專利名稱：一種促進動物生長的新型shRNA及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新型shRNA的構(gòu)建。具體而言，本發(fā)明針對綿羊肌肉生長抑制素基因MSTN的核苷酸序列設(shè)計合成shRNA單鏈寡核苷酸，構(gòu)建了 shRNA慢病毒干擾載體，得到了具有良好應(yīng)用前景的新型shRNA。
背景技術(shù)：
肌肉是動物胴體的重要組成部分，是畜牧生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟性狀之一。為此，科學(xué)界在對增加肌肉量、提高肌肉品質(zhì)等方面的探索從未停止過。首先被用來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的是生長激素(GH)基因，其次還有生長激素調(diào)節(jié)軸上的相關(guān)基因，比如生長激素釋放因子 (GRF)基因和類胰島素生長因子(IGF-I)基因等?？傮w上說，這類激素基因能夠刺激動物生長，增加瘦肉量和提高飼料轉(zhuǎn)化率，但會引起各種副作用，也沒有產(chǎn)生理想的表型性狀。1997 年美國霍普金斯大學(xué)的 Mcpherron 等[McPherron，Α. C.，Lawler, Α. Μ. &Lee, S. J. Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF—beta superfamily member. Nature 1997 ；387，83-90]利用簡并引物在小鼠身上偶然發(fā)現(xiàn)了 myostatin基因， 經(jīng)蛋白質(zhì)同源分析和核酸序列比對，證明其屬于TGF-β (transforming growthfactor β ) 超家族成員，故又稱⑶F-8 (growth differentiation factor 8)。該家族成員在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和維持組織穩(wěn)態(tài)及調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育方面均發(fā)揮著重要的作用，另外通過對非雙肌牛myostatin基因的分析表明，該基因的突變是造成雙肌現(xiàn)象的重要的原因之一。2001 年，由Michel Georges領(lǐng)導(dǎo)的研究小組，歷經(jīng)十余年的研究發(fā)現(xiàn)比利時藍牛(Belginm Blue)的雙肌性狀是由于肌肉生長抑制素基因突變造成的[Hughes SM. Running without regulators. Nature, 1992，360 :536-537.]。與此同時，由美國農(nóng)業(yè)部的 Tim Smith 領(lǐng)導(dǎo)的研究小組和由霍普金斯大學(xué)Wkjin Lee領(lǐng)導(dǎo)的研究小組也發(fā)現(xiàn)比利時藍牛及皮爾蒙特牛 (Piedmontese)的雙肌性狀是肌肉生長抑制素基因突變造成的[Jeanplong F，Sharma Μ, Somers W G, et a. 1 Genomic organization and neonatal expression of the bovine myostatin gene. Molecular and Cellular Biochemistry, 2001, 200 :31-37.]。通過基因敲除，反義核酸及體內(nèi)表達肌肉生長抑制素基因拮抗因子的實驗，證明肌肉生長抑制素基因是限制肌肉超常發(fā)育的負調(diào)控基因。MSTN的活性降低或喪失，使得肌肉與其他組織的比例大大提高，因此在畜牧生產(chǎn)上有良好的應(yīng)用前景。這在脂肪比例較大的家畜中應(yīng)用潛力很大。1998年Fire等發(fā)現(xiàn)雙鏈短RNA(dsRNA)序列與靶基因外顯子互補時，基因的表達受到抑制，而與啟動子和內(nèi)含子互補時不能引起基因沉默，于是將這種由dsRNA基因沉默現(xiàn)象稱為RNAi。RNAi的作用多是在轉(zhuǎn)錄后的水平實現(xiàn)其基因“剔除”效應(yīng)的。具體的過程可以分為三個階段①起始階段外源性的dsRNA進入細胞后在Dicer酶的作用下被剪切成21-23nt且?guī)в?’端單鏈尾巴及磷酸化5’端的siRNA。②效應(yīng)階段siRNA解鏈成單鏈與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RNA induced silencing complex，RISC)，活化的RISC在siRNA引導(dǎo)下通過堿基互補配對與靶mRNA結(jié)合，接著內(nèi)切核酸酶將mRNA切割成21-23nt的片段，特異性的抑制靶基因的表達。③擴增階段在RNA依賴的RNA聚合酶 (RNA-dependent RNA polymerase, RdRPs)的作用下，以 siRNA 為引物，mRNA 為模版，合成更多的dsRNA，進一步放大這種特定的降解靶mRNA的作用，使基因表達持續(xù)受到抑制。siRNA 還可以在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下大量擴增并轉(zhuǎn)運出細胞，使RNAi擴散到整個機體并傳代。RNAi 是 21-23 個核苷酸的小分子干擾 RNA(small interfering RNA, siRNA)誘導(dǎo)細胞同源基因mRNA降解、從而特異性抑制基因表達的過程。其作為一項可以高效、特異地降解靶基因mRNA的實驗技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于基因功能的研究[Arziman Z,Horn Τ,Boutros Μ· E-RNAi a web application to design optimized RNAi constructs. Nucleic Acids Res 2005 ；33 :W582-ff588]。shRNA 即小發(fā)卡或短發(fā)卡 RNA(a small hairpin RNA or short hairpin RNA, shRNA)是一段具有緊密發(fā)卡環(huán)(tight hairpin turn)的RNA序列，常被用于RNA干擾沉默靶基因的表達。利用載體把shRNA導(dǎo)入細胞，載體中的U6啟動子確保shRNA總是表達，這種裝載了 shRNA載體可被傳遞到子代細胞中去，從而使基因的沉默可被遺傳。shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細胞機制切割成siRNA，然后siRNA結(jié)合到RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上(RNA-induced silencing complex, RISC)，該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNAs并將其降解。慢病毒(Leniivirus)載體是以HIV-I(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。它的轉(zhuǎn)染效率高，可使目的基因持續(xù)、穩(wěn)定地表達，被較早的應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因動物的制備技術(shù)中。Michael等[Michael J，F(xiàn)iona Μ, Simon G，et al.Efficient production of germline transgenic chickens using lentiviral vectors. EMBO reports, 2004 ；5 :728-733]將報告基因LacZ及GFP同時構(gòu)建到慢病毒載體 Pony-GFP-Lacz，并注射到新生雞蛋的囊胚腔中，在子一代、子二代各組織中均檢測到目的基因的表達。慢病毒載體也可與精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(SMGT)技術(shù)相結(jié)合，將攜帶外源基因的重組載體注射曲細精管感染動物的精原干細胞，使外源DNA整合到動物精原干細胞上，通過自然受精產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物。慢病毒載體通過結(jié)合RNA干擾(RNAi)等有效的技術(shù)手段對許多遺傳性疾病及腫瘤的基因治療都已取得了很大的進步。為促進動物生長、提高瘦肉率和高瘦肉率的優(yōu)良性狀得到穩(wěn)定遺傳，本發(fā)明構(gòu)建了針對綿羊MSTN基因的shRNA慢病毒載體，利用shRNA慢病毒載體制備相應(yīng)的慢病毒，并轉(zhuǎn)入綿羊的基因組，獲得了 MSTN低表達的轉(zhuǎn)基因綿羊，為培育高瘦肉率的綿羊新品種奠定了基石出。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中綿羊MSTN基因的mRNA序列，設(shè)計了 4條針對 MSTN 基因的 shRNA oligo，其序列為 kqunence NO. 1、Sequnence NO. 2、Sequnence NO. 3、 Sequnence NO. 4另外還設(shè)計了陰性對照。并將干擾效果最好的包含kqimence NO. 3的干擾序列克隆到慢病毒干擾載體上，得到慢病毒干擾載體LV-shRNA-86C。本發(fā)明將設(shè)計的4條MSTN基因的shRNA，克隆到shRNA干擾載體pENTR/TO上，得到 4 個干擾質(zhì)粒分別為pENTR/U6-86-A，pENTR/U6_86_B，pENTR/U6_86_C，pENTR/U6_86_D。 其中 PENTR/U6-86-A包含序列％9111^此6 NO. l，pENTR/U6_86_B 包含序列 kqunence NO. 2,
4PENTR/U6-86-C 包含序列 kqunence NO. 3，pENTR/U6_86_D 包含序列 kqunence NO. 4。本發(fā)明全合成了 MSTN基因并構(gòu)建了所述基因的高表達載體PCDNA3. I-MSTN0本發(fā)明將上述的4個MSTN基因的shRNA干擾質(zhì)粒與MSTN高表達載體共轉(zhuǎn)染 HEK293細胞。48小時收集樣品，通過qPCR的方法檢測干擾載體對靶基因的干擾效果。結(jié)果顯示上述構(gòu)建的pENTR/TO-86-C干擾質(zhì)粒的干擾效果最好，其對MSTN基因的沉默效率達 60. 13%。本發(fā)明將干擾效果最好的pENTR/TO-86-C干擾質(zhì)粒，用feg I酶切，純化酶切產(chǎn)物，再經(jīng)BP重組和LR重組得到包含kqunence NO. 3的慢病毒干擾載體LV_shRNA_86C。本發(fā)明將上述慢病毒干擾載體LV-shRNA_86C轉(zhuǎn)染HEK293細胞，制備病毒原液并且滴定所得病毒的滴度。包裝所得的攜帶MSTN-shRNA的慢病毒滴度達8. 8X 109TU/ml。將所述shRNA慢病毒干擾表達載體LV-shRNA_86C與脂質(zhì)體和臺酚藍混合，制備成轉(zhuǎn)染液。然后采用微創(chuàng)手術(shù)，將上述轉(zhuǎn)染液分多點注射入綿羊兩側(cè)的睪丸中。采集處理后公羊的精液，對母羊進行人工授精，得到MSTN基因低表達的轉(zhuǎn)基因綿羊。


圖1內(nèi)參基因擴增曲線。共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和高表達MSTN基因質(zhì)粒的HEK293細胞其內(nèi)參基因的擴增情況。圖2內(nèi)參基因溶解曲線。共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和高表達MSTN基因質(zhì)粒的HEK293細胞其內(nèi)參基因的檢測引物的溶解曲線。圖3MSTN基因擴增曲線。共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和高表達MSTN基因質(zhì)粒的HEK293細胞其MSTN基因的擴增情況，包含所有的樣品轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒、對照質(zhì)粒和空白對照。圖4MSTN基因溶解曲線。共轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒和高表達MSTN基因質(zhì)粒的HEK293細胞其MSTN基因檢測引物的溶解曲線，其只有一個峰，證明該對引物擴增特異性很好。圖5各shRNA干擾質(zhì)粒對MSTN基因的沉默效率。NC 陰性對照shRNA干擾載體與MSTN高表達載體共轉(zhuǎn)染HEK293細胞，干擾載體對MSTN基因的沉默效率。A、B、C、D組的 shRNA 干擾載體依次為 pENTR/U6-86-A，pENTR/U6_86_B，pENTR/U6_86_C，pENTR/U6_86_D， 其它條件與陰性對照組相同。圖6慢病毒干擾質(zhì)粒病毒包裝后24h細胞情況(A 熒光視野；B 可見光視野)。圖7病毒濃縮液稀釋IO3轉(zhuǎn)染HEK293細胞，96小時后HEK293細胞熒光表達情況 (熒光視野)。圖8病毒濃縮液稀釋IO4轉(zhuǎn)染HEK293細胞，96小時后HEK293細胞熒光表達情況 (熒光視野)。圖9病毒濃縮液稀釋IO5轉(zhuǎn)染HEK293細胞，96小時后HEK293細胞熒光表達情況 (熒光視野)。圖10病毒濃縮液稀釋IO6轉(zhuǎn)染HEK293細胞，96小時后HEK293細胞熒光表達情況 (熒光視野)。圖11病毒濃縮液稀釋IO7轉(zhuǎn)染HEK293細胞，96小時后HEK293細胞熒光表達情況 (熒光視野)。實施例1慢病毒干擾載體的構(gòu)建
一材料和方法1、材料DH5alpha 感受態(tài)細胞購于 TaKaRa 公司；pD0NR221、pLenti6. 3/V5-DEST、包裝質(zhì)粒、pCDNA3. 1(+)載體，購于 hvitrogen 公司。HEK293 細胞、293FT 細胞，購于北京協(xié)和醫(yī)院；DMEM、0. 05% ^Trypsin，購于 Gibco 公司；胎牛血清購于hyclone公司；OptiMEM培養(yǎng)液購于hvitrogen公司。T4DNA ligase (1U/μ 1)購于 Invitrogen 公司；EcoR I、Xho I、Ligase、EagI，購于 NEB 公司；Iipofectamine 2000、Trizol、LR clonase II,購于 Invitrogen 公司。2、方法2.1、構(gòu)建 shRNA檢索 GenBank 數(shù)據(jù)庫(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/nucleotide)獲取 sheep myostatin基因的cDNA序列，根據(jù)ambion的shRNA設(shè)計系統(tǒng)，針對靶基因設(shè)計并合成4條 shRNA oligo,其序列為 Sequnence N0. 1、Sequnence NO. 2、Sequnence NO. 3、Sequnence NO. 4，設(shè)計的基因序列由ambion公司完成。2. 2、MSTN基因全合成及高表達載體構(gòu)建1)序列QC 對所需合成的全序列進行分析，檢查基因內(nèi)部有無特別復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列；2)根據(jù)基因序列分析的結(jié)果，進行單鏈oligo的設(shè)計及合成；3)利用PCR將合成的oligo拼接成完整的基因；4)將合成好的序列裝入pMD-18T載體并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞DH5a ；5)測序驗證重組克隆中基因序列是否與要求相符；6)將測序正確的全長片段和載體ρ⑶NA3. 1 (+)用BioI和EcoRI酶切，酶切后瓊脂糖電泳回收MSTN基因和目的載體pCDNA3. 1⑴，將上述兩片段連接并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞 DH5 α 中；7)挑單克隆于2YT培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒測序驗證重組克隆中目的基因片段的序列信息。2. 3、干擾載體的篩選1)干擾質(zhì)粒和MSTN基因高表達載體的制備a)接種干擾質(zhì)粒和高表達載體菌液至5ml LB培養(yǎng)液中，37度搖床Q20rpm)過夜；b)用HQ高純度質(zhì)粒抽提試劑盒制備提取干擾質(zhì)粒和MSTN基因高表達載體。2)干擾載體和MSTN基因高表達載體瞬時共轉(zhuǎn)染靶細胞a)將狀態(tài)良好，處于對數(shù)生長期的細胞用0. 25%胰酶消化，用完全培養(yǎng)基懸浮成單細胞懸液，細胞計數(shù)后，按照每孔5 X 105個細胞接種于六孔板的每個孔中；b)培養(yǎng)過夜，觀察細胞生長狀態(tài)。在細胞覆蓋率80%左右時，進行轉(zhuǎn)染實驗；c)用無血清Opti-MEM輕洗細胞兩次，加入1. 5ml Opti-MEM ；d)分別用 250 μ 1 Opti-MEM 稀釋 3ug 干擾質(zhì)粒 MR085-1、MR085-2、MR085-3、 MR085-4以及陰性對照質(zhì)粒shRNA013，輕輕混勻，加入Iug的高表達載體pcDNA3. I-Ovis aries MSTN ；
e)用 250 μ 1 Opti-MEM 稀釋 10 μ 1 lipofectamine 2000 試劑，輕輕混勻，室溫孵育 5min ；f)輕輕混合已稀釋質(zhì)粒和lipofectamine 2000稀釋液，室溫放置20分鐘；g)將每管500 μ 1脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物慢慢加入到各細胞孔中，輕輕混勻；在 37°C，5%的C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 6小時后，換上完全培養(yǎng)液(不含抗生素)，放置在 37°C，5%的C02的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)過夜；h)第二天觀察是否有熒光表達。3)通過qPCR方法檢測干擾載體對靶基因的干擾效果A.細胞樣品總RNA的提取a) 1. 1時轉(zhuǎn)染48小時后，輕輕吸凈培養(yǎng)液，用PBS輕洗兩遍，每孔細胞樣品中各加入Iml Trizol液，用槍頭吹吸混勻，盡量讓細胞全部裂解，室溫放置5分鐘；.b) 1. 2中各加入0. 2ml氯仿，蓋緊離心管，反復(fù)顛倒混勻15秒，12000g, 4°C離心10 分鐘；c)l. 3上層水相于一新的離心管中，每管中各加0. 5ml異丙醇，輕輕混勻，室溫放置10分鐘，12000g，4°C離心10分鐘；d) 1. 4去上清液，每管中加入Iml的75%的酒精輕輕洗滌沉淀，12000g，4°C離心10 分鐘；e) 1. 5心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5_10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，55°C _60°C水溶10分鐘。B.反轉(zhuǎn)錄 cDNAa)滅菌的無RNA酶的印pendorf管，每個樣本加入如下組分得到Mixl
組分體積來源
權(quán)利要求
1.一種促進動物生長的新型ShRNA干擾載體LV-shRNA-86C，其特征在于，所述載體包含基因序列Sequnence NO. 3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進動物生長的新型shRNA干擾載體，其特征在于，所述載體可以制備包含基因序列kqimence NO. 3的慢病毒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進動物生長的新型shRNA干擾載體，其特征在于，所述載體可以降低綿羊組織細胞MSTN基因mRNA的水平。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進動物生長的新型shRNA干擾載體，其特征在于，所述載體可以應(yīng)用于培養(yǎng)生長快、瘦肉率高的綿羊新品種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種促進動物生長的新型shRNA慢病毒干擾載體LV-shRNA-86C，其基因序列包含序列Sequnence NO.3。本發(fā)明針對綿羊MSTN基因的核苷酸序列設(shè)計合成多條shRNA單鏈寡核苷酸，構(gòu)建了shRNA表達載體，通過功能性篩選實驗，得到了抑制效果較強的pENTR/U6-86-C，包含基因序列Sequnence NO.3，進一步將基因序列Sequnence NO.3構(gòu)建到shRNA慢病毒干擾載體。本發(fā)明還公開了上述新型shRNA的應(yīng)用。
文檔編號C12N7/01GK102321669SQ20111022499
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月8日
發(fā)明者苗向陽 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所