理過的DNA 片段的甲基化程度。基于所述方法而制備的試劑盒包括以下成分1)針對待測序列設(shè)計的特異PCR引物；2)針對甲基化和非甲基化的PCR產(chǎn)物設(shè)計的CG和TG的雙探針；以及3)用于對待測DNA預(yù)先進行化學(xué)處理的重亞硫酸鹽。由此可見，本發(fā)明提供了一種簡便的實時定量PCR方法，用于檢測DNA特定位點的甲基化狀態(tài)，尤其是在CpG島中檢測特定位點的甲基化程度。具體地，本發(fā)明的方法利用針對已知的DNA序列設(shè)計PCR引物將待檢測的序列擴增出來；同時利用一對TaqMan探針與甲基化或非甲基化的PCR (多聚酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物相結(jié)合，并通過實時定量PCR對待測樣本DNA 的甲基化程度進行分析，具體方法原理圖見圖1。采用本發(fā)明的方法檢測的結(jié)果只和特定甲基化位點相關(guān)，而與其他位點無關(guān)，并且其他位點的甲基化狀態(tài)并不影響檢測結(jié)果。重要的是，本發(fā)明能對非均一樣本進行甲基化程度的判定。在這種情況下，采用本發(fā)明的方法和試劑盒對特定甲基化位點進行檢測，就能夠有效地排除待測樣本中正常樣本的干擾，確保檢測結(jié)果的準確性。


以下，結(jié)合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為本發(fā)明提供的利用雙探針與特異引物的實時定量PCR法檢測CpG島內(nèi)特定位點甲基化方法的原理圖，其中A顯示，以待檢測序列的CpG位點富集區(qū)為檢測位點，其中可能是甲基化或非甲基化的C ；B顯示，化學(xué)處理后的特異位點序列；C顯示，針對CpG位點富集區(qū)的一對探針中，CG探針有與甲基化C序列相同的C，TG有和非甲基化C轉(zhuǎn)化為T后序列相同的T。圖2為實施例1中針對特異甲基化位點設(shè)計的引物的PCR結(jié)果。圖3為實施例1中進行實時定量PCR反應(yīng)的結(jié)果圖。其中A為采用CG探針檢測結(jié)腸癌樣本的結(jié)果；B為采用TG探針檢測結(jié)腸癌樣本的結(jié)果；C為采用CG探針檢測正常結(jié)腸樣本的結(jié)果；D為采用TG探針檢測正常結(jié)腸樣本的結(jié)果。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例1Vimentin基因MSP^位點的甲基化和結(jié)腸癌有明顯的相關(guān)性。本實施例采用本發(fā)明提供的方法，檢測該基因的甲基化程度，具體詳述如下。1) DNA重亞硫酸鹽處理提取200ug正常結(jié)腸或結(jié)腸癌樣本的DNA。采用重亞硫酸鹽處理和轉(zhuǎn)化(采用甲基化DNA轉(zhuǎn)化試劑盒K5082100，BioChain Institute Inc. Hayward, CA94545USA)提取的DNA樣品，結(jié)腸癌樣本標示為樣品1，正常結(jié)腸樣本標示為樣品2。將所有的未甲基化的C完全轉(zhuǎn)化為T，轉(zhuǎn)化后的DNA保存于-20°C。2)設(shè)計針對特異甲基化位點的引物設(shè)計能夠同時擴增甲基化和非甲基化模板待檢測特定甲基化位點片段的上下游引物(由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成)，序列如下正向引物5，-GGCGGGGTTTAGTTTTTTGT-3，反向引物5，-ACACGAACCTAATAAACATAACTAC-3，使用該引物對重亞硫酸鹽處理過的DNA片段進行PCR。PCR反應(yīng)體系氯化鎂3mM，dNTP各0. 2mM，上下游引物各0. 25uM，DNA聚合酶1. 5U， 模板 DNA 50ng。PCR 反應(yīng)條件95 "C 10 分鐘；(95 "C 30 秒，56 "C 30 秒，72 "C 30 秒)X 40 次循環(huán)； 72 0C 5分鐘。無論在MSP^位點是否發(fā)生甲基化，DNA片段經(jīng)引物擴增均能產(chǎn)生178bp的PCR產(chǎn)物，電泳檢測結(jié)果見圖2，其中1為正常結(jié)腸樣本DNA，2為結(jié)腸癌樣本DNA。3)設(shè)計CG探針和TG探針在2)中的兩個引物之間設(shè)計探針，用于實時定量PCR分析。以CpG位點完全甲基化或完全非甲基化為模板設(shè)計一對探針，CG探針在CpG位點的堿基設(shè)計為CG，用于檢測甲基化產(chǎn)物，TG探針在CpG位點的堿基設(shè)計為TG，用于檢測非甲基化產(chǎn)物。兩種探針分別用FAM和HEX熒光標記。探針序列(由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成)如下CG 探針5，-FAM-TCGTTTCGAGGTTTTCGCGTTAG-BHQ1 -3，TG 探針5，-HEX-TTGTTTTGAGGTTTTTGTGTTAGAGATG-BHQ1 -3，4)實時定量PCRPCR反應(yīng)是用等摩爾的引物和探針同時包括dNTP和DNA聚合酶。PCR反應(yīng)體系氯化鎂3mM，dNTP各0. 2mM，上下游引物各0. 25uM，探針0. 25uM，DNA 聚合酶1. 5U。PCR 反應(yīng)條件95°C 10 分鐘；(95°C 30 秒，56°C 30 秒，72°C 30 秒)X 40 次循環(huán)結(jié)果見圖3。其中A所示為采用CG探針(特異性檢測甲基化的模板)檢測結(jié)腸癌樣本的結(jié)果，B所示為采用TG探針(特異性檢測非甲基化的模板)檢測結(jié)腸癌樣本的結(jié)果， 由于結(jié)腸癌樣本中DNA甲基化程度較高，因此CG探針測定Cq值較低而TG探針測定Cq值較高。C所示為采用CG探針(特異性檢測甲基化的模板)檢測正常結(jié)腸樣本的結(jié)果，D所示為采用TG探針(特異性檢測非甲基化的模板)檢測正常樣本的結(jié)果，正常結(jié)腸樣本DNA 甲基化程度很低，因此CG探針測定Cq值較高而TG探針測定Cq值較低。按照前述的甲基化程度分值(MS)公式計算，結(jié)腸癌組織中MS = 88. 89，正常結(jié)腸組織中MS = 1. 11?？梢?， 兩種探針測定的Cq值比較明顯地反映出樣本甲基化程度的不同。參考文獻[1]Dahl C, Guldberg P. DNA methylation analysis techniques [J]· Biogerontology,2003,4(4) :233-250.[2]董玉瑋，侯進慧，朱必才等.表觀遺傳學(xué)的相關(guān)概念和研究進展[J].生命的化學(xué)，2005，22(1) 1-3.[3]武立鵬，朱衛(wèi)國.DNA甲基化的生物學(xué)應(yīng)用及檢測方法進展[J].中國檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2004，27 (7) :468-474.[4]Riggs A D,Jones P D. 5-methylcytosine,gene regulation and cancer [J]. Adv Cancer Res,1984,40 :1-30.[5]Bird A P.CpG-rich islands and the function of DNA methylation[J]. Nature,1986,321:209-213.[6]Cottrell S E.Molecular diagnostic applications of DNA methylation technology[J], Clin Biochem，2004，Jul,37(7) :595-604.[7]Feinberg A P, Tycko B.The history of cancer epigenetic[J]. Nat Rev Cancer,2004,4(2) :143-153.[8]Eads C A,Danenberg K D,Kawakami K,et al. MethyLight :ahighthroughput assay to measure DNA methylation[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28 :E32.
權(quán)利要求
1.一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法，其特征在于，所述方法包括1)針對待測DNA序列設(shè)計PCR引物，用于擴增待測DNA；2)針對1)中擴增得到的PCR產(chǎn)物中的CpG位點富集區(qū)設(shè)計一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設(shè)計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設(shè)計的TG探針，用于特異地與PCR產(chǎn)物結(jié)合并檢測PCR產(chǎn)物；和3)采用1)設(shè)計的引物和2)設(shè)計的探針進行實時定量PCR，檢測待測DNA的甲基化程度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測DNA先經(jīng)過化學(xué)處理；優(yōu)選地， 所述化學(xué)處理為重亞硫酸鹽處理。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟1)設(shè)計的PCR引物為兼并引物，其中對應(yīng)CpG位點處的堿基設(shè)計為CG/TG ；優(yōu)選地，所述步驟2、中設(shè)計的CG探針和 TG探針長度相同，且二者只在CpG位點存在差異，其中CG探針中所有的對應(yīng)甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為CG，而TG探針中所有的對應(yīng)非甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為TG。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟幻可以通過檢測到的雙探針的Cq值，計算待測DNA中特定位點的甲基化程度，并且所述甲基化程度分值 (MS)通過下式計算MS = 100/[1+2 fcq^cqu']其中CqM和CqU分別為CG探針和TG探針檢測的Cq值。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟幻中設(shè)計的 TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端，所述熒光標記物優(yōu)選選自FAM和HEX ；優(yōu)選地， 所述步驟幻中設(shè)計的TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連，所述淬滅基團優(yōu)選選自 BHQl。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中的實時定量 PCR 為 TaqMan 法。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述待測DNA可以來源于任何生物樣品；優(yōu)選地，所述待測DNA選自細胞、組織(包括蠟塊組織)、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便及其他分泌物。
8.一種用于定量檢測DNA特定甲基化程度位點的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)針對待測DNA序列設(shè)計的PCR引物，用于擴增待測DNA;和2)針對1)中擴增得到的 PCR產(chǎn)物中的CpG位點富集區(qū)設(shè)計的一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設(shè)計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設(shè)計的TG探針，用于特異地與PCR產(chǎn)物結(jié)合并檢測PCR產(chǎn)物；優(yōu)選地，所述試劑盒還包括重亞硫酸鹽，用于對待測DNA預(yù)先進行化學(xué)處理。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括的PCR引物為兼并引物，其中對應(yīng)CpG位點處的堿基設(shè)計為CG/TG。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括的TaqMan探針中，CG探針和TG探針長度相同，且二者只在CpG位點存在差異，其中CG探針中所有的對應(yīng)甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為CG，而TG探針中所有的對應(yīng)非甲基化CpG位點處的堿基都設(shè)計為TG ；優(yōu)選地，所述TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端，所述熒光標記物優(yōu)選選自FAM和HEX;和/或優(yōu)選地，所述TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連，所述淬滅基團優(yōu)選選自BHQl。
全文摘要
本發(fā)明提供一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法及試劑盒。本發(fā)明提供的方法，包括1)針對待測DNA序列設(shè)計PCR引物，用于擴增待測DNA；2)針對1)中擴增得到的PCR產(chǎn)物中的CpG位點富集區(qū)設(shè)計一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設(shè)計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設(shè)計的TG探針，用于特異地與PCR產(chǎn)物結(jié)合并檢測PCR產(chǎn)物；和3)采用1)設(shè)計的引物和2)設(shè)計的探針進行實時定量PCR，檢測待測DNA的甲基化程度。本發(fā)明的方法可以針對特定甲基化位點進行檢測，而其他位點的甲基化狀態(tài)并不影響檢測結(jié)果。由此制成的試劑盒，可以用于檢測DNA特定位點甲基化程度。
文檔編號C12Q1/68GK102321745SQ201110224449
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者夏東元 申請人:博爾誠(北京)科技有限公司