專利名稱：一種刺參致病菌的分離和鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種刺參致病菌分離和鑒定的方法，屬微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于刺參養(yǎng)殖的過速發(fā)展和不規(guī)范運(yùn)作造成了病害問題日趨突出，出現(xiàn)了多種明顯病癥和大規(guī)模死亡現(xiàn)象，其中，越冬保苗期和養(yǎng)成期出現(xiàn)的“腐皮綜合征”是目前刺參養(yǎng)殖中危害最為嚴(yán)重的疾病。給廣大刺參養(yǎng)殖業(yè)者造成了慘重的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重制約了該產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展。為保證刺參養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展，積極開展“腐皮綜合征”流行病學(xué)及病原學(xué)研究是對(duì)疾病進(jìn)行綜合防治必不可少的基礎(chǔ)性工作。“腐皮綜合征”是當(dāng)前刺參養(yǎng)殖中最常見、危害最為嚴(yán)重的疾病，該病發(fā)生率可達(dá) 80%，遍及各養(yǎng)殖區(qū)域；傳染性強(qiáng)，許多養(yǎng)殖單位的死亡率高達(dá)90%以上。越冬保苗期幼參和養(yǎng)成期海參均可被感染發(fā)病，每年的12 3月份養(yǎng)殖水體溫度較低時(shí)(8°C以下)為發(fā)病高峰，在溫度較高的夏秋季節(jié)也有發(fā)生。主要癥狀從初期感染的口部腫脹、吐腸、收縮僵直， 到后期感染的體表大面積潰瘍，最后導(dǎo)致刺參死亡。病原排查發(fā)現(xiàn)該病主要是由細(xì)菌引起的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，分離鑒定細(xì)菌快速、準(zhǔn)確、污染率低、純度高、菌株變異極小，保持了病原菌野生型的特性。過程簡(jiǎn)單、成本低，可大量獲得刺參致病菌，以滿足刺參疾病的早期診斷、預(yù)防和治療。本發(fā)明的技術(shù)方案如下A、標(biāo)樣選擇選取刺參腐皮組織，在發(fā)病處切取IcmX IcmX Icm組織樣品；B、組織樣品消毒將組織樣品經(jīng)用75%酒精消毒60-90秒后，用滅菌海水沖洗，再用無菌PBS沖洗2-4次，組織勻漿，劃線于固體瓊脂培養(yǎng)基；C、細(xì)菌的獲得將培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落再次采用平板劃線分離法進(jìn)行分離， M-28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色細(xì)菌培養(yǎng)性狀，挑選單菌落，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)保存；D、刺參腐皮綜合癥致病菌的篩選將獲得的純培養(yǎng)細(xì)菌接種到TCBS選擇性培養(yǎng)基上，24- °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后觀察，篩選半透明、淡黃色的單個(gè)菌落；E、刺參回接感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選菌落的致病性，分別通過浸泡和體腔注射實(shí)驗(yàn)來觀察細(xì)菌致病性；F、掃描電鏡觀察致病菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；G、通過16s rDNA PCR分子生物學(xué)方法對(duì)致病性單菌落進(jìn)行鑒定。


圖1是患病刺參圖。
圖2是TCBS培養(yǎng)皿上的單菌落圖。圖3是單個(gè)細(xì)菌掃描電鏡圖。圖4是病原菌分子生物學(xué)鑒定的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、病灶處優(yōu)勢(shì)菌的分離純化取患有腐皮綜合癥的刺參樣品(見圖1)于超凈工作臺(tái)中切取IcmX IcmX Icm大小的組織塊，放于5mL無菌離心管中，用消毒過的眼科剪刀勻漿制成菌懸液。劃線于固體瓊脂培養(yǎng)基，M_28°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72后，將培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落再次采用特異性TCBS平板劃線分離法進(jìn)行分離，2448°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72后觀察，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色細(xì)菌培養(yǎng)性狀，挑選單菌落，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)保存。結(jié)果菌落呈煎蛋形狀，扁平，直徑約為3 5mm，表面凸起，為玉米黃色，不透明， 無氣味，不易挑起菌體，菌落光滑且有粘性。(見圖1)實(shí)施例2、菌種保藏將上述方法制得的純病原菌培養(yǎng)于平板上的單菌落直接接種于2216E固體斜面上，放置于培養(yǎng)箱中下培養(yǎng)Mh，然后于4°C的冰箱中保存；長(zhǎng)期保藏將菌體放入2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)約5 6個(gè)小時(shí)，菌體濃度達(dá)到對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)期0D_ = 0. 2時(shí)，加入甘油，將甘油體積濃度調(diào)整為30 50%左右，-80°C 冰箱保存即可。實(shí)施例3、致病菌的人工回接感染實(shí)驗(yàn)(1)實(shí)驗(yàn)前的準(zhǔn)備將容積約SOOOmL的塑料盆用洗滌劑清洗后用75%酒精擦拭消毒，待酒精揮發(fā)后用過濾滅菌PBS沖洗三遍。向每只盆中分別注入5000mL海水，并用充氣閥通氣，海水溫度維持在18 25°C。(2)刺參的前處理將從養(yǎng)殖場(chǎng)取回的刺參先在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中用過濾滅菌海水馴養(yǎng)7天，挑選大小相近，健康的個(gè)體，用滅菌PBS沖洗2次，每個(gè)盆中投放10頭。(3)菌懸液的制備將分離到優(yōu)勢(shì)菌株劃平板，下培養(yǎng)48h，用過濾滅菌PBS將菌落沖洗下制成菌懸液約20mL。取ImL菌懸液，梯度稀釋后用分光光度計(jì)計(jì)數(shù)。(4)人工回接感染實(shí)驗(yàn)①浸浴法實(shí)驗(yàn)設(shè)4組，每組投入50頭養(yǎng)殖刺參。實(shí)驗(yàn)組采用浸浴法攻毒，向編號(hào)不同的盆中分別注入不同體積的菌懸液，使其終濃度分別為IO4CFU HilAlO3CFUmlAlO2CFU πι Λ對(duì)照組中加入與最大注入量相同體積的制備菌懸液所用的過濾滅菌PBS。每天觀察各盆中刺參的發(fā)病及死亡狀況，第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，注意觀察刺參形態(tài)變化并拍照記錄。②腹腔注射法實(shí)驗(yàn)設(shè)6組，每組投入10頭養(yǎng)殖刺參。實(shí)驗(yàn)組菌懸液用Iml無菌注射器經(jīng)腹腔注射對(duì)刺參進(jìn)行感染，每頭注射量在0. 5ml，使其菌懸液濃度依次為103、104、105、106、107CFU ml—1，對(duì)照組注射等量的無菌PBS。注射感染開始后，每天做好記錄，第7天實(shí)驗(yàn)結(jié)束，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，注意觀察刺參形態(tài)變化并拍照記錄。
結(jié)果表1浸浴法回接感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1. 一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，其特征在于如下步驟A、標(biāo)樣選擇選取刺參腐皮組織，在發(fā)病處切取IcmXIcmX Icm組織樣品；B、組織樣品消毒將組織樣品經(jīng)用75%酒精消毒60-90秒后，用滅菌海水沖洗，再用無菌PBS沖洗2-4次，組織勻漿，劃線于固體瓊脂培養(yǎng)基；C、細(xì)菌的獲得將培養(yǎng)皿上長(zhǎng)出的菌落再次采用平板劃線分離法進(jìn)行分離，2418°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-7 后，挑選單菌落，然后將細(xì)菌純培養(yǎng)保存；D、刺參腐皮綜合癥致病菌的篩選將獲得的純培養(yǎng)細(xì)菌接種到TCBS選擇性培養(yǎng)基上， 24-28 °C培養(yǎng)48-7 后，篩選半透明、淡黃色的單個(gè)菌落；E、刺參回接感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證篩選菌落的致病性，分別通過浸泡和體腔注射實(shí)驗(yàn)來觀察細(xì)菌致病性；F、掃描電鏡觀察致病菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；G、通過16srDNA PCR分子生物學(xué)方法對(duì)致病性單菌落進(jìn)行鑒定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，其特征在于將含有目標(biāo)病致病菌的刺參組織，經(jīng)用75％酒精消毒60-90秒后，用無菌海水沖洗，將病灶組織勻漿，滴加無菌PBS緩沖液，用接種環(huán)沾取含菌液劃線于適于刺參腐皮綜合癥病原菌生長(zhǎng)的瓊脂培養(yǎng)基上，24-28℃培養(yǎng)，再通過特異性TCBS培養(yǎng)基純化篩選單個(gè)菌落，即可得到相應(yīng)的目標(biāo)細(xì)菌，通過刺參回接感染動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證分離得到細(xì)菌的致病性以及掃描電鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步采用16srDNA PCR技術(shù)來鑒定分離的致病菌。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、方法易行、能快速有效的篩選出刺參腐皮綜合癥的病原菌，同時(shí)為其他水產(chǎn)動(dòng)物病害致病菌的快速篩選提供了思路。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102296038SQ20111023034
公開日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月11日
發(fā)明者徐永平, 李曉宇, 譚德猛, 金禮吉 申請(qǐng)人:大連理工大學(xué)