專(zhuān)利名稱(chēng)：條石鯛性別特異分子標(biāo)記及其遺傳性別鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于水產(chǎn)生物技術(shù)領(lǐng)域中的魚(yú)類(lèi)分子標(biāo)記和遺傳性別鑒定技術(shù)，尤其涉及一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記及其遺傳性別鑒定方法。
背景技術(shù)：
我國(guó)有著豐富的魚(yú)類(lèi)資源，其中許多魚(yú)類(lèi)在生長(zhǎng)速率上存在性別差異，如，羅非魚(yú)、鯉魚(yú)、牙鲆、半滑舌鰨等魚(yú)類(lèi)。因此，開(kāi)展這些魚(yú)類(lèi)性別相關(guān)基因及性別特異分子標(biāo)記的研究具有很高的理論指導(dǎo)意義。條石鯛隸屬于鱸形目(Perciformes)、石鯛科 (Oplegnathidae)、石鯛屬(Oplegnathus)，自然分布于太平洋和印度洋沿岸，我國(guó)產(chǎn)于黃海、東海和臺(tái)灣海峽，是一種暖溫性海洋中下層魚(yú)類(lèi)。它生長(zhǎng)速度快、肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、 色澤艷麗，具有較高的食用價(jià)值和觀賞價(jià)值。尤其是近年來(lái)，條石鯛的人工繁育獲得成功， 其養(yǎng)殖也迅速在我國(guó)開(kāi)展起來(lái)。在人工繁育及選擇育種過(guò)程中，為了獲得優(yōu)質(zhì)的苗種必須做好親魚(yú)選擇的雌雄篩選。條石鯛第一次性成熟需要3 4年，在幼苗時(shí)期無(wú)法通過(guò)外觀形態(tài)辨別其性別特征。因此，建立一種性別的快速鑒定方法用于幼苗的性別鑒定，不僅對(duì)于研究條石鯛的性別決定機(jī)制具有很高的理論價(jià)值，而且對(duì)于其定向選擇育種具有重要的指
眉、οAFLP技術(shù)是可以快速篩選性狀相關(guān)分子標(biāo)記的有效方法，應(yīng)用AFLP技術(shù)在某些動(dòng)物的基因組中尋找性別標(biāo)記已有成功報(bào)道。英國(guó)Mirling大學(xué)的肚擬等Q004)用AFLP 技術(shù)掃描尼羅羅非魚(yú)基因組，找到三個(gè)Y染色體連鎖(0niY425、0niY382、0niY227)和一個(gè) X染色體連鎖(0niX420)的AFLP標(biāo)記，其中0niX420和0niY425證明為等位基因，然而這些標(biāo)記卻不能鑒別沒(méi)有親緣關(guān)系的個(gè)體的性別，達(dá)不到鑒定羅非魚(yú)遺傳性別的水平。在虹鱒中，F(xiàn)elip等(2005)利用AFLP技術(shù)篩選到15個(gè)性別相關(guān)標(biāo)記，其中，Omy-163為Y染色體連鎖的標(biāo)記，將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，建立了虹鱒的遺傳性別快速鑒定方法。國(guó)內(nèi)學(xué)者Chen 等Q007)利用AFLP技術(shù)在半滑舌鰨中篩選到7個(gè)雌性特異的標(biāo)記，將其中的5個(gè)轉(zhuǎn)化為 SCAR標(biāo)記，建立快速鑒定其遺傳性別的PCR方法。由于不同魚(yú)類(lèi)之間存在著很大差異，一種魚(yú)類(lèi)的性別特異分子標(biāo)記不能在另一種魚(yú)類(lèi)上應(yīng)用，因此必須建立不同魚(yú)類(lèi)各自的性別特異分子標(biāo)記。有關(guān)條石鯛性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別檢測(cè)技術(shù)，目前國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中不易鑒定條石鯛幼魚(yú)的缺陷，本發(fā)明提供了一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記及其遺傳性別鑒定方法，本發(fā)明篩選出了條石鯛性別特異分子標(biāo)記，并在此特異分子標(biāo)記基礎(chǔ)上建立了遺傳性別鑒定方法，為條石鯛的定向育種提供理論和技術(shù)上的指導(dǎo)。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明提供了 4個(gè)條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記的引物序列如下
(1)5， -GACTGCGTACCAATTCACA-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列擴(kuò)增出特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序如SEQ ID NO=I所示。(2)5' -GACTGCGTACCAATTCAGA-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’，用所述引物序列擴(kuò)增出特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序如SEQ ID NO 2所示。(3)5' -GACTGCGTACCAATTCATC-3'；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT-3’，用所述引物序列擴(kuò)增出特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序如SEQ ID NO 3所示。(4)5， -GACTGCGTACCAATTCATG-3，；5 ’ -GATGAGTCCTGAGTAACTT-3’。用所述引物序列擴(kuò)增出特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序如SEQ ID NO 4所示。本發(fā)明還提供了 SCAR分子標(biāo)記，根據(jù)SEQ ID NO :1序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得，其引物序列為Op 1240-1 :5，AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3，；Op 1240-2 :5，GGAGCATCCCATCCATTCT3，。用所述引物在雄魚(yú)基因組中擴(kuò)增出MObp的DNA條帶，在雌魚(yú)基因組中沒(méi)有擴(kuò)增條帶。本發(fā)明還提供了一種用所述條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，它包括以下步驟(1)采集待測(cè)的條石鯛的基因組DNA ；(2)用所述SCAR標(biāo)記的引物對(duì)條石鯛基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到240bp 的條帶所對(duì)應(yīng)的為雄性個(gè)體，沒(méi)有擴(kuò)增條帶所對(duì)應(yīng)的為雌性個(gè)體。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(1)中采集條石鯛的鰭條提取基因組DNA。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟(1)中所述的基因組DNA的濃度為50 200ng/y L，基因組DNA的純度要求0擬60/0D280值為1. 76 1. 80。對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟O)中的PCR反應(yīng)的體系為DNA模板50 200ng,上下游引物濃度 0. 4 μ M，dNTP 濃度為 0. ImM, 1 X PCRbuffer,MgCl2 濃度為 1. 5mM, Taq 酶1. 25U，補(bǔ)充雙蒸水至終體積25 μ L0對(duì)技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述步驟( 中的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min， 94°C變性30S，56°C退火30s，72°C延伸60s，共；35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是(1)本發(fā)明采用AFLP方法首次篩選到條石鯛性別特異的分子標(biāo)記，并將其轉(zhuǎn)化為 SCAR標(biāo)記，建立條石鯛遺傳性別的鑒定方法，本發(fā)明所述分子標(biāo)記可以無(wú)損傷地鑒別條石鯛的遺傳性別。(2)本發(fā)明所提供的遺傳性別鑒定方法具有準(zhǔn)確、靈敏、可靠等優(yōu)點(diǎn)，不僅對(duì)魚(yú)類(lèi)性別機(jī)制研究具有重要的科學(xué)價(jià)值，而且為魚(yú)類(lèi)性別控制和選擇育種具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1是引物組合E35M50產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl286，其中1 15為雌性個(gè)體， 16 30為雄性個(gè)體。圖2是引物組合E39M62產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl237，其中1 18為雌性個(gè)體， 19 38為雄性個(gè)體。圖3是引物組合E44M58產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl423，其中1 20為雌性個(gè)體， 21 40為雄性個(gè)體。圖4是引物組合E45M62產(chǎn)生的雄性特異條帶0pl2^，其中1 13為雌性個(gè)體， 14 沈?yàn)樾坌詡€(gè)體。圖5是引物0pl240_l和0pl240_2在雌性個(gè)體和雄性個(gè)體基因組中的PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中1-9為雌性個(gè)體，10-18為雄性個(gè)體，M為DL2000marker。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。實(shí)施例1下面本發(fā)明對(duì)條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記的篩選及遺傳性別鑒定方法的建立進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。篩選條石鯛的性別特異分子標(biāo)記并建立遺傳性別快速鑒定方法的技術(shù)方案具體包括條石鯛性別特異分子標(biāo)記的篩選，性別特異分子標(biāo)記的序列分析，條石鯛遺傳性別鑒定方法的建立。以下對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作更進(jìn)一步的闡述?！?、條石鯛性別特異分子標(biāo)記的篩選包括1、提取條石鯛鰭條的基因組DNA，2、基因組DNA的AFLP分析，3、雄性特異分子標(biāo)記的篩選。1、提取條石鯛鰭條的基因組DNA選擇條石鯛成魚(yú)，解剖根據(jù)性腺形態(tài)辨別雌雄，雄魚(yú)的精巢呈細(xì)帶狀、淡紅色，而雌魚(yú)的卵巢呈扁帶狀，肉紅色，很容易進(jìn)行辨別。剪取20 30mg的條石鯛鰭條，并將其剪碎，然后加入350 μ L的組織裂解液，在裂解液中加入10%的十二烷基硫酸鈉(SDQ 40 μ L、 蛋白酶K(20mg/mL)8y L和核酸酶QOmg/mL)4 μ L，放在56°C的水浴鍋中消化，一般需要消化2 池；取出離心管低速離心去除管壁水珠，然后加入300 μ L的6mol/L的NaCl溶液，震蕩混勻，室溫12000r/min離心20 30min，移上清夜至新的離心管中；在上清液中加入等體積的異丙醇(約700μυ，輕輕混勻，置于-20°C中2 3h，室溫12000r/min離心15min， 棄去上清液；加入70%的乙醇于離心管中，混勻漂洗沉淀一次，然后室溫12000r/min離心 lOmin，棄去上清液；室溫下使乙醇揮發(fā)，自然干燥；用適當(dāng)體積(30 50 μ L)的雙蒸水或者TE緩沖液(ρΗ8. 0)溶解DNA，將DNA保存在_20°C備用?；蚪MDNA的濃度應(yīng)不低于 50ng/y L，基因組DNA的純度要求O擬60/0D280值為1. 76 1. 80。2、基因組DNA的AFLP分析
基因組DNA的AFLP分析主要包括如下步驟(1)對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行酶切；(2) 將特異接頭連接到酶切片段上；C3)進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增；(4)進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增；( 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。(1)對(duì)基因組DNA模板進(jìn)行酶切用1. 25U/ μ L EcoRI/Msel 酶混合物 37 °C 過(guò)夜消化 IOOng 400ng 模板 DNA6 8h，再用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切是否充分，然后將充分酶切的DNA溶液于65°C孵育 15min滅火限制性?xún)?nèi)切酶。(2)將特異接頭連接到酶切片段上向上面的酶切反應(yīng)混合液中加入12. 0 μ L接頭混合物和1. 5U T4DNA連接酶，20°C 孵育12 20h保證接頭充分連接，然后放置_20°C中保存。接頭混合物的序列如下Eadaptorl :CTC GTA GAC TGC GTA CC ；Eadaptor2 :AAT TGG TAC GCA GTC TAC ；Madaptorl :GAC GAT GAG TCC TGA G ；Madaptor2 :TAC TCA GGA CTC AT。(3)進(jìn)行PCR預(yù)擴(kuò)增將上述連接產(chǎn)物稀釋10倍，作為PCR預(yù)擴(kuò)增的模板；預(yù)擴(kuò)增引物的3’末端帶有一個(gè)選擇性堿基(A或者C)。PCR反應(yīng)條件為94°C變性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸Imin。 30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸10min，4°C保存待用。預(yù)擴(kuò)增引物的序列如下EcoRIOI 5' -GAC TGC GTA CCA ATT C-3'；MseI02 5' -GAT GAG TCC TGA GTA A-3'。(4)進(jìn)行PCR選擇性擴(kuò)增將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30 50倍，作為選擇性擴(kuò)增的模板。用含酶切位點(diǎn)MseI的引物和含酶切位點(diǎn)EcoRI的引物進(jìn)行擴(kuò)增，這兩種引物3’末端帶有三個(gè)選擇性堿基。PCR反應(yīng)分為三步第一步進(jìn)行1個(gè)循環(huán)94°C變性40s ；65°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第二步進(jìn)行12個(gè)循環(huán)94°C變性40s ；65-56°C退火40s ；72°C延伸Imin ；第三步進(jìn)行25個(gè)循環(huán)94°C 變性40s ；56°C退火40s ；72°C延伸lmin。擴(kuò)增產(chǎn)物加入適量的上樣液，94°C變性5min，立即置于冰上。總共用了 144對(duì)引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)94°C變性后用6% 聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳分離。(5)電泳分析將變性好的擴(kuò)增產(chǎn)物用6%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳；電泳條件電壓1200V， 功率50W，電流50mA，溫度45°C，時(shí)間1.證?？偣灿昧?144對(duì)引物組合對(duì)20個(gè)條石鯛雄性個(gè)體和20個(gè)條石鯛雌性個(gè)體的基因組DNA進(jìn)行了 AFLP分析，然后對(duì)電泳后產(chǎn)生的DNA條帶圖譜進(jìn)行觀察，照相和分析，篩選出特異片段的引物組合4個(gè)，這4個(gè)引物組合共產(chǎn)生了 4條雄性特異的AFLP標(biāo)記。3、雄性特異分子標(biāo)記的篩選總共用144對(duì)引物組合對(duì)20個(gè)條石鯛雌性個(gè)體和20個(gè)條石鯛雄性個(gè)體的基因組 DNA進(jìn)行了 AFLP-PCR擴(kuò)增，這些引物組合的序列如下
權(quán)利要求
1.條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的引物序列如下 5' - GACTGCGTACCAATTCACA -3'；5’- GATGAGTCCTGAGTAACAT-3’，用所述引物序列擴(kuò)增出的特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序?yàn)槿鏢EQ ID NO: 1所示的DNA片段。
2.條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的引物序列如下 5’ -GACTGCGTACCAATTCAGA -3’ ；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列擴(kuò)增出的特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序?yàn)槿鏢EQ ID NO: 2所示的DNA片段。
3.條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATC -3'；5’ -GATGAGTCCTGAGTAACGT -3’，用所述引物序列擴(kuò)增出的特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序?yàn)槿鏢EQ ID NO: 3所示的DNA片段。
4.條石鯛性別特異AFLP分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記的引物序列如下 5' -GACTGCGTACCAATTCATG -3'；5’-GATGAGTCCTGAGTAACTT -3’，用所述引物序列擴(kuò)增出的特異AFLP標(biāo)記經(jīng)克隆測(cè)序?yàn)槿鏢EQ ID N0:4所示的DNA片段。
5.條石鯛性別特異SCAR分子標(biāo)記，其特征在于所述分子標(biāo)記根據(jù)SEQID NO: 1序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得，其引物序列為0pl240-l: 5’ AGACCAAGATCAGGAGCGAAT3’ ； Op1240-2: 5 ’ GGAGCATCCCATCCATTCT3’，用所述引物在雄魚(yú)基因組中擴(kuò)增出240bp的DNA條帶，在雌魚(yú)基因組中沒(méi)有擴(kuò)增條帶。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于它包括以下步驟(1)采集待測(cè)的條石鯛的基因組DNA；(2)用所述SCAR標(biāo)記的引物對(duì)條石鯛基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增得到240bp的條帶所對(duì)應(yīng)的為雄性個(gè)體，沒(méi)有擴(kuò)增條帶所對(duì)應(yīng)的為雌性個(gè)體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(1)中采集條石鯛的鰭條提取基因組DNA。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(1)中所述的基因組DNA的濃度為50 200ng/^L，基因組DNA的純度要求 0D260/0D280 值為 1. 76 1. 80。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟O)中的PCR反應(yīng)的體系為DNA模板50 200ng，上下游引物濃度0. 4μΜ， dNTP濃度為0. ImM, IXPCRbuffer,MgCl2濃度為1.5mM, Taq酶1. 25U，補(bǔ)充雙蒸水至終體積 25μ 。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記的遺傳性別鑒定方法，其特征在于所述步驟(2)中的PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s， 72°C延伸60s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0
全文摘要
本發(fā)明提供了一種條石鯛性別特異分子標(biāo)記及遺傳性別鑒定方法，它包括雄性特異AFLP標(biāo)記的篩選和克隆，性別特異的DNA序列分析，遺傳性別PCR鑒定方法的建立。本發(fā)明從144對(duì)引物組合中篩選到4個(gè)引物組合能夠產(chǎn)生4個(gè)雄性特異AFLP標(biāo)記，將這些AFLP標(biāo)記克隆測(cè)序，篩選到了一個(gè)SCAR分子標(biāo)記，建立了條石鯛遺傳性別鑒定的PCR方法。本發(fā)明采用AFLP方法首次篩選到條石鯛性別特異的分子標(biāo)記，并將其轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記，建立條石鯛遺傳性別的鑒定方法；所述遺傳性別鑒定方法具有準(zhǔn)確、靈敏、可靠等優(yōu)點(diǎn)，不僅對(duì)魚(yú)類(lèi)性別機(jī)制研究具有重要的科學(xué)價(jià)值，而且為魚(yú)類(lèi)性別控制和選擇育種具有重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102286479SQ20111022837
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月10日
發(fā)明者付萬(wàn)東, 史會(huì)來(lái), 徐冬冬, 李三磊, 樓寶, 毛國(guó)民, 耿智 申請(qǐng)人:浙江省海洋水產(chǎn)研究所