專利名稱：一種micb基因分型的pcr-sbt方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及用于人類MHC-I類鏈相關(guān)基因B位點(diǎn)(MHC class Ichain-related gene B, MICB)的擴(kuò)增和分型方法，以及所述方法配套的試劑盒。
背景技術(shù)：
MHC-I 類鏈相關(guān)基因(MHC class I chain-related gene，MIC)，位于人 6 號染色體主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex, MHC)基因區(qū)域中，長度為2Mb，所編碼蛋白質(zhì)分子是NK細(xì)胞、γ δ T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活化性受體 NKG2D所識別的重要配體。目前已發(fā)現(xiàn)有7個MIC基因位點(diǎn)，僅MICA、MICB為功能基因，分別位于著絲粒461Λ和1401Λ位置處，靠近HLA-B位點(diǎn)三者高度連鎖不平衡。MICB基因具有廣泛的多態(tài)性，存在多個基因型。根據(jù)編碼MICB分子胞外區(qū)的外顯子2 5基因序列的差異，發(fā)現(xiàn)了 31個MICB等位基因。MICB基因編碼蛋白MICB分子作為NKG2D配體參與多種感染免疫的過程，大量研究表明MICB基因多態(tài)性與多種疾病的易感相關(guān)，同時也是導(dǎo)致移植排斥的重要因素。當(dāng)前MICB基因的分型尚無廣泛普及，且無相關(guān)的商品試劑。另一方面HLA分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多個領(lǐng)域，如HLA多態(tài)性的研究、HLA的生物學(xué)功能、器官和骨髓移植前供受者組織相容性配型、HLA與某些疾病的關(guān)聯(lián)、親子鑒定以及人類遺傳學(xué)等方面。HLA分型技術(shù)主要由血清學(xué)分型技術(shù)、細(xì)胞學(xué)分型技術(shù)、基因分型技術(shù)等。個體的HLA遺傳學(xué)差異的本質(zhì)在于編碼其抗原產(chǎn)物的基因上，所以分析個體HLA的基因型無疑是對HLA型別分析的最準(zhǔn)確的方法，其準(zhǔn)確性遠(yuǎn)高于血清學(xué)與細(xì)胞血分型。目前以DNA為基礎(chǔ)的HLA基因分型技術(shù)日趨成熟，并逐漸取代血清學(xué)方法和細(xì)胞血分型技術(shù)。 基因分型方法具有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)需要的血樣少，標(biāo)本可長期保存，相應(yīng)的分型試劑可大量制備，來源不受限制。特別重要的是基因分型精確可靠，重復(fù)性好，其分型錯誤率遠(yuǎn)低于血清學(xué)方法，基因分型技術(shù)已在實(shí)際工作中得到了廣泛的應(yīng)用。目前國際上標(biāo)注的HLA分型技術(shù)有PCR-SSP(序列特異引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))， PCR-SSO (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)寡核苷酸探針雜交)和PCR-SBT (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物直接測序分型)。PCR-SSO (sequence specific oligonucleotide) ik 禾爾 PCR-ASO(allele specific oligonuceotide)，用以同位素或非放射性標(biāo)記的探針與PCR擴(kuò)增的目標(biāo)片段產(chǎn)物雜交，根據(jù)陽性斑點(diǎn)判斷個體基因型。由于MICB等位基因非常多，就需要很多的探針對每個DNA樣品進(jìn)行多次雜交(甚至十幾次)才能完成定型分析操作也十分繁瑣，于是在此基礎(chǔ)上又發(fā)展起來一種反向雜交法(reverse hybridization) 0將各種不同的探針固定于同一張膜上，再將PCR產(chǎn)物標(biāo)記，以PCR產(chǎn)物(待檢測基因DNA)反過來與探針雜交。這樣一次雜交即可完成多個等位基因的分析。此方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、需樣本量少等優(yōu)點(diǎn)，但不同探針的雜交條件必須嚴(yán)格統(tǒng)一(如溫度、離子濃度)，容易出現(xiàn)誤差；不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級；對某些雜合子分辨率也不好。很多基因型含有相同的多態(tài)性，而僅僅由于排列方式的不同，因此分辨率不及SSP和SBT。此方法適宜大量和高純度樣本，雜交條帶將作為書面原始記錄長期保存(三種效果比較)。PCR-SSP =PCR-SSP方法用預(yù)先設(shè)計(jì)出一整套等位基因組特異性引物(sequence specific primer, SSP)，借助PCR技術(shù)獲得MICB型別特異的擴(kuò)增產(chǎn)物，可通過電泳直接分析帶型決定MICB型別，從而大大簡化了實(shí)驗(yàn)步驟。優(yōu)點(diǎn)是簡單易行，分辨率可從低到高，成本低。缺點(diǎn)是不易自動化；不能檢測新的等位基因，試劑盒需不斷升級。此方法適宜零散和純度低樣本，重復(fù)實(shí)驗(yàn)時要重提DNA和必須使用紫外凝膠成像儀保留原始資料，增加實(shí)驗(yàn)成本(三種效果比較)。PCR-SSP和PCR-SSO均需大量試劑(引物)，且不能識別新基因和假基因。針對目標(biāo)序列外顯子和內(nèi)含子序列精細(xì)設(shè)計(jì)引物可避免這些問題。PCR-SBT 以PCR擴(kuò)增所要分析的基因片段，然后對DNA序列進(jìn)行分析，可直接得到基因型。分辨率高，可大規(guī)模進(jìn)行，精確度高，能直接發(fā)現(xiàn)新的等位基因。因此，應(yīng)用SBT技術(shù)進(jìn)行高分辨率基因分型是目前國際上公認(rèn)的基因分型金標(biāo)準(zhǔn)。目前市面上尚無MICB基因分型試劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種MICB基因分型的PCR-SBT方法以及與該方法配套的試劑盒，填補(bǔ)MICB位點(diǎn)分型的空白，進(jìn)一步提高M(jìn)ICB分型技術(shù)的分辨率和精確性，同時降低實(shí)驗(yàn)的成本。為此，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案一種MICB基因分型的PCR-SBT方法，包括以下步驟(1)、提取待測基因組DNA，使用PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增所要分析的目的基因片段MICB 的2-5外顯子及之間的內(nèi)含子；所述的擴(kuò)增引物對為MICB-F和MICB-RMICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-R :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’ ；所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件依次為1)95 "C 5min ；2)重復(fù)以下19個循環(huán)940C 45s — 65°C 45s，每循環(huán)降低 0. 5°C— 72°C 2min ；3)重復(fù)以下13個循環(huán)940C 45s — 55°C 45s — 72°C 2min ；4) 72°C IOmin ；5)4°C 保持；所述PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，其組成如下濃度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 11. 49 μ 1 PCR緩沖液，(PCR緩沖液配制方法IOml PCR緩沖液含0. 8g氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化鎂，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8. 8 ；)1. 49 μ 1 5mM dNTP ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ上游引物 MICB-F ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ下游引物 MICB-R ；
0. 49 μ 1 10% 牛血清蛋白；5. 32μ 1蔗糖/甲酚紅染料；0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶；加雙蒸水補(bǔ)足體積；O)、使用測序引物對步驟⑴所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增出的各序列進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，從而確定基因分型結(jié)果；所述的用于測序分析的4條寡核苷酸測序引物；MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3，MICB-CR4 :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，。所述測序反應(yīng)體系為10 μ 1，其組成如下2 μ 1 PCR 產(chǎn)物；3 μ 1 Big Dye 測序緩沖液；1 μ 1 Big Dye 測序末端；0. 25 μ 1 10 μ M 的測序引物；(每次用 MICB-CFU MICB-CR2、MICB-CF3、MICB-CR4 中的一條)3. 75 μ 1 雙蒸水；所述測序擴(kuò)增反應(yīng)條件依次為1)重復(fù)以下對個循環(huán)96"C IOs — 50"C 5s — 60°C 4min ；2)4°C5min。上述的方法配套的試劑盒，包括擴(kuò)增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外顯子及之間的內(nèi)含子的引物MICB-F 5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3 ’MICB-R :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，；以及用于測序分析的4條引物MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3，MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3，MICB-CR4 :5，-GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，。上述技術(shù)方案中，所述引物方向均從5，到3，；MICB設(shè)計(jì)模板為MICB*001所有等位基因序列均參照歐洲IMGT/HLA專業(yè)網(wǎng)站數(shù)據(jù)庫http://WWW. ebi. ac. uk/imgt/hla/ index, html。本發(fā)明的基本原理是MICB的多態(tài)性復(fù)雜，MICB位點(diǎn)的等位基因位點(diǎn)31個，并且不斷有新的等位基因被發(fā)現(xiàn)，因此要在有限的保守區(qū)設(shè)計(jì)能擴(kuò)增MICB位點(diǎn)的2-5外顯子的 PCR引物，并分別針對不同的外顯子再設(shè)計(jì)測序引物。由于上述技術(shù)方案運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有下列優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明MICB基因測序試劑盒以及測試條件的優(yōu)化組合，其實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)體系是通過大量實(shí)驗(yàn)摸索獲得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有很好的穩(wěn)定性。能有效的擴(kuò)增MICB位點(diǎn)的2-5 外顯子及其內(nèi)含子的全長DNA片段，并對其進(jìn)行測序，提高了對MICB基因分型的分辨率和精確性。2.由于本發(fā)明MICB基因測序試劑盒中主要試劑自行配置并優(yōu)化，所用試劑均為常用的實(shí)驗(yàn)試劑，同時只用合成4條引物(因?yàn)镸ICB-CFl與MICB-F、MICB-CR4與MICB-R 序列相同可以通用)，并只進(jìn)行4次測序反應(yīng)就可以對樣本進(jìn)行高分辨的分型分析(最少可只對MICB-CR2與MICB-CFl進(jìn)行2次測序反應(yīng)，其基本涵蓋了所有多態(tài)位點(diǎn))，較當(dāng)前現(xiàn)有的技術(shù)(需要合成多對引物并進(jìn)行多次測序反應(yīng))大大降低了實(shí)驗(yàn)的成本。3.目前國內(nèi)外尚無針對MICB位點(diǎn)檢測的試劑盒，本發(fā)明具有創(chuàng)新性。4.本發(fā)明在測試過程中檢測的對象均為中國人群，經(jīng)試驗(yàn)證明本發(fā)明所述試劑盒進(jìn)行檢測的結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能適用于中國人群的檢驗(yàn)。


圖1是實(shí)施例1中MICB結(jié)構(gòu)圖上PCR擴(kuò)增引物，測序引物位置示意圖；圖2是實(shí)施例1中所得MICB2-5外顯子及其中的內(nèi)含子全長PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3是實(shí)施例1中MICB-CFl測序所得測序圖(涵蓋MICB位點(diǎn)的2_3外顯子全部多態(tài)位點(diǎn))；圖4是實(shí)施例1中MICB-CR4測序所得測序圖(涵蓋MICB位點(diǎn)的4_5外顯子全部多態(tài)位點(diǎn))。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述，而不會限制本發(fā)明。實(shí)施例1 采用核苷酸序列表所述PCR擴(kuò)增引物和測序引物(所述引物的位置如圖1所示)， 對人血樣進(jìn)行MICB位點(diǎn)的高分辨率基因分型，具體步驟如下(1)提取基因組DNA按照ftx)maga公司基因組DNA抽提試劑盒操作說明書進(jìn)行抽提。(2) PCR 擴(kuò)增使用MICB位點(diǎn)擴(kuò)增引物MICB-F和MICB-R進(jìn)行MICB分型的擴(kuò)增，上述擴(kuò)增過程和擴(kuò)增反應(yīng)體系如下所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為1. 95°C for 5min2. 94°C for 45s — 65°C for 45s (每循環(huán)降低 0. 5°C ) — 72°C for 2min (重復(fù) 19 個循環(huán))3. 94°C for 45s — 55°C for 45s — 72°C for 2min (重復(fù) 13 個循環(huán))4. 72 °C for IOmin5. 4°C 保持所述PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，其組成如下表濃度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 1
1. 49 μ 1 PCR緩沖液，(PCR緩沖液配制方法IOml PCR緩沖液含0. Sg氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化鎂，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8. 8 ；)1. 49 μ 1 5mM dNTP ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ上游引物 MICB-F ；0. 5μ 1 ΙΟμΜ下游引物 MICB-R ；0. 49 μ 1 10% 牛血清蛋白；5. 32μ 1蔗糖/甲酚紅染料；0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶；加雙蒸水補(bǔ)足體積；其中dNTPs、Taq DNA聚合酶均購自北京康維世紀(jì)生物科技有限公司，引物由深圳華大基因科技公司合成。擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物的電泳圖如圖2所示，結(jié)果表明得到目的基因片段(即MICB位點(diǎn)的2-5外顯子及其內(nèi)含子全長DNA片段)。按照常規(guī)技術(shù)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。(3)使用測序引物進(jìn)行測序擴(kuò)增。測序反應(yīng)采用的是不對稱PCR方法，與普通PCR方法不同，其目的主要是為測序制備ssDNA，反應(yīng)中只需添加一條特異性的測序引物，另一端是通用的BigDye末端。使用ABI 公司3730測序儀對步驟(2)中純化的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果如圖3至圖4，首先使用測序引物MICB-CF1、MICB-CR4分別進(jìn)行測序，測序結(jié)果涵蓋了 MICB位點(diǎn)的2-5外顯子所有多態(tài)位點(diǎn)。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，采用MICB-CR2是在MICB-CFl相反的方向上測一次， MICB-CF3是在MICB-CR4相反的方向上測一次，從而保證每個多態(tài)位點(diǎn)都被測定了 2次，達(dá)到每個多態(tài)位點(diǎn)準(zhǔn)確可靠的目的。上述測序擴(kuò)增過程和測序擴(kuò)增反應(yīng)體系如下所述測序反應(yīng)體系為10 μ 1，其組成如下表反應(yīng)體系2 μ 1 PCR 產(chǎn)物3μ 1 Big Dye Buffer(ABI)1 μ 1 Big Dye Terminator (ABI)0. 25 μ 1 測序引物(ΙΟμΜ)3. 75 μ 1 雙蒸水所述測序擴(kuò)增反應(yīng)條件為1. 960C for IOs — 50°C for 5s — 60°C for 4min (重復(fù) 24 個循環(huán))2. 4°C for 5min(4)進(jìn)行測序反應(yīng)。通過對圖3與圖4進(jìn)行分析，與IMGT/HLA數(shù)據(jù)庫比對表明此標(biāo)本的MICB位點(diǎn)基因型為雜合子MICB*00502-MICB*014，雜合位點(diǎn)在序列圖中呈雙峰嵌套樣圖形。實(shí)施例2，美國UCLA大學(xué)的國際質(zhì)控和中華骨髓庫質(zhì)控的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中華骨髓庫HLA質(zhì)控樣本基本上是選自中國人常見的等位基因組合，而用本發(fā)明試劑也未發(fā)現(xiàn)漏檢現(xiàn)象，與對照試劑結(jié)果完全一致。美國UCLA大學(xué)的HLA質(zhì)控樣本包括了世界范圍內(nèi)各人種的HLA等位基因組合，其結(jié)果也與對照試劑相符合。
權(quán)利要求
1. 一種MICB基因分型的PCR-SBT方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)、提取待測基因組DNA，使用PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增所要分析的目的基因片段MICB的 2-5外顯子及之間的內(nèi)含子；所述的擴(kuò)增引物對為MICB-F和MICB-R MICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’ MICB-R :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3，； 所述PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件依次為1)95 0C 5min ；2)重復(fù)以下19個循環(huán)940C 45s — 65°C 45s，每循環(huán)降低 0. 5°C— 72°C 2min ；3)重復(fù)以下13個循環(huán)940C 45s — 55°C 45s — 72°C 2min ；4)72 °C IOmin ；5)4°C保持；所述PCR反應(yīng)體系為20 μ 1，其組成如下 濃度 4ng/ μ 1 的 DNA 10 μ 11.49μ 1 PCR緩沖液，所述的PCR緩沖液配制方法10ml PCR緩沖液含0. 8g氨基丁三醇，0. 22g硫酸氨，0. 67ml IM氯化鎂，用鹽酸調(diào)節(jié)pH到8. 8 ；1.49 μ 1 5mM dNTP ； 0. 5μ 1 10 μ M 上游引物 MICB-F ； 0. 5μ 1 10 μ M 下游引物 MICB-R ； 0.49 μ 1 10%牛血清蛋白； 5. 32μ 1蔗糖/甲酚紅染料； 0. 12 μ 1 5U/ μ 1 TaqDNA 聚合酶； 加雙蒸水補(bǔ)足體積；O)、使用測序引物對步驟(1)所得PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增出的各序列進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，從而確定基因分型結(jié)果； 所述的用于測序分析的4條寡核苷酸測序引物； MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3， MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’ MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3， MICB-CR4 :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于 所述測序反應(yīng)體系為10 μ 1，其組成如下2 μ 1 PCR 產(chǎn)物； 3μ 1 Big Dye測序緩沖液； 1 μ 1 Big Dye測序末端； 0. 25 μ 1 10 μ M的測序引物；·3.75μ 1雙蒸水；所述測序擴(kuò)增反應(yīng)條件依次為1)重復(fù)以下M個循環(huán)960C IOs — 500C 5s — 60°C 4min ；2)4°C 5min。
3. —種權(quán)利要求1所述的方法配套的試劑盒，其特征在于，包括擴(kuò)增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外顯子及之間的內(nèi)含子的引物 MICB-F :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3’ MICB-R 5' -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3‘； 以及用于測序分析的4條引物 MICB-CFl :5’ -GGACAGCAGACCTGTGTGTTA-3， MICB-CR2 :5’ -CCCTGTGCTATGGATGCA-3’ MICB-CF3 :5’ -CAGGAGTCCACCCTTGACAT-3， MICB-CR4 :5’ -GGAGATGGGAAAGCTCCTTT-3’。
全文摘要
本發(fā)明提供一種MICB基因分型的PCR-SBT方法及試劑盒。對MICB基因位點(diǎn)2-5外顯子進(jìn)行基因分型，包括以下步驟(1)制備人類基因組DNA；(2)使用PCR擴(kuò)增引物擴(kuò)增所要分析的目的基因片段MICB的2-5外顯子及之間的內(nèi)含子；(3)使用測序引物對步驟(2)所得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，然后對擴(kuò)增出的產(chǎn)物進(jìn)行測序，并將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比較，從而確定基因分型結(jié)果；由于本發(fā)明MICB基因測序試劑盒以及測試條件的優(yōu)化組合，有效的擴(kuò)增MICB位點(diǎn)的2-5外顯子的全長和部分內(nèi)含子的寡聚核苷酸序列，并對相應(yīng)外顯子進(jìn)行測序，從而能夠精確的對其進(jìn)行分型。
文檔編號C12Q1/68GK102321749SQ201110229780
公開日2012年1月18日 申請日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者余平, 杜昆, 林琳, 羅奇志, 霍治, 龔拯 申請人:中南大學(xué)