專利名稱：利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及工業(yè)化生產(chǎn)花生四烯酸的方法，具體涉及在特定的工藝條件下，利用高山被孢霉擴(kuò)配生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(Arachidonic Acid,簡稱ARA)是n_6系列多不飽和脂肪酸,它作為合成人體前列腺素、凝血嗯烷以及白三烯的前體物質(zhì)，具有廣泛的生物活性。花生四烯酸還具有重要的營養(yǎng)作用，作為人母乳的天然成分，對嬰兒的神經(jīng)及生理的發(fā)育必不可少，已經(jīng)被多個專家組織包括世界衛(wèi)生組織推薦作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加到嬰兒配方奶粉中?；ㄉ南┧嶂饕獊碓从趧游锔闻K、魚油、牛腎上腺等，但動物組織中花生四烯酸的質(zhì)量百分濃度很低，僅為O. 2%，且來源非常有限。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸作為一種生產(chǎn)花生四烯酸的新途徑，具有不受原材料和氣候限制、生產(chǎn)周期短、工藝簡單、成本較低、產(chǎn)物含量高、分離提取容易等優(yōu)點(diǎn)，引起了國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注。
YASUHISA等研究發(fā)現(xiàn)C/N比會影響菌絲的形態(tài)，當(dāng)C/N比小于20時，菌絲球的大小和寬度不變；C/N比大于20時，菌絲球的大小和寬度會隨著C/N比的增加而變大；C/N比在15 20時,花生四烯酸的產(chǎn)量最高。Higashiyama等研究了無機(jī)鹽對高山被孢霉菌絲形態(tài)和ARA產(chǎn)量的影響，結(jié)果顯示在含有大豆粉和葡萄糖的培養(yǎng)基中，加入KH2PO4, Na2SO4, CaCl2和MgCl2的情況下，經(jīng)優(yōu)化，ARA產(chǎn)量可達(dá)到9. 8g/L。由于花生四烯酸存在于菌體脂質(zhì)中，增加菌體中類脂成分是增加花生四烯酸產(chǎn)量的首要條件。A. Singh等研究發(fā)現(xiàn)添加黃豆粉和植物油可以顯著提高M(jìn). Alpina ATCC 3222發(fā)酵的菌體重量、油脂含量和花生四烯酸產(chǎn)量，ARA產(chǎn)量最高可達(dá)11. lg/L。周蓬蓬等發(fā)現(xiàn)毛霉菌油對高山被孢霉的生長和油脂產(chǎn)量基本沒有影響，但是能提高ARA在油脂中的含量，因而可以提高ARA產(chǎn)量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸的工業(yè)方法，該方法通過特定的工藝控制可使花生四烯酸的單位產(chǎn)量達(dá)到IOg ARA/L發(fā)酵液。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為
利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，它包括以下步驟
(I)原始菌株的活化將高山被孢霉菌株斜面培養(yǎng)，獲得高山被孢霉的孢子懸液；
(2)種子培養(yǎng)將高山被孢霉的孢子懸液接種于搖瓶培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；
(3)種子擴(kuò)大培養(yǎng)根據(jù)最終發(fā)酵罐的大小，將步驟(2)的種子培養(yǎng)液逐級擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得種子擴(kuò)大培養(yǎng)液；
(4)發(fā)酵培養(yǎng)，包括初始發(fā)酵階段和后發(fā)酵階段
初始發(fā)酵階段
將步驟(3)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的主要原料組分按質(zhì)量百分比計為葡萄糖4 6%、酵母粉I 3%、市政自來水，pH值5 7， 在該初始發(fā)酵過程中通過流加葡萄糖控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，并在發(fā)酵初始的16h 內(nèi)根據(jù)泡沫產(chǎn)生情況加入食用油，食用油的加入量按體積百分?jǐn)?shù)計為發(fā)酵液體積的O. I O. 3% ；
當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到40% (體積比)，干菌體總油達(dá)到40被％時，初始發(fā)酵過程結(jié)束，進(jìn)入后發(fā)酵階段；
后發(fā)酵階段
將上述發(fā)酵液降溫至25±2°C，同時加入無菌氨水，調(diào)節(jié)pH值為8 9，靜置發(fā)酵， 在發(fā)酵過程中通過流加葡萄糖控制葡萄糖含量在I. O I. 5wt %，并在花生四烯酸含量高于40wt%后停止補(bǔ)加葡萄糖；當(dāng)發(fā)酵液中花生四烯酸的含量高于45被％時，后發(fā)酵階段結(jié)束；
(5)將發(fā)酵液經(jīng)發(fā)酵后處理得到含有花生四烯酸的油脂。
按上述方案，所述的步驟(I)為將高山被孢霉菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在 28± 1°C下培養(yǎng)8 10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的PDA培養(yǎng)基平板，取下培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，用無菌水配制成孢子懸液。
按上述方案，所述的步驟(2)為將孢子懸液接種于搖瓶培養(yǎng)基中，在28土1°C下振搖培養(yǎng)48h，搖床振搖轉(zhuǎn)速為200±20轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖4 6%、蛋白胨I 2%、酵母浸膏2 4%、基質(zhì)蒸餾水，pH值為7±0. 2。
按上述方案，所述步驟(3)的種子培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖 5 10 %、酵母粉I 3 %、食用油O. I O. 3 %、市政自來水，自然pH值，并在菌濃達(dá)到20 % (體積比)時進(jìn)行下一步擴(kuò)大培養(yǎng)。
按上述方案，所述步驟(3)中的每級培養(yǎng)時間為24 32h，培養(yǎng)溫度為30±2°C， 空氣流量為O. 8 I. OmVm3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力在O. 15 O. 2MPa ;所述攪拌培養(yǎng)的攪拌速度優(yōu)選為50 70轉(zhuǎn)/min。
按上述方案，所述步驟(4)中的初始發(fā)酵溫度控制為30±2°C、pH值自然變化、空氣流量為O. 8 I. OmVm3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力在O. 2 O. 3MPa。
按上述方案，所述步驟(4)中流加的葡萄糖為10 30wt%的無菌葡萄糖溶液。
按上述方案，所述步驟(4)中初始發(fā)酵階段的攪拌速度為50 70轉(zhuǎn)/min。
按上述方案，所述步驟(4)中后發(fā)酵階段的空氣流量為I. O I. 5m3/m3發(fā)酵液/ min，罐內(nèi)壓力在O. 2 O. 3MPa。
按上述方案，所述的步驟(5)為將發(fā)酵液依次經(jīng)滅活、菌液分離、干燥、微生物油脂提取處理。
本發(fā)明的有益效果
(I)本發(fā)明方法僅使用酵母粉和葡萄糖作為主發(fā)酵原料，簡化了發(fā)酵配方，可以對發(fā)酵原材料進(jìn)行有效的控制；
(2)通過調(diào)控工藝，能提高發(fā)酵產(chǎn)能，使每升發(fā)酵液的ARA產(chǎn)量達(dá)到10g/L。具體調(diào)控的工藝步驟有將發(fā)酵步驟分為初始發(fā)酵階段和后發(fā)酵階段，并針對不同的階段采用不同的控制工藝，在種子擴(kuò)大培養(yǎng)和初始發(fā)酵階段采用攪拌培養(yǎng)，利于霉菌細(xì)胞前期細(xì)胞數(shù)的積累，同時在初始發(fā)酵階段添加植物油，一方面可用于發(fā)酵前期生物泡沫的控制，另一方面也可作為微生物油脂的合成前體和碳源的供應(yīng)；在后發(fā)酵階段停止攪拌，靜置發(fā)酵，有利于霉菌油脂及ARA含量的積累；后發(fā)酵階段使用的氨水即是pH調(diào)節(jié)劑，也是氮源補(bǔ)充劑； 在發(fā)酵過程中通過控制發(fā)酵液中葡萄糖的含量可促進(jìn)油脂的積累及花生四烯酸轉(zhuǎn)化的能力；采用高罐壓進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，有利于提高溶氧水平，從而提高發(fā)酵水平；
(3)工藝簡便，易于控制，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
實施例I :
I原始菌株的活化將使用安倍管保存的高山被孢霉菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28 ± I °C下培養(yǎng)8天，選取菌絲和孢子生長旺盛的PDA培養(yǎng)基平板，取下培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，用無菌水制成孢子懸液；
2種子培養(yǎng)將孢子懸液接種于搖瓶培養(yǎng)基中，在28± 1°C下振搖培養(yǎng)48h,搖床振搖轉(zhuǎn)速為200±20轉(zhuǎn)/分鐘，液體培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖4%、蛋白胨I %、酵母浸膏3%、基質(zhì)蒸餾水，pH值為7. 2 ；
3種子擴(kuò)大培養(yǎng)最終發(fā)酵罐體積為50m3，因此選取種子罐分別為10m3、Im3Jf 1.5L步驟(2)的搖瓶種子發(fā)酵液接種到Im3的種子擴(kuò)大發(fā)酵罐中，種子培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比分別為葡萄糖6%、酵母粉I. 3%、食用油O. 15%、市政自來水，自然 pH值，空氣量根據(jù)需要控制在O. 8 I. 0m3/m3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力控制在O. 17MPa，在 30±2°C培養(yǎng)24h，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的菌濃為25% (體積比)，將該種子發(fā)酵液接種入IOm3 的種子擴(kuò)大發(fā)酵罐進(jìn)行第二次擴(kuò)大培養(yǎng)，該種子擴(kuò)大發(fā)酵罐中種子培養(yǎng)基主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖5 %、酵母粉2 %、食用油O. 2 %、市政自來水，自然pH值，空氣量根據(jù)需要控制在O. 8 I. OmVm3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力控制在O. 19MPa，攪拌速度控制為55轉(zhuǎn) /min，發(fā)酵培養(yǎng)28h后，發(fā)酵罐中發(fā)酵液的菌濃為30% ；
(4)將步驟(3)的第二次種子擴(kuò)大培養(yǎng)液接種到50m3的發(fā)酵罐中進(jìn)行初始發(fā)酵， 該發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)基的主要原料組分按質(zhì)量百分比計為葡萄糖4. 6%、酵母粉I. 5%、市政自來水，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值為6. 23，配料體積25m3 ;發(fā)酵溫度控制在30±2°C、pH 值自然變化、空氣量需要控制在O. 8 I. OmVm3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力在O. 25MPa，攪拌速度60轉(zhuǎn)/min，在該初始發(fā)酵過程中控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，當(dāng)發(fā)酵液中葡萄糖含量低于3wt%，開始流加濃度在10 30wt%的無菌葡萄糖溶液至葡萄糖含量達(dá)到3. 5wt% 時終止；并在發(fā)酵初始的16h內(nèi)根據(jù)泡沫產(chǎn)生情況加入食用油，食用油加入量按體積百分?jǐn)?shù)計為發(fā)酵液體積的O. I O. 3wt% ；
初始發(fā)酵工藝控制見下表I :
表I
權(quán)利要求
1.利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，它包括以下步驟(1)原始菌株的活化將高山被孢霉菌株斜面培養(yǎng)，獲得高山被孢霉的孢子懸液；(2)種子培養(yǎng)將高山被孢霉的孢子懸液接種于搖瓶培養(yǎng)基中振搖培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液；(3)種子擴(kuò)大培養(yǎng)根據(jù)最終發(fā)酵罐的大小，將步驟(2)的種子培養(yǎng)液逐級擴(kuò)大培養(yǎng)， 獲得種子擴(kuò)大培養(yǎng)液；(4)發(fā)酵培養(yǎng)，包括初始發(fā)酵階段和后發(fā)酵階段初始發(fā)酵階段將步驟(3)的種子擴(kuò)大培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的主要組成成分按質(zhì)量百分比計為葡萄糖4飛％、酵母粉廣3%、市政自來水，pH值5 7，在該初始發(fā)酵過程中通過流加葡萄糖控制葡萄糖含量在3 3. 5wt%，并在發(fā)酵初始的16h內(nèi)根據(jù)泡沫產(chǎn)生情況加入食用油，食用油的加入量按體積百分?jǐn)?shù)計為發(fā)酵液體積的O. Γ0. 3% ；當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到40% (體積比),干菌體總油達(dá)到40wt%時,初始發(fā)酵過程結(jié)束,進(jìn)入后發(fā)酵階段；后發(fā)酵階段將上述發(fā)酵液降溫至25±2°C，同時加入無菌氨水，調(diào)節(jié)pH值為8 9，靜置發(fā)酵，在發(fā)酵過程中通過流加葡萄糖控制葡萄糖含量在I. (Tl. 5wt%,并在花生四烯酸含量高于40wt%后停止補(bǔ)加葡萄糖；當(dāng)發(fā)酵液中花生四烯酸的含量高于45wt%時，后發(fā)酵階段結(jié)束；(5)將發(fā)酵液經(jīng)發(fā)酵后處理得到含有花生四烯酸的油脂。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述的步驟(I)為將高山被孢霉菌株接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，在28 土 1°C下培養(yǎng) 8^10天，選取菌絲和孢子生長旺盛的PDA培養(yǎng)基平板，取下培養(yǎng)基上的菌絲和孢子，用無菌水配制成孢子懸液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述的步驟(2)為將孢子懸液接種于搖瓶培養(yǎng)基中，在28土1°C下振搖培養(yǎng)48h，搖床振搖轉(zhuǎn)速為200±20轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖4飛％、蛋白胨廣2%、酵母浸膏2 4%、基質(zhì)蒸餾水，pH值為7 ± O. 2。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(3)的種子培養(yǎng)基中主要原料組分的質(zhì)量百分比為葡萄糖5 10%、酵母粉廣3%、食用油O. Γ0. 3%、市政自來水，自然pH值，并在菌濃達(dá)到20% (體積比)時進(jìn)行下一步擴(kuò)大培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(3)中的每級培養(yǎng)時間為24 32h，培養(yǎng)溫度為30±2°C，空氣流量為O. 8^1.0 m3/ m3發(fā)酵液/min,罐內(nèi)壓力在O. 15 O. 2MPa。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中的初始發(fā)酵溫度控制為30±2°C、pH值自然變化、空氣流量為O.8 I. OmVm3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力在O. 2 O. 3MPa。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中流加的葡萄糖為l(T30wt%的無菌葡萄糖溶液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中初始發(fā)酵階段的攪拌速度為5(Γ70轉(zhuǎn)/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中后發(fā)酵階段的空氣流量為I. (Tl. 5m3/m3發(fā)酵液/min，罐內(nèi)壓力在 O. 2 O. 3MPa。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工業(yè)方法，其特征在于，所述的步驟(5)為將發(fā)酵液依次經(jīng)滅活、菌液分離、干燥、微生物油脂提取處理。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種利用高山被孢霉生產(chǎn)花生四烯酸的工業(yè)方法。其特征在于，它包括以下步驟原始菌株的活化；種子培養(yǎng)；種子擴(kuò)大培養(yǎng)；發(fā)酵培養(yǎng)，包括初始發(fā)酵階段將種子擴(kuò)大培養(yǎng)液接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行攪拌培養(yǎng)，并根據(jù)情況補(bǔ)加葡萄糖和食用油，當(dāng)發(fā)酵液菌濃達(dá)到40%(體積比)，干菌體總油達(dá)到40wt%時，初始發(fā)酵階段結(jié)束，進(jìn)入后發(fā)酵階段將上述發(fā)酵液降溫至25±2℃，同時加入無菌氨水調(diào)節(jié)pH值為8~9，靜置發(fā)酵，同時控制葡萄糖含量；當(dāng)花生四烯酸的含量高于45wt%時，后發(fā)酵階段結(jié)束；將發(fā)酵液經(jīng)發(fā)酵后處理得到含有花生四烯酸的油脂。該方法簡化了發(fā)酵配方，通過特定的工藝控制可使花生四烯酸的單位產(chǎn)量達(dá)到10gARA/L發(fā)酵液；工藝簡便，易于控制，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/645GK102925502SQ20111022815
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者唐孝鵬, 汪志明, 張玉良, 朱子清 申請人:嘉必優(yōu)生物工程(湖北)有限公司