專利名稱：實時熒光定量pcr檢測人接觸蛋白-1(cntn-1)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，通過將組織中的mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再通過實時熒光定量PCR精確的檢測人接觸蛋白-I (contactin-1, CNTN-1)基因的mRNA水平。
背景技術(shù)：
腫瘤嚴重威脅人類健康，早期診斷對提高患者的生存率和生活質(zhì)量有非常重要的意義。腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)，早期治療，可降低篩查人群癌癥死亡率，改善預后，提高生活質(zhì)量，減少放化療藥物的使用率，降低治療費用。然而腫瘤的早期診斷一直是一個沒有攻克的難題，因而發(fā)現(xiàn)合適的腫瘤標志并合理的應(yīng)用腫瘤標志進行早期診斷，具有重要現(xiàn)實意義。
腫瘤早期診斷是對患者的確認或?qū)o癥狀患者的及時診斷。常用的篩查方法有子宮頸癌的巴氏涂片，結(jié)直腸癌的隱血試驗，前列腺癌的肛指檢查，食道癌的拉網(wǎng)等，但這些檢查均不理想。計算機斷層掃描、超聲診斷、乳房攝影等檢測的最小極限為lcm(109細胞)直徑的腫瘤。而聚合酶鏈反應(yīng)可以檢測細胞數(shù)在IO7-IO8的實體瘤，將腫瘤的早期診斷提高了一個數(shù)量級。Real-time PCR,即實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法，它是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光物質(zhì)，并通過real-time PCR檢測系統(tǒng)對PCR反應(yīng)進程中的熒光信號強度進行實時監(jiān)測，最終對實驗數(shù)據(jù)進行分析處理的方法。由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。肺癌和食管癌是全球和我國死亡率較高的惡性腫瘤，也是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率高，預后較差。人接觸蛋白-I (contactin-1，CNTN-1)是一種神經(jīng)細胞黏附因子(NCAM)，參與了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。但是近年來發(fā)現(xiàn)人接觸蛋白-I能介導腫瘤轉(zhuǎn)移的分子，作為VEGF-C的下游效應(yīng)分子，可介導肺癌和食管癌等的腫瘤轉(zhuǎn)移和生長(Su JL,Yang PC,Shih JY, Yang CY, Wei LH, Hsieh CY, Chou CH, Jeng YM, Wang MY, Chang KJ, Hung MC,Kuo ML. The VEGF-C/FIt-4axis promotes invasion and metastasis of cancer cells.Cancer Cell, 2006,9 (3) :209-223 ；Liu P, Zhou J, Zhu H, Xie L, Wang F, Liu B, Shen ff,Ye WiXiang B，Zhu X,Shi R，Zhang S. VEGF-C promotes the development of esophagealcancer via regulating CNTN-1 express ion. Cytokine, 2011, 55 (I) :8-17)。人接角蟲蛋白-I在肺癌、食管癌細胞中呈高表達，并與肺癌、食管癌等患者預后有密切的關(guān)系。因而能靈敏、精確的檢測CNTN-I基因mRNA的表達對于判斷腫瘤患者的預后具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的試劑盒包含逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，不含RNA酶的水，Oligo (dT) 12，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，逆轉(zhuǎn)錄酶，MgCl2溶液，聚合酶反應(yīng)緩沖液，耐熱的Taq DNA聚合酶，檢測用上游、下游引物和陽性對照DNA。其中逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)溶液(250mM Tris-HCl (pH 8. 3), 375mMKCl,50mM DTT)，莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶，不含RNA酶的水，Oligo (dT) 12，dNTP混合物和RNA酶抑制劑。
聚合酶反應(yīng)體系含有聚合酶反應(yīng)緩沖液(20mM Tris-HCl)，MgCl2溶液(IOmM)，耐熱的Taq DNA聚合酶，dNTP混合物，檢測用上游、下游引物，逆轉(zhuǎn)錄的cDNA或陽性對照DNA溶液。檢測用上游引物序列為5’-GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’下游引物序列為5’-TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’陽性對照DNA序列為5，-AAGGAAAATCCACATCCTTGAGAAGTAAAACAGCCAAAGATCACAGAAGCATCAGAACCATGTCTTGAGCCCAAATATTCTCTGTTGCTAAAGTTATATAACTAGCTATTGACAGAACTAGAGGTGCACCCACCCTATCCCCAAGTCTTCTCGGCTTACTGCTGCCTGCCTTTGGCATCCTTGTCTACTTGGAATTCTGAATGTGTTGTGACAGCTGCTGTTCCCATCCCAGCTCAGAAGACACCTTCAACCCTGGGATGACCACAATTCCTTCCAATTTCTGCGGCTCCATCCTAAGCCAAATAAATTATACTTTAACAAACTATTCAACTGATTTACAACACACATGATGACTGAGGCATTCGGGAACCCCTTCATCCAAAAGAAT AACTTTTAAATGGATATAAATGATTTTTAACTCGTTCCAATATGCCTTATAAACCACTTAACCTGATTCTGTGACAGTTGCATGATTTAACCCAATGGGACAAGTTACAGTGTTCAATTCAATACTATAGGCTGTAGAGTGAAAGTCAAATCACCATATACAGGTGCTTTAAATTTAATAACAAGTTGTGAAATATAATAGAGATTGAAATGTTGG-3’每次實驗需要設(shè)置對照品，對照品分為陰性對照樣品和陽性對照樣品，陰性對照樣品不含有CNTN-I的mRNA ;陽性對照樣品為含有與CNTN-lcDNA序列一致的DNA。本試劑盒保存于-20°C至-80°C，盡量減少反復凍融。本發(fā)明是基于實時定量PCR技術(shù)檢測CNTN-I基因的mRNA水平，在引物設(shè)計上引物只與CNTN-I的編碼區(qū)匹配，與基因組中其他序列的一致性小于70%，并且引物跨一個外顯子，減少了 DNA的污染，提高了反應(yīng)的特異性。該方法經(jīng)多種腫瘤組織標本檢測表明該方法切實可行。由于本方法采用了 PCR技術(shù)，使得CNTN-I的檢測敏感性大大提高。本發(fā)明試劑盒的使用方法將本試劑盒從_20°C取出，自然融化。采用TRIzol法提取組織總RNA，以DNaseI消化RNA中殘留的基因組DNA.制備反轉(zhuǎn)錄體系配制16. 5μ I反應(yīng)體系，其中總RNA10μ l(lyg)，oligo(dT)122.5y 1，不含RNAse的水4μ I ;72°C水浴7分鐘；在上述反應(yīng)體系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶1μ 1，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液5μ l，dNTP2y 1，RNase抑制劑O. 5 μ I ;將總體系為25 μ I的樣品于水浴鍋或PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42°C，I小時；95°C，5分鐘；將反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA置于_20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩Ｃ看螌嶒炐枰O(shè)置對照實驗。將逆轉(zhuǎn)錄的cDNA與陰性對照和陽性對照一同進行real-time PCR反應(yīng)。陰性對照樣品不含有CNTN-I的mRNA ;陽性對照樣品為含有與CNTN-lcDNA序列一致的DNA。引物和DNA由生物公司合成。SYBR Green實時定量PCR檢測CNTN-I基因的表達配制10 μ I反應(yīng)體系，其中聚合酶反應(yīng)緩沖液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐熱的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各0.5 μ 1，上述逆轉(zhuǎn)得到的cDNAl μ 1，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反應(yīng)條件進行PCR擴增和熒光定量預變性，95°C，I分鐘；PCR擴增，40個循環(huán)，95°C，15秒，60°C，I分鐘；溶解曲線，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。


圖I為陰性對照的溶解曲線。圖2為肺癌/癌旁組織實時熒光定量PCR的溶解曲線。圖3為食管癌/正常食管組織實時熒光定量PCR的溶解曲線。
具體實施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和具體實施方式
作進一步說明。這些實施例僅用于說明本發(fā)明的目的，不用于限制本發(fā)明的范 圍。實施例I肺癌/癌旁組織中CNTN-I表達的檢測4例肺癌組織和對應(yīng)的4例癌旁組織,均取30mg,采用TriZol (Invitrogen)試劑抽提RNA，取2 μ g總RNA，在總體積25uL的體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。配制16. 5 μ I反應(yīng)體系，其中總 RNA 10μ l(lyg)，oligo (dT)122.5y I，不含 RNAse 的水 4 μ I ;72°C 水浴 7 分鐘；在上述反應(yīng)體系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液5 μ 1，dNTP2 μ 1，RNase 抑制劑 O. 5 μ I ;將總體系為 25 μ I 的樣品于 GeneAmp PCR Systems2700PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42°C，I小時；95°C，5分鐘；將反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩YBR Green實時定量PCR檢測CNTN-1基因的表達配制10 μ I反應(yīng)體系，其中聚合酶反應(yīng)緩沖液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐熱的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各O. 5 μ I，上述逆轉(zhuǎn)得到的cDNA I μ I，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反應(yīng)條件進行PCR擴增和熒光定量預變性，95°C，I分鐘；PCR擴增，40個循環(huán)，95°C，15秒，60°C，I分鐘；溶解曲線，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。Real-Time PCR反應(yīng)后溶解曲線顯示陰性對照樣品無擴增峰(圖I);腫瘤組織和癌旁組織樣品溶解曲線均僅有單峰，表明擴增產(chǎn)物單一(圖2)，上述樣品的Ct值分別為腫瘤組織樣品ICt值27. 3687癌旁組織樣品ICt值32. 7064腫瘤組織樣品2Ct值22. 2871癌旁組織樣品2Ct值33. 9008腫瘤組織樣品3Ct值26. 4216癌旁組織樣品3Ct值35. 9829腫瘤組織樣品4Ct值2L 7865癌旁組織樣品4Ct值31. 0657腫瘤組織中CNTN-I的mRNA表達顯著高于對應(yīng)的癌旁組織。實施例2正常食管/食管癌組織標本中CNTN-I表達的的檢測8例食管癌組織和2例正常食管上皮組織，均取30mg，采用TriZol (Invitrogen)試劑抽提RNA，取2 μ g總RNA，在總體積25uL的體系中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。TRIzol法提取組織總RNA，以DNase I消化RNA中殘留的基因組DNA.制備反轉(zhuǎn)錄體系配制16. 5 μ I反應(yīng)體系，其中總 RNA 10μ 1(1μ g), oligo(dT)122. 5μ 1，不含 RNAse 的水 4 μ I ;72°C水浴 7 分鐘；在上述反應(yīng)體系中加入莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶I μ 1，逆轉(zhuǎn)錄緩沖液5 μ 1，dNTP2 μ 1，RNase 抑制劑 O. 5 μ I ;將總體系為 25 μ I 的樣品于 GeneAmp PCR Systems2700PCR儀進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為42°C，1小時；95°C，5分鐘；將反轉(zhuǎn)錄制備的cDNA置于-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。SYBR Green實時定量PCR檢測CNTN-1基因的表達配制10 μ I反應(yīng)體系，其中聚合酶反應(yīng)緩沖液3 μ I,MgCl2溶液(IOmM) I μ 1，耐熱的Taq DNA聚合酶2 μ 1，上游和下游引物(10 μ Μ)各O. 5 μ I，上述逆轉(zhuǎn)得到的cDNA I μ I，不含RNAse的水3 μ I。按如下的反應(yīng)條件進行PCR擴增和熒光定量預變性，95°C，I分鐘；PCR擴增，40個循環(huán)，95°C，15秒，60°C，I分鐘；溶解曲線，95°C，15秒，60°C，15秒，95°C，15秒。Real-Time PCR運行后所以樣品溶解曲線均僅有單峰，表明擴增產(chǎn)物單一(圖2)，上述樣品的Ct值分別為腫瘤樣品ICt 值 23. 8928
腫瘤樣品2Ct 值 23. 8587腫瘤樣品3Ct 值 23. 0513腫瘤樣品4Ct 值 27. 8186腫瘤樣品5Ct 值 24. 1022腫瘤樣品6Ct 值 23. 7204腫瘤樣品7Ct 值 22. 7273腫瘤樣品8Ct 值 25. 9116正常食管組織樣品ICt值34. 6233正常食管組織樣品2Ct值35. 2279食管癌組織中CNTN-I的mRNA表達高于正常食管組織。
權(quán)利要求
1.實時熒光定量PCR檢測人接觸蛋白-l(c0ntactin-l，CNTN-1)的試劑盒，其特征是含有逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液，不含RNA酶的水，Oligo (dT)12，dNTP混合物，RNA酶抑制劑，MgCl2溶液，聚合酶反應(yīng)緩沖液，耐熱的Taq DNA聚合酶，檢測用上游、下游引物和陽性對照DNA。
其中逆轉(zhuǎn)錄酶溶液含有終濃度250mM Tris-HCl (pH 8. 3), 375mM KCl和50mM DTT ’聚合酶反應(yīng)緩沖液含有20mM Tris-HCl ；10mM MgCl2溶液；逆轉(zhuǎn)錄酶為莫洛尼氏鼠白血病病毒(M-MLV)逆轉(zhuǎn)錄酶； 檢測用上游引物序列為5’ -GAGCCCAAATATTCTCTGTTGC-3’ ； 下游引物序列為5’ -TGCCTCAGTCATCATGTGTGT-3’ ； 陽性對照DNA序列為
全文摘要
本發(fā)明為一種實時熒光定量RT-PCR檢測人細胞接觸蛋白-1(contactin-1，CNTN-1)試劑盒，該試劑盒通過逆轉(zhuǎn)錄mRNA樣品得到cDNA，再結(jié)合實時熒光定量PCR檢測技術(shù)，可以精確定量檢測標本中CNTN-1的mRNA表達量。該試劑盒可以用于臨床及科研中檢測患者的組織標本中CNTN-1的表達，用以輔助診斷、指導治療及提示預后。
文檔編號C12Q1/68GK102925542SQ20111023010
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月12日
發(fā)明者劉鵬飛, 項斌, 劉兵團, 沈衛(wèi)東, 王芳軍 申請人:江陰市人民醫(yī)院